CN101353633A - Lactobacillus plantarum ZJ316、产生的抗菌肽及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株从婴儿粪便中分离到的植物乳杆菌——Lactobacillus plantarum ZJ316，以及由其发酵产生的抗菌肽--植物乳杆菌素ZJ316(plantaricin ZJ316)及其制备与应用；plantaricin ZJ316为一新发现的高效的小分子量乳酸菌抗菌肽，该抗菌肽具有广谱的抑菌作用，由于分子量小，很难横跨脂双分子层而形成小孔的复合体而有别于nisin的作用模式，但其同样具有高效的杀菌能力，是一个具有很高的应用开发潜力的lantibiotic类抗菌肽，可应用于制备饲料添加剂、食品防腐剂、抗生素的替代药物等等。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株新的植物乳杆菌菌株——Lactobacillus plantarumZJ316，以及由其发酵产生的抗菌肽——植物乳杆菌素ZJ316(plantaricinZJ316)及其制备与应用。
(二)背景技术
1928年Alexander Fleming的青霉素的发现挽救了成千上万人的生命。但近年抗生素抗性问题日益严重，给人们的生命健康带来新的危险。研究和开发新的抗生素变得非常紧迫。研究人员正努力寻找合适的抗菌肽来代替抗生素。乳酸菌是目前FDA认定的安全的食品级的微生物(GRAS)，乳酸菌抗菌肽将作为天然安全的食品保存剂和医药制品来研究和开发。乳酸菌抗菌肽以其独特的抗菌作用和潜在的应用价值一直受到国内外研究人员的青睐。到目前为止，已在8个不同属的乳酸菌中发现了多种抗菌肽。
一些分离纯化乳酸菌抗菌肽包括nisin(Rayman et al.，1981)、lactococcin(Dufour et al.，1991)、lacticin 481(Piard et al，1992)、lactococcinA和G(Holo et al，1991；Nissen-Meyer et al，1992)、acidocin LF221A和B(Majhenic et al，2004)、plantaricin TF711(Hernandez et al，2005)、plantaricinA(Zhao et al，2006)、lacticin Q(Fujita et al，2007)等的生化遗传特性及作用机制相继揭示。我国乳酸菌资源非常丰富，但对乳酸菌抗菌肽的研究起步较晚，相应的基础研究知识还有待积累。当前，十分必要加快抗菌肽的研究工作，为开发新型天然安全的抗菌肽打下基础。
nisin是目前唯一广泛使用的乳酸菌抗菌肽，但现在发现反刍动物的肠道菌能降解nisin而对nisin高度容忍。Russell研究小组从链球菌(Streptococcus bovis strain HC5)分离到抗菌肽bovicin HC5，对nisin抗性菌有很强的抗性(Mantovani et al，2002)。
最近的研究发现一些新分离的分子量更小的lantibiotics类乳酸菌抗菌肽对抗生素有抗性的微生物如MRSA(methicillin-resistantStaphylococcus aureus)和万古霉素抗性菌VRE(vancomycin-resistantEnterococcus)有抑制作用，显示了其在食品防腐和生物抗炎方面的应用潜力(Galvin et al.，1999)。lantibiotics类抗菌肽被认为是最具潜力的乳酸菌抗菌肽之一。成熟lantibiotics分子中包含了多个由羊毛硫氨酸(Lan)或β-甲基羊毛硫氨酸(MeLan)残基形成的硫醚键型的分子内环，该结构的完整性对抗菌肽的抗菌活性至关重要(Klaenhammer et al.，1993；Nes etal.，1996)。
对新发现的乳酸菌抗菌肽结构和作用机制的研究，将成为该类研究的重点。研究表明，细菌细胞壁的先导物lipid II是plantaricin C(一类lantibiotics)的活性靶点，这已在体外的细胞壁生物合成实验中证明(Wiedemann et al.，2006)。plantaricin C牢固地束缚lipid II从而干扰其合成细胞壁。最近，Hasper在Science报告了lantibiotic家族杀死革兰氏阳性菌的一个新的机制：从细胞隔膜移去lipid II而阻断细胞壁的合成(Hasper et al.，2006)。这些研究结果的取得，为应用开发新的候选抗生素打下扎实的基础。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种可发酵生产抗菌肽的新菌株——Lactobacillusplantarum ZJ316，以及由其发酵产生的抗菌肽——植物乳杆菌素ZJ316(plantaricin ZJ316)及其制备与应用。
本发明采用的技术方案是：
Lactobacillus plantarum ZJ316，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC No：M 208077，保藏日期2008年5月23日。
菌种来源：所述的Lactobacillus plantarum ZJ316，来源于婴儿粪便，分离出Lactobacillus plantarum ZJ316的方法是：用无菌镊子夹取少许婴儿粪便(由浙江大学儿童医院提供)培养在MRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱中增菌培养24小时。再取增菌液一滴于MRS固体培养基的平皿中，涂布均匀，在37℃厌氧培养箱中培养48小时。取样品进行平板分区划线，在37℃厌氧培养箱中培养24小时，挑取单菌落。
Lactobacillus plantarum ZJ316的生长特性：Lactobacillus plantarumZJ316为厌氧菌，菌落乳白色、表面光滑，最适生长温度是37℃，生长速度较快，48小时以后长出全缘、圆形、凸起、乳白色的菌落；在液体培养基内，该细菌在液体中底部生长，形成扩散的、乳白色的浊状菌体。能在MRS培养基和APT培养生长。
Lactobacillus plantarum ZJ316的形态：革兰氏阳性，菌体细长形，单个或短链状排列。在MRS液体培养基中，细菌革兰染色呈短杆状。如图1所示。
Lactobacillus plantarum ZJ316的生化特性：采用微量鉴定管及相应的化学方法来进行生化特性鉴定。乳酸菌L.plantarum ZJ316经过淀粉水解、油脂水解、明胶水解和尿素试验后，反应均为阴性。该乳酸菌在代谢过程中不能够分泌产生淀粉酶、脂肪酶、明胶酶和尿素酶来降解大分子物质，如淀粉、脂肪和明胶等。乳酸菌L.plantarum ZJ316在经过吲哚试验、M.R试验、V.P试验和硫化氢试验之后，反应也均呈阴性，而糖发酵试验则大多数呈阳性。见表1，此结果基本符合乳杆菌的理化特性。
Lactobacillus plantarum ZJ316的16S rRNA特性：用细菌的16SrRNA的序列可比较精确地鉴定细菌的属和种。将Lactobacillus plantarumZJ316的16S rRNA的PCR产物的序列与基因库NCBI中的16S rRNA序列比对，发现与Lactobacillus plantarum WCFS1有99％的同源性，但不完全相同，Lactobacillus plantarum WCFS1不产抗菌肽。
Lactobacillus plantarum ZJ316的功能：该植物乳杆菌能产抗菌物质，经生化特性如温度的稳定性、对pH的耐受性以及对酶的敏感性。该抗菌物质为一类耐高温的抗菌肽，命名为plantaricin ZJ316。
本发明还涉及由所述Lactobacillus plantarum ZJ316发酵产生的抗菌肽——植物乳杆菌素ZJ316(plantaricin ZJ316)，分子量为2366Da，N端序列为SLPQN。实验结果发现该抗菌肽具有以下特点：(1)具有良好的热稳定性，即使在121℃下处理30min仍具有较好的抑菌活性；(2)只有在酸性条件(pH＜4)下，才具有抑菌活性；(3)对胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K以及溶菌酶均敏感，但对过氧化氢酶敏感性较弱。
采用双层琼脂牛津杯法对抗菌肽plantaricin ZJ316进行抑菌谱测定。结果显示该抗菌肽对26个指示菌中的18个菌株有抑制作用，见表2，该抗菌肽对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特氏菌等具有强抑制作用。其中大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌均属革兰氏阴性菌。大部分乳酸菌源的抗菌肽只对革兰氏阳性菌有抑菌作用，只有少数抗菌肽对部分革兰氏阴性菌有抑制作用。本发明发现的该植物乳杆菌素不仅对革兰氏阳性菌有抑制作用，而且对很多革兰氏阴性菌也有抑制作用，具有广谱的抗菌性。plantaricin ZJ316与目前报道的乳酸菌产生的抗菌肽相比，具有明显的差异，该抗菌肽具有抑菌谱广和热稳定性高(在121℃下处理30min仍具有很好的抑菌活性)等特性。
抗菌肽plantaricin ZJ316的分子量及N端序列测定。采用质谱MALDI-TOF-MS精确测定该抗菌肽分子量为2366Da，为一小分子量的肽，而nisin的分子量3510Da；经N端序列分析，结果显示该细菌素N端含有以下5个氨基酸——S(丝氨酸)、L(亮氨酸)、P(脯氨酸)、Q(谷氨酰胺)、N(天冬氨酸)。随后N端成环封闭，由于成环封闭，测序较为困难，一时难以测出全部的氨基酸序列，只能根据分子量(2366Da)推测该抗菌肽含大约22个氨基酸残基，这表明该抗菌肽为翻译后修饰肽，很有可能是一类新的lantibiotics。而成熟lantibiotics分子中包含羊毛硫氨酸(Lan)和β-甲基羊毛硫氨酸(MeLan)残基。与蛋白质数据库的序列比对，该抗菌肽尚未被鉴定发布，plantaricin ZJ316为一新发现的小分子量乳酸菌抗菌肽。
本发明还涉及所述的抗菌肽的制备方法，所述方法包括：Lactobacillusplantarum ZJ316接种至适用于乳杆菌的培养基中，35～38℃下发酵培养18～24h，得到发酵液离心，取上清，分离纯化得到所述的抗菌肽ZJ316。
所述适用于乳杆菌的培养基可选用本领域常见用于乳杆菌培养的培养基，本发明中优选为MRS培养基，所述乳杆菌可先用MRS固体培养基划线培养得到单菌落，再用MRS液体培养基进行发酵培养。每1000mLMRS液体培养基可按如下组成配制：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物6g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三胺2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，七水硫酸镁0.2g，四水硫酸锰0.05g，吐温1mL，pH6.2～6.4，去离子水补足至1000mL。MRS固体培养基为MRS液体培养基添加琼脂得到，琼脂添加量为每1升MRS液体培养基添加15～20g琼脂。
所述分离纯化方法可按本领域常规纯化蛋白质的方法进行，本发明中抗菌肽分离纯化方法如下：硫酸铵梯度沉淀(硫酸铵由饱和度45％升至60％)，收集沉淀，水溶，超滤浓缩，采用Sephacryl S-100HR填料柱在Purifier 100蛋白质纯化系统上进行凝胶过滤，收集有抑菌活性的组分，得到所述抗菌肽。
plantaricin ZJ316为一新发现的高效的乳酸菌抗菌肽，由于分子量小，很难横跨脂双分子层而形成小孔的复合体而有别于nisin的作用模式，但其同样具有高效的杀菌能力，可以用做新型抗菌肽作用模式的研究。
所述抗菌肽可用于制备饲料添加剂，抗菌肽不仅具有与抗生素饲料添加剂相似的有益作用，而且无毒、无副作用、无残留、无抗药性，同时也不污染环境。抗菌肽在饲料中的应用主要有两个方面的作用：(1)防止饲料本身被沙门氏菌等致病菌污染；(2)作为饲料添加剂，防止致病菌对动物肠道的危害。Lactobacillus plantarum ZJ316是动物肠道中的益生菌，其产生的抗菌肽可以对宿主动物胃肠道进行生态调节。
所述抗菌肽还可用于制备食品防腐剂，经长期的研究发现一些合成防腐剂有诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题。目前在食品保藏中，使用的主要还是添加化学防腐剂。Nisin是目前在食品行业得到应用天然防腐剂。plantaricin ZJ316是一类小分子的热稳定多肽，适合用作为广谱、高效、稳定、安全的天然食品防腐剂的开发。
所述抗菌肽还可应用于制备抗生素的替代药物，近年来广谱抗生素的过量服用和随之而来的抗生素耐药性的发现，逐渐引起了人们的担忧，许多腐败菌逐渐产生了对抗生素的抵抗性，由此对将来如何控制这些菌有很大的顾虑。由于抗菌肽是一类蛋白类物质，可以被蛋白酶所降解，因此具有较高的安全性。目前乳酸菌抗菌肽是被普遍认为抗生素最有效的替代物。因此plantaricin ZJ316可作为抗生素的替代药物来预防、治疗疾病。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种从婴儿粪便中分离到的植物乳杆菌——Lactobacillus plantarum ZJ316，能产抗菌肽(plantaricinZJ316)，plantaricin ZJ316为一新发现的高效的小分子量乳酸菌抗菌肽，该抗菌肽具有广谱的抑菌作用，由于分子量小，很难横跨脂双分子层而形成小孔的复合体而有别于nisin的作用模式，但其同样具有高效的杀菌能力，是一个具有很高的应用开发潜力的lantibiotic类抗菌肽，可应用于制备饲料添加剂、食品防腐剂、抗生素的替代药物等等。
(四)附图说明
图1为分离提取到的Lactobacillus plantarum ZJ316经过扩增后用革兰氏染液染色结果图；
图2为pH值对抗菌肽plantaricin ZJ316抑菌活性的影响；
图3为温度对该抗菌肽plantaricin ZJ316抑菌活性的影响；
图4为不同酶对抗菌肽plantaricin ZJ316抑菌活性的影响；S：原上清液；C1：过氧化氢酶处理；C2：蛋白酶K处理；C3：胰蛋白酶处理；C4：溶菌酶处理；C5：胃蛋白酶处理。
图5为超滤浓缩液经蛋白质纯化仪分离纯化plantaricin ZJ316(流动相：水)；
图6为蛋白纯化物各组分的抑菌活性试验；
图7为蛋白纯化物活性组分的HPLC分析；
图8为抗菌肽plantaricin ZJ316质谱图；
图9为N端氨基酸序列分析。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：Lactobacillus plantarum ZJ316的分离
用无菌镊子夹取少许婴儿粪便(由浙江大学儿童医院提供)培养在MRS液体培养基(按如下配方配制：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物6g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三胺2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，七水硫酸镁0.2g，四水硫酸锰0.05g，吐温1mL，pH6.3，去离子水补足至1000mL)中，在37℃恒温培养箱中增菌培养24小时。再取增菌液一滴于MRS固体培养基(取前述1000mL MRS液体培养基加入18g琼脂)的平皿中，涂布均匀，在37℃厌氧培养箱中培养48小时。取样品进行平板分区划线，在37℃厌氧培养箱中培养24小时，挑取单菌落。
Lactobacillus plantarum ZJ316的鉴定：
(1)用革兰氏染色：将经过扩增后细菌Lactobacillus plantarum ZJ316用革兰氏染液染色，呈革兰氏阳性(染色结果见图1)。
(2)微量鉴定管及相应的化学方法来进行生化特性鉴定，结果见表1，结果表明Lactobacillus plantarum ZJ316具有乳杆菌的理化特性，但与所知的乳杆菌属中的菌种均有不同，这说明Lactobacillus plantarum ZJ316为一种新的菌种。
表1：经典微生物生化检验分析L.plantarum ZJ316结果
(-表示阴性；+表示阳性)
| 试验项目 | 鉴定结果(培养24h) | 鉴定结果(培养48h) |
| 阿拉伯糖 | + | + |
| 纤维二糖 | + | + |
| 乳糖 | + | + |
| 蔗糖 | + | + |
| 葡萄糖 | + | + |
| 木糖 | + | + |
| 蕈糖 | + | + |
| 甘露糖 | + | + |
| 棉子糖 | - | - |
| 甘露醇 | 颜色变浅 | + |
| 七叶苷 | - | - |
| 淀粉 | - | - |
| 油脂 | - | - |
| 明胶 | - | - |
| 尿素 | - | - |
| 硫化氢 | - | - |
| M.R | - | - |
| V.P | - | - |
| 吲哚 | - | - |
| 蛋白胨水 | - | - |
(3)Lactobacillus plantarum ZJ316的16S rRNA测序：
取实施例1中Lactobacillus plantarum ZJ316，提取DNA，用PCR法检测其中的16S rRNA。引物序列如下，(正向引物：5′-ATC ATG ATT TACATT TGA GTG-3′反向引物：5′-CGA CGA CCATGAACC ACC TGT-3′)。PCR条件：95℃下变性4min，95℃下变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，72℃延伸10min，最后4℃∞(35次循环结束后保持温度在4℃)。然后用琼脂糖凝胶电泳分析950bp左右的16S rRNA的PCR产物，并对此PCR产物进行测序。
测得Lactobacillus plantarum ZJ316的16S rRNA的部分核苷酸序列如下：
CTAGTACGTCTATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTC
TTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTC
AATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGC
GTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTT
ACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTC
AGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATC
TACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTT
CCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTA
AAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACC
TACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATAC
CGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTT
ACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCC
ATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGT
CCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGC
CGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCG
AAGCCATCTTTCAAACTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCAT
CTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTCCCACGTTATCATAGAG
Lactobacillus plantarum ZJ316的16S rRNA片断，与乳杆菌属中的一些细菌有高度同源性，但不完全相同，也说明Lactobacillus plantarumZJ316为一种新的菌种。
实施例2：Lactobacillus plantarum ZJ316发酵制备抗菌肽plantaricin ZJ316MRS液体培养基配制：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物6g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三胺2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，七水硫酸镁0.2g，四水硫酸锰0.05g，吐温1mL，前述混合物溶于960mL去离子水中，用1mol/L NaOH调节pH至6.4，加去离子水至总体积1L，高压下蒸汽灭菌20min。
MRS固体培养基配制：取1升前述配制的MRS液体培养基，加热搅拌下加15g琼脂粉，冷凝得MRS固体培养基。
培养条件：从-20℃取出保存的Lactobacillus plantarum ZJ316菌株，于MRS固体培养基上划线接种，37℃厌氧培养24h。挑单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h，发酵产物离心，取上清用于后续抗菌肽的分离及鉴定。
实施例3：Lactobacillus plantarum ZJ316中抗菌肽plantaricin ZJ316的分离及功能鉴定
1、对pH的耐受性
用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH调节发酵上清液pH为：1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，做牛津杯实验，以藤黄微球菌为指示菌，以1mol/L的HCl做对照，观察抑菌圈大小的变化。经试验，对照1mol/L的HCl对指示菌并没有抑制作用。由此证明，具有抑菌作用的是该植物乳杆菌素plantaricion ZJ316，且在酸性环境中才具有抑菌活性，在pH＞4的条件下即失活；且酸性越高，活性越强(图2)。
2、对温度的稳定性
将发酵上清液分别在-20℃、4℃、37℃、60℃、90℃、100℃、121℃下处理30min，调节pH至3.0，做牛津杯实验，以藤黄微球菌为指示菌，观察抑菌圈大小的变化。温度对细菌素plantaricin ZJ316的活性基本无影响，甚至在121℃条件下处理30min仍具有明显的抑菌活性(图3)。
3、对酶的敏感性
(1)酶的种类：过氧化氢酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶k、溶菌酶
(2)酶液的配制：将20mg酶加入到20mL灭菌过的超纯水中，配制成1mg/mL，同时调节pH：胰蛋白酶(5.4)、胃蛋白酶(2.0)、蛋白酶K(7.5)、溶菌酶(5.0)、过氧化氢酶(7.3)，均保存于-20℃，备用。
(3)酶反应：将发酵上清液与酶液等体积混合，置于37℃下反应30min。调节pH至3.0，做牛津杯对照实验，以藤黄微球菌为指示菌，观察抑菌圈大小的变化。
由实验结果可得(见图4)，植物乳杆菌素plantaricin ZJ316对蛋白酶K、胰蛋白酶、溶菌酶、胃蛋白酶均敏感，但对过氧化氢酶的敏感性则较低。
检测结果说明plantaricin ZJ316为一类在酸性条件下具有抑菌活性的热稳定抗菌肽。
实施例4：Lactobacillus plantarum ZJ316中抗菌肽plantaricin ZJ316的分离和抑菌谱
硫酸铵梯度沉淀(硫酸铵由饱和度45％升至60％)，收集沉淀，水溶，超滤浓缩，并采用Sephacryl S-100HR填料柱在Purifier 100蛋白质纯化系统上进行凝胶过滤，收集有抑菌活性的组分，用纯水作为流动相，经检测发现在20～25min之内的组分(B1)有抑菌活性(图5)，C1(10～15min)、C2(15～20min)、C3(25～30min)、C4(30～35min)和C5(35～40min)均无抑菌活性。(如图6所示，其中B1、C1、C2、C3、C4和C5分别为吸收峰对应的组分，对照为1.0mol/L HCl)。图7为HPLC检测B1组份的纯度(检测波长280nm)，表明B1组分的蛋白纯度很高，已达到质谱分析的要求。
采用双层琼脂牛津杯法对抗菌肽plantaricin ZJ316进行抑菌谱测定。结果显示该抗菌肽对26个指示菌中的18个菌株有抑制作用(见表2)。
表2：plantaricin ZJ316的抗菌谱
*无抑制(-)；强抑制(抑菌圈直径＞20mm，++++)
实施例5：Lactobacillus plantarum ZJ316中抗菌肽plantaricin ZJ316分子量测定
实施例4中经HPLC检测后的纯化样品进行质谱MALDI-TOF-MS分析(AutoFlex MALDI-TOF-TOF-MS，Bruker)。
主要测试参数：
(1)检测条件：N2激光源，波长337nm；
(2)离子类型：正离子；
(3)检测方式：反射方式(飞行管长2.7M，加速电压20KV，反射电压23KV)；
(4)基质：CCA。
结果如图8，图中显示该细菌素的分子量为2366Da。
实施例6：Lactobacillus plantarum ZJ316中抗菌肽plantaricin ZJ316的N端序列分析
实施例4中经HPLC检测后的纯化样品用Edman降解法进行氨基酸序列分析(氨基酸测序仪ABI491A)。结果见图9，为测出的N端5个氨基酸——S(丝氨酸)、L(亮氨酸)、P(脯氨酸)、Q(谷氨酰胺)、N(天冬氨酸)。
序列表_ST25
SEQUENCE LISTING
<110>浙江工商大学
<120>Lactobacillus plantarum ZJ316、产生的抗菌肽及其制备与应用
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Claims (7)
1.Lactobacillus plantarum ZJ316，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC No：M 208077，保藏日期2008年5月23日。
2.由权利要求1所述的Lactobacillus plantarum ZJ316发酵产生的抗菌肽plantaricin ZJ316，分子量为2366Da，N端序列为SLPQN，所述抗菌肽ZJ316的制备方法包括：Lactobacillus plantarum ZJ316接种至适用于乳杆菌的发酵培养基中，35～38℃下发酵培养18～24h，得到发酵液离心，取上清，分离纯化得到所述的抗菌肽ZJ316。
3.制备如权利要求3所述抗菌肽的方法，其特征在于所述的方法包括：Lactobacillus plantarum ZJ316接种至适用于乳杆菌的发酵培养基中，35～38℃下发酵培养18～24h，得到发酵液离心，取上清，所述的上清用硫酸铵梯度沉淀，收集沉淀，用水溶解、超滤浓缩，采用Sephacryl S-100HR填料柱在Purifier 100蛋白质纯化系统上进行凝胶过滤，收集有抑菌活性的组分，得到所述抗菌肽。
4.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述适用于乳杆菌的发酵培养基为MRS液体培养基，每1000mL MRS液体培养基按如下组成配制：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物6g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三胺2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，七水硫酸镁0.2g，四水硫酸锰0.05g，吐温1mL，pH6.2～6.4，去离子水补足至1000mL。
5.如权利要求2所述的抗菌肽plantaricin ZJ316在制备饲料添加剂中的应用。
6.如权利要求2所述的抗菌肽plantaricin ZJ316在制备食品防腐剂中的应用。
7.如权利要求2所述的抗菌肽plantaricin ZJ316在制备替代抗生素药物中的应用。
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