CN105002199B - 酿酒酵母分泌表达plantaricin A抑制植物乳杆菌的方法 - Google Patents

Abstract

酿酒酵母分泌表达plantaricin A抑制植物乳杆菌的方法利用基因工程改造酿酒酵母，使之分泌植物乳杆菌素plantaricinA(PlnA)，从而抑制酿酒酵母乙醇发酵中植物乳杆菌染菌的方法，属于生物领域。酿酒酵母发酵生产生物乙醇属于生物化工领域。生物乙醇工业规模的生产常常受到乳酸菌污染的影响，其中植物乳杆菌对其危害最大。本发明旨在构建酿酒酵母工程菌，使其分泌表达植物乳杆菌素PlnA，从而对乳酸菌污染进行防控。本发明的工程菌InvScI‑plnA长势较好，且可成功分泌PlnA，浓度约为(20μg/ml)，其培养上清液加入乳酸菌培养体系后，测量乳酸菌的生物量的变化，证明其对植物乳杆菌具有明显的抑菌效果。与现有的抗生素法相比，PlnA环境友好、对人体无害，具有较高的潜在商业价值和应用潜力。

Description

酿酒酵母分泌表达plantaricin A抑制植物乳杆菌的方法

技术领域

一种利用基因工程改造酿酒酵母，使之可以分泌植物乳杆菌素plantaricinA(PlnA)，从而抑制酿酒酵母乙醇发酵中植物乳杆菌染菌的方法，属于生物技术领域。

背景技术

在乙醇发酵的工业生产中，染菌是长期制约发酵规模和持续发展的一个关键问题。在利用酿酒酵母发酵生产乙醇中，造成染菌的主要原因是设备的渗漏和空气的污染，发生染菌后发酵罐中的乳酸含量会升高，这说明在发酵过程中杂菌主要是乳酸菌。一旦染菌，发酵液条件适合植物乳杆菌的生长，乳酸菌生长繁殖力强，不仅会和酿酒酵母竞争营养成分和生存空间，其在代谢过程中产生的乳酸也会反过来抑制酿酒酵母的生长，发酵终期的乙醇产量和质量都会受到影响。

目前，在发酵工业中通常通过添加抗生素来进行染菌防控方法，然而，其存在着效力降低、环境污染等问题。抗生素在后续蒸馏、纯化步骤中难以彻底分解，会在产品中有所残留。与此同时，由于抗生素的滥用，有抗性的菌株相继出现，抗性基因随着废水废渣排放进入环境，污染水源、土地等，给生态环境、人类的健康和安全造成影响造成更大的威胁，因而传统的染菌防控法——抗生素法越来越难以获得大家的认可，寻找安全有效、环境友好的新型染菌防控方法刻不容缓。

细菌素是由细菌生物合成的一类通常具有抑菌活性的蛋白质、多肽或前体多肽。其通常在对数其后期或稳定期前期，通过核糖体合成，对其同种近缘菌株呈现狭窄的活性抑制谱。普遍认为，由于细菌素已经存在于许多自古以来吃的食物，因而相比于抗生素更为安全。植物乳杆菌素PlnA属于IIc亚类细菌素，研究发现其抑菌谱较其他细菌素而言更窄，只对Lactobacilluscasei,Lactobacillus sakei,Lactobacillusviridescens,Lactobacillus plantarum等几种乳酸菌有抑制作用，即其抑菌作用的特异性更强。本实验室前期研究证明了将PlnA用于酿酒酵母发酵生产乙醇过程中植物乳杆菌污染防控的可行性。目前查阅到的文献记录中尚未发现利用酿酒酵母对PlnA进行异源表达的报道。本课题组利用基因工程改造了酿酒酵母InvScI，构建了可以分泌植物乳杆菌素PlnA的工程菌InvScI-plnA，并证明其发酵上清液对植物乳杆菌具有明显的抑菌效果。

发明内容

本发明利用基因工程改造了酿酒酵母InvScI，使之可以分泌植物乳杆菌素PlnA，从而抑制酿酒酵母乙醇发酵中植物乳杆菌染菌，其核心是构建含有目的片段plnA的质粒，并使其在酿酒酵母中有活性地分泌表达。具体包括以下步骤：

1.酿酒酵母分泌表达plantaricin A抑制植物乳杆菌的方法，其特征在于：

选用酿酒酵母(Saccharomyces cerevistae)InvScI菌株作为宿主菌；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC BAA-793作为植物乳杆菌素产生菌，具体操作如下：

(1)将Lactobacillus plantarum ATCC BAA-793接种于MRS培养基置于30～37℃恒温箱培养过夜，进行菌种复苏；将复苏后的菌液接种于MRS培养基，置于30～37℃恒温箱培养12～16h，离心收集菌体；使用细菌全基因组提取试剂盒获取LactobacillusplantarumATCC BAA-793全基因组；

(2)按照plnA序列SEQ ID No.1设计plnA序列上下游引物SEQ ID No.2和plnA序列上下游引物SEQ ID No.3；根据Taq酶说明书设计程序进行PCR，扩增目的片段；利用T4连接酶将PCR产物与载体PMD-19T-Simple连接，转化进入大肠杆菌Top10中；

(3)通过对载体和片段酶切位点分析，选定酶切位点KpnI和NotI，设计α-factor的上游引物搭桥SEQ ID No.5、下游引物搭桥SEQ ID No.6、plnA的上游引物搭桥SEQ ID No.7和下游引物搭桥SEQ ID No.8，α-factor的下游引物SEQ ID No.6与plnA的上游引物SEQ IDNo.7序列反向互补；通过搭桥PCR在plnA上游加上分泌信号肽α-factor，形成片段α-factor-plnA；使用KpnI和NotI对片段α-factor-plnA和质粒pYES2.0进行双酶切；使用T4连接酶将酶切后的片段与质粒连接形成载体pYES2.0-plnA；将连接产物转化进入大肠杆菌Top10中；

(4)利用质粒小提试剂盒提取质粒pYES2.0-plnA，并通过醋酸锂转化进入酿酒酵母InvScI，利用尿嘧啶营养缺陷培养基筛选阳性克隆。

2.目的基因的诱导表达的方法，其特征在于：

(1)取保存的权利要求1阳性克隆后菌种接入尿嘧啶缺陷培养基，于30～35℃，180～220rmp条件下过夜培养，进行菌种活化；

其中，尿嘧啶缺陷培养基配方，1L培养基含有YNB6.7g，葡萄糖20.0g，氨基酸混合培养液，10.0mL；其中氨基酸混合培养液配方为：亮氨酸10.0g/L；色氨酸10.0g/L；组氨酸5.0g/L；葡萄糖要单独灭菌；

(2)按照OD₆₀₀＝0.4～0.6，将活化后的菌液接入50mL以半乳糖为唯一碳源的诱导培养基，培养36h，离心收集上清液；

所用半乳糖诱导培养基，1L培养基含有YNB 6.7g，半乳糖20.0g，氨基酸混合培养液，10.0mL；其中氨基酸混合培养液配方为：亮氨酸10.0g/L；色氨酸10.0g/L；组氨酸5.0g/L；半乳糖要单独灭菌。

进一步，步骤(1)所述培养温度为30℃。

诱导酿酒酵母分泌表达植物乳杆菌素plantaricin A，应用于酿酒酵母发酵生物乙醇生产中乳酸菌的污染的防控。

本专利创新点在于：1、植物乳杆菌素PlnA为天然产物，环境友好，对于人体健康无害，将其应用于植物乳杆菌的防控时相比于抗生素更加安全；2、成功构建了可分泌表达PlnA的酿酒酵母工程菌InvScI-plnA，构建的表达体系将可用于其他类似细菌素的表达。

附图说明

图1为表达载体pYES2.0-plnA构建的流程图

具体实施方式

一、目的基因的获取

1、取保存的菌种Lactobacillus plantarum ATCC BAA-793接种于新鲜的MRS培养基，置于30～37℃恒温箱培养过夜，使菌种复苏。

2、步骤1中所用MRS培养基配方，1L培养基含有：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)20.0g，吐温-801.0mL，乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)5.0g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)2.0g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.58g，硫酸锰(MnSO₄·H₂O)0.25g，培养基pH值为6.2。

3、将复苏的Lactobacillus plantarum ATCC BAA-793接种于新鲜的MRS培养基，置于30～37℃恒温箱培养12～16h，离心收集菌体。使用细菌全基因组提取试剂盒获取Lactobacillus plantarum ATCC BAA-793全基因组作为PCR扩增DNA模板。

4、按照plnA序列(SEQ ID No.1)设计游引物，其上游引物如SEQ ID No.2所示，下游引物如SEQ ID No.3所示。通过PCR扩增目的片段plnA，包含以下步骤：

步骤(1)：按如下比例配制反应体系：

其中，DNA模板浓度为100-200ng/μL，上游引物及下游引物浓度为10mmol/μL；

步骤(2)：设定PCR程序为：1、94℃预变性3min；2、94℃变性30s；3、57℃复性30s；4、72℃延伸20s；5、72℃延伸10min；6、4℃恒温保存

其中2～4歩设置循环，次数为30次。

步骤(3)：琼脂糖电泳检测扩增结果，看100bp～250bp之间有无目的条带出现

5、将所得目的片段与载体PMD-19T-Simple连接，所用体系为：PMD-19T-Simple0.5μL；Solution15μL；目的片段4.5μL，合计10μL。将体系置于16℃反应过夜.

6、将连接产物转化进入大肠杆菌Top10保存，具体包含以下步骤：

步骤(1)：将连接产物10μL全部加入感受态细胞，通过0℃冰水浴30min、42℃热激90s、0℃冰水浴5min将产物转化进入Top10感受态细胞；

步骤(2)：在体系中加入500μL LB液体培养，于37℃、200rmp摇床培养45～60min，使质粒上抗性基因表达，菌体复苏；

步骤(3)：将体系于4000～6000rmp条件下离心30s，倒掉部分上清液，余100～200μL和沉淀混匀涂布于加有0.1mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，置于37℃恒温箱静置培养过夜。

步骤(4)：挑取平板上单菌落进行菌落PCR验证，体系及程序同4所示，挑取在100bp～250bp之间有较亮条带的菌落，接入加有0.1mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养。

步骤(5)：提取质粒进行测序，保存测序正确的菌株备用。

其中，步骤(2)、(3)、(4)所用LB培养基配方为：NaCl，5.0g；酵母浸粉，5.0g；胰蛋白胨，10.0g。用去离子水定容至1L，121℃灭菌。固体培养基加入1.8％的琼脂。

二、可分泌表达植物乳杆菌素plnA的质粒构建

1、选取pYES2.0作为表达载体，对pYES2.0、目的片段plnA、分泌信号肽α-factor进行酶切位点分析，确定使用的酶切位点KpnI和NotI。其中α-factor的序列如SEQ ID No.4所示

2、分别设计α-factor的上游引物搭桥(SEQ ID No.5)、下游引物搭桥(SEQ IDNo.6)、plnA的上游引物搭桥(SEQ ID No.7)、下游引物搭桥(SEQ ID No.8)，以含有目的片段plnA和信号肽α-factor的质粒作为DNA模板，通过搭桥PCR在plnA上游加上分泌信号肽α-factor，形成片段α-factor-plnA。

3、步骤2中所述搭桥PCR具体操作如下：

步骤(1)：分别按如下比例配制反应体系，扩增目的片段plnA和信号肽α-factor：

其中，DNA模板浓度为100-200ng/μL，上游引物及下游引物浓度为10mmol/μL；

步骤(2)：设定PCR程序为：1、94℃预变性3min；2、98℃变性1min；3、57℃复性30s；4、72℃延伸20s；5、72℃延伸10min。

其中2～4歩设置循环，次数为30次。

步骤(3)：琼脂糖电泳检测扩增结果，分别看plnA和信号肽α-factor在150bp和250bp作用有无目的条带出现。

步骤(4)：将步骤(2)所得目的片段plnA和信号肽α-factor PCR扩增产物按照体积比1:1混合均匀，制成体积比为1：1的混合液。配置反应体系如下：

步骤(5)：设定PCR程序为：1、94℃预变性3min；2、98℃变性1min；3、65℃复性30s；4、72℃延伸20s；

其中2～4步设置循环，次数为5次。

步骤(6)：在步骤(4)所示体系中加入1μL的α-factor的上游引物(SEQ ID No.5)和1μL的plnA的上游引物(SEQ ID No.8)，按照步骤2所示程序进行PCR反应，产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化回收，记为α-factor-plnA片段。

其中步骤(6)所用引物浓度均为100mmol/μL

4、使用KpnI和NotI对片段α-factor-plnA和质粒pYES2.0进行双酶切；使用T4连接酶将酶切后的片段与质粒连接形成载体pYES2.0-plnA；将连接产物转化进入大肠杆菌Top10中，保存备用。

三、酿酒酵母醋酸锂转化

1、利用质粒小提试剂盒提取质粒pYES2.0-plnA和空质粒pYES2.0，并通过醋酸锂转化进入酿酒酵母InvScI。

2、醋酸锂转化具体步骤如下：

步骤(1)：在平板上挑取InvScI单菌落，接入YPD培养基，于30℃条件下进行菌种复苏。按照OD₆₀₀＝0.4将复苏后的菌液接入50mL新鲜的YPD培养基，培养2～4h，收集菌体。

其中，YPD培养基配方，1L培养基含有：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)20.0g。

步骤(2)：将所得菌体重悬于40mL的1×TE中，离心后重悬于2mL的1×LiAc/0.5×TE中，在室温下放置10min完成感受态制作步骤。

步骤(3)：向100μL步骤(2)所得的感受态中加2μg的构建好的质粒pYES2.0-plnA(或空质粒pYES2.0，即可构建效果验证的对照)，100μg剪切变性鲑鱼精子DNA(biotopped公司生产)，以及700μL 1×LiAc/40％PEG-3350/1×TE，混合均匀。

步骤(4)：将步骤(3)所得混合液在30℃放置30min，加入88μL DMSO，混合均匀后在42℃放置7min。

步骤(5)：将步骤(4)所得菌液离心，收集菌体。用1mL 1×TE清洗菌体后将其涂布于尿嘧啶营养缺陷培养基平板，进行阳性克隆的筛选。

其中，尿嘧啶缺陷培养基配方，1L培养基含有YNB6.7g，葡萄糖20.0g，氨基酸混合培养液，10.0mL。其中氨基酸混合培养液配方为：亮氨酸10.0g/L；色氨酸10.0g/L；组氨酸5.0g/L。葡萄糖要单独灭菌。

3、目的基因的诱导表达过程如下：

步骤(1)：取保存的上述2所筛得的阳性克隆工程菌InvScI-plnA(即转入质粒pYES2.0-plnA)、InvScI-P(即转入空质粒空质粒pYES2.0，为效果评价的对照菌株)接入尿嘧啶缺陷培养基，于30℃，180～220rmp条件下过夜培养，进行菌种复苏。

步骤(2)：按照OD₆₀₀＝0.4～0.6，分别将复苏的菌液接入50mL新鲜的以半乳糖为唯一碳源的诱导培养基，培养36h，离心收集上清液。

其中，诱导培养基配方，1L培养基含有YNB6.7g，半乳糖20.0g，氨基酸混合培养液，10.0mL。其中氨基酸混合培养液配方为：亮氨酸10.0g/l；色氨酸10.0g/l；组氨酸5.0g/l。半乳糖要单独灭菌。

步骤(3)：将收集的诱导培养上清液标记为InvScI-plnA、InvScI-P并分别加入乳酸菌培养体系，通过测量乳酸菌生物量变化验证其抑菌活性。

从乳酸菌生物量变化对InvScI-plnA的抑菌效果进行评价，具体操作步骤如下：

1.植物乳杆菌素PlnA的获取：按照发明内容三步骤3所述方法分别获得InvScI-plnA、InvScI-P诱导表达上清液。

2.菌种的活化：在灭菌的MRS培养基上接种植物乳杆菌ATCC8014，于30～37℃恒温培养12h，达到对数期时进行转接。

3.抑菌效果评价：按照接入菌体量为1～5×10⁶个/mL，将活化好的植物乳杆菌ATCC8014接入50mL新鲜的MRS培养基中。实验分为三组：第一组中加入1mL水作为对照组1；第二组中加入1mL含有空质粒InvScI-P诱导培养上清液对照组2；第三组加入1mL InvScI-plnA诱导培养上清液作为处理组；上述每组各自做三平行。三组置于30～37℃恒温培养，间隔3h取样，测定OD₆₀₀。利用SPSS处理各时间点数据，结果显示：在整个发酵阶段，对照组1、2之间均没有差异(P>0.05)，证明InvScI-P培养上清液不能对ATCC8014产生抑制作用；从培养开始9h起，处理组与对照组2之间产生明显差异，证明InvScI-plnA培养上清液对ATCC8014产生抑制作用，此抑制作用持续至发酵终期24h。乳酸菌生物量的减少量为13～20％。

本发明中上述实施例中的温度及时间等参数均为较优的选择，经实验证明在超出上述实施例范围外也能实现本发明的目的，因不能穷尽所有的数值，在此不再赘述。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域的技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.通过酿酒酵母分泌表达plantaricin A抑制植物乳杆菌的方法，其特征在于：选用酿酒酵母(Saccharomyces cerevistae)InvScI菌株作为宿主菌；植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ATCC BAA-793作为植物乳杆菌素产生菌，具体操作如下：

(1)将Lactobacillus plantarum ATCC BAA-793接种于MRS培养基置于30～37℃恒温箱培养过夜，进行菌种复苏；将复苏后的菌液接种于MRS培养基，置于30～37℃恒温箱培养12～16h，离心收集菌体；使用细菌全基因组提取试剂盒获取LactobacillusplantarumATCC BAA-793全基因组；

(2)按照plnA序列SEQ ID No.1设计plnA序列上游引物SEQ ID No.2和plnA序列下游引物SEQ ID No.3；根据Taq酶说明书设计程序进行PCR，扩增目的片段；利用T4连接酶将PCR产物与载体PMD-19T-Simple连接，转化进入大肠杆菌Top10中；

(3)通过对载体和片段酶切位点分析，选定酶切位点KpnI和NotI，设计α-factor的上游引物搭桥SEQ ID No.5、下游引物搭桥SEQ ID No.6、plnA的上游引物搭桥SEQ ID No.7和下游引物搭桥SEQ ID No.8，α-factor的下游搭桥引物SEQ ID No.6与plnA的上游搭桥引物SEQ ID No.7序列反向互补；通过搭桥PCR在plnA上游加上分泌信号肽α-factor，形成片段α-factor-plnA；使用KpnI和NotI对片段α-factor-plnA和质粒pYES2.0进行双酶切；使用T4连接酶将酶切后的片段与质粒连接形成质粒pYES2.0-plnA；将连接产物转化进入大肠杆菌Top10中；

(4)利用质粒小提试剂盒提取质粒pYES2.0-plnA，并通过醋酸锂转化进入酿酒酵母InvScI，利用尿嘧啶营养缺陷培养基筛选阳性克隆；

(5)取步骤(4)筛选所得的阳性克隆菌种接入尿嘧啶缺陷培养基，于30～35℃，180～220rmp条件下过夜培养，进行菌种活化；

其中，尿嘧啶缺陷培养基配方，1L培养基含有YNB6.7g，葡萄糖20.0g，氨基酸混合培养液，10.0mL；其中氨基酸混合培养液配方为：亮氨酸10.0g/L；色氨酸10.0g/L；组氨酸5.0g/L；葡萄糖要单独灭菌；

(6)按照OD₆₀₀＝0.4～0.6，将活化后的菌液接入50mL以半乳糖为唯一碳源的诱导培养基，培养36h，离心收集上清液；

所用半乳糖诱导培养基，1L培养基含有YNB 6.7g，半乳糖20.0g，氨基酸混合培养液，10.0mL；其中氨基酸混合培养液配方为：亮氨酸10.0g/L；色氨酸10.0g/L；组氨酸5.0g/L；半乳糖要单独灭菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述培养温度为30℃。