CN102978134A - 一种乳杆菌及利用其发酵生产d-乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳杆菌及利用其发酵生产D-乳酸的方法，用于本发明的菌株为乳杆菌（Lactobacillussp.）DMDL9010，保藏号为CGMCC No.5172，先将该菌株经过三次活化培养，然后于20~35℃发酵108~144h得到高光学纯度的D-乳酸。本发明中乳杆菌DMDL9010能够利用五碳糖和六碳糖发酵生产D-乳酸，稳定高产，产量为65~85g/L；所产生的D-乳酸具有高光学纯度，达到80~90%；发酵所用的原料来源广泛，价格低廉；菌株发酵周期仅为108~144h；利用本发明的方法发酵生产D-乳酸，能够节约成本，提高生产效率，具有重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于有机酸发酵技术领域，涉及D-乳酸的生产方法，具体涉及一种乳杆菌及利用其发酵生产D-乳酸的方法。
背景技术
生物质是指以木质素、纤维素、半纤维素以及其他有机质为主的陆生植物和水生植物，是一种稳定的可再生能源资源，来源丰富，仅我国农作物秸秆产量每年约为7亿吨。在上世纪石油危机后，人们开始重视由生物质为原料制备乳酸、燃料酒精的技术。
乳酸（分子式：C2H5OCOOH），即为α-羟基丙酸，由于其分子中羧基α位碳原子为不对称原子，因而具有旋光性，可分成L（+）和D（-）两种构型，L-乳酸为右旋型，D-乳酸为左旋型。乳酸已广泛用于食品、饮料、饲料、现代医药、现代农药、日用化工、造纸及电子等行业。高光学纯度97%以上的D-乳酸或L-乳酸，是重要的手性中间体和有机合成原料，能广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成。D-乳酸在提高聚乳酸热稳定性等方面也具有重要作用。
目前限制D-乳酸的广泛应用的主要原因有：（1）D-乳酸的生产成本高，其发酵生产的原材料成本高，提纯和精制成本高；（2）没有筛选到合适的能发酵产生高光学纯度D-乳酸的菌株，因为一般的乳酸菌主要以发酵产生L-乳酸为主；（3）现有已知的乳酸菌一般不能利用戊糖，例如木糖、核糖和阿拉伯糖作为碳源。
微生物发酵法是目前制备D-乳酸的最主要方法之一，由于D-乳酸的理化性质与L-乳酸极其相似，在生产工艺上可以借助L-乳酸的，因此生产D-乳酸的关键在于筛选出高光学纯度D-乳酸高产菌种，并应用低廉有广泛来源的原料进行发酵，简化发酵和提纯工艺，降低成本。
目前主要利用重组酵母、重组大肠杆菌、重组谷氨酸棒杆菌和菊糖芽孢乳杆菌发酵生产D-乳酸。如于培星[于培星，高产D-乳酸凝结芽孢杆菌发酵工艺条件的确立，中国食品添加剂，2010，2：97-101]使用凝结芽孢杆菌，D-乳酸最高产量约为120 g/L；中国专利03817294.1公开了利用重组酵母生产D-乳酸的方法；申请号为201010241912.X的中国发明专利公开了用菊糖芽孢乳杆菌发酵生产D-乳酸；申请号为201010101421.5的中国发明专利公开了利用重组大肠杆菌以甘油为原料发酵制备D-乳酸的方法，但是菌株对酸的耐受性差，生产率低，使得大肠杆菌在D-乳酸实际应用当中受到限制；申请号为201010247826.X的中国发明公开了利用基因工程手段，成功构建了产高光学纯度D-乳酸的基因工程菌并利用其进行乳酸发酵生产，其D-乳酸产量达到40g/L以上，纯度为99％以上；申请号为201010235511.3的专利公开了利用同源重组的方法得到产纯D-乳酸的基因工程菌并用其进行乳酸发酵生产，其D-乳酸产量仅为20g/L以上，纯度为99％以上。上述现有技术中D-乳酸的产量不高，使用的碳源主要以葡萄糖为主，没有涉及到更广泛的生物质碳源。
戊糖乳杆菌可抑制腐败菌和致病菌的生长。如中国专利03126225.2公开了“一种戊糖乳杆菌菌株和以该菌株制成的发酵剂及该发酵剂在肉食品中的应用”；中国专利200510105985.5公开了戊糖乳杆菌代谢产生的细菌素和戊糖乳杆菌作为发酵剂在发酵制品中的应用；专利号为200810247335.8的中国发明公开了戊糖乳杆菌和乳酸片球菌用于中、西肉制品中的加工应用。但上述专利都没有涉及戊糖乳杆菌在D-乳酸发酵生产中的应用。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种乳杆菌（Lactobacillus sp.）及利用其发酵生产D-乳酸的方法，该方法中D-乳酸的产量高，碳源来源广泛。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL 9010，由荔枝汁分离筛选得到，并于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC NO. 5172。
该乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL 9010（CGMCC NO. 5172）菌株具有如下性质：
（1）形态特征：二联杆菌，无芽孢，菌落表面光滑半透明，边缘整齐，有光泽；
（2）生理特征：接触酶阴性，氧化酶阴性，不液化明胶，不还原硝酸盐，精氨酸水解阴性，酪素水解阴性，V-P试验阳性，革兰氏染色为阳性菌，兼性厌氧菌，可利用阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、核糖、山梨糖、海藻糖、七叶灵，不能利用鼠李糖和棉籽糖。能在15℃、37℃、40℃温度下生长，在45℃温度不生长。
对该乳杆菌（Lactobacillus sp.） DMDL 9010（CGMCC NO. 5172）菌株的初步鉴定结果如表1所示：
表1 MRS培养基分离菌株发酵特性
《广东省微生物分析检测中心分析检测鉴定报告粤微检（2011）ZD0260号》中的理化试验结果如表2所示；16S rDNA测序结果见核苷酸序列表，测序结果表明该菌株的序列与戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus的同源性达到100%。鉴定结果为：戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）。
表2 理化试验结果（碳水化合物产酸）
本发明还提供一种利用乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL9010发酵生产D-乳酸的方法，包括如下步骤和工艺条件：
第一步：将乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL9010的冻干粉0.1~0.5g置于种子培养基中，每5~10 mL培养基加入冻干粉0.1~0.5g，于20~35℃静止培养20~28h，制成第一次种子液；
第二步：以体积比为5~10：100的比例，将第一次种子液接入种子培养基中，于20~35℃静止培养20~28h，制成第二次种子液；
第三步：以体积比为5~10：100的比例，将第二次种子液接入种子培养基中，于20~35℃静止培养20~28h，制成第三次活化液；
第四步：以体积比为（2~8）：100的比例，将第三步得到的第三次活化液接入到发酵培养基中，加入中和剂调节发酵培养基的pH为6.0~7.0，于20~35℃下，在搅拌转速为100~150rpm的发酵罐中发酵108~144 h；
所述种子培养基的配方为：以重量份数计，蛋白胨0.8~1.2份，酵母粉0.2~0.8份，葡萄糖1.5~2.5份，柠檬酸三胺0.1~0.3份，七水合硫酸镁0.01~0.03份，牛肉膏0.5~1.5份，磷酸氢二钾0.05~0.35份，四水合硫酸锰0.001~0.009份，乙酸钠0.05~0.35份，吐温80 0.05~0.15份，蒸馏水92.8~96.7份；所述种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后用0.08~0.10MPa灭菌15~20min，冷却至20~35℃备用；所述种子培养基的pH为6.0~7.0；
所述发酵培养基的配方为：以重量份数计，糖度为15~25%的淀粉质水解液或生物质糖液60~80份，蛋白胨0.8~1.2份，酵母粉0.2~0.8份，牛肉膏0.5~1.5，葡萄糖1.5~2.5份，柠檬酸三胺0.1~0.3份，七水合硫酸镁0.01~0.03份，磷酸氢二钾0.05~0.35份，四水合硫酸锰0.001~0.009份，乙酸钠0.05~0.35份，吐温80 0.05~0.15份，抗坏血酸0.02~0.04份，蒸馏水10.8~35.9份；所述发酵培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后用0.08~0.10 MPa灭菌15~20 min，冷却至20~35 ℃，加入0.5~2.0份的95%的乙醇，搅拌均匀后备用；所述发酵培养基的pH为6.0~7.0。
所述中和剂为已灭菌的碱土金属氢氧化物、碱土金属碳酸盐或氨水中的一种或两种以上；所述中和剂加入的方式为一次性加入、分批加入或流加入；
所述分批加入为每发酵12~24小时加入一次中和剂，每次加入量不超过发酵培养基总体积的0.5~1.0 %；所述流加入的流速为0.5~2mL/min。
所述淀粉质水解液的制备方法为：将60~200目的淀粉质粉体加水配制成体积百分比为15~30%的溶液，以每100g干淀粉加入α-淀粉酶为0.02~0.04mL，在70~80℃保温30~40min，然后在90~100℃液化60~90min，降温至60~65℃，以每100g干淀粉加入糖化酶0.05~0.15mL，于60~65℃保温30~60min后离心取上清液即为淀粉质水解液；所述淀粉质粉体为玉米淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、大米粉或糙米粉中的一种或两种以上；所述生物质糖液为甘蔗糖液、蔗糖液、纤维素水解液、半纤维素水解液、半乳糖液或木糖液，以及由纤维二糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、核糖或山梨糖中的一种或两种以上糖组成的混合液。
所述搅拌的过程中采用氧化还原电位的变化进行转速控制，使氧化还原电位为-150~-180，同时利用手性柱高效液相色谱法测定D-乳酸的含量确定发酵终点。
本发明的方法发酵生产的D-乳酸的产量为65~85 g/L，光学纯度为80~90%。
为进一步实现本发明目的，第三步工作发酵剂与种子培养基的体积比优选为5：100，发酵温度优选为30℃；第一步、第二步和第三步的发酵温度均优选为30℃，培养时间均优选为24h；所述的淀粉质水解液优选为体积百分比为20%玉米淀粉水解液；淀粉酶的优选用量为0.03mL/100g；糖化酶的优选用量为0.10mL/100g。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
（1）本发明的乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL9010在生产过程中进行三次依次培养，使该菌尽量活化，并处于同步生长状态；
（2）本发明所用的种子培养基，采用抗坏血酸能保证菌体生长过程中所需要的生长因子，促进菌体大量产D-乳酸的营养需要；
（3）本发明中的乳杆菌DMDL9010能利用大量半纤维素、木质素等废弃物的降解产物中的木糖、阿拉伯糖等五碳糖和六碳糖（如：阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、核糖、山梨糖、海藻糖、七叶灵）发酵产生D-乳酸，而且在发酵液中光学纯度可达到80%以上，D-乳酸的产量可达到65g/L以上，具有重要的社会和商业价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中利用乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL9010生产D-乳酸，用手性柱Chirex 3126的高效液相法检测D-乳酸的含量，发酵144h的高效液相色谱（简称：HPLC）图。
图2为本发明实施例1中乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL9010随着发酵时间的产D-乳酸的变化曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。
乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL 9010，由荔枝汁分离筛选得到，并于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC NO. 5172。以下实施例都是利用该菌种进行发酵。
实施例1
（1）将乳杆菌DMDL9010的冻干粉0.1g置于5mL的种子培养基中，于30℃静止培养24 h，制成第一次种子液；
（2）以体积比为10：100的比例，将第一次活化液接入种子培养基中，于30℃静止培养24h，制成第二次种子液；
（3）以体积比为10：100的比例，将第二次活化液接入种子培养基中，于30℃静止培养24h，制成第三次种子液；
（4）以体积比为5：100的比例，将第三次种子液接入到发酵培养基中，于30℃下，在搅拌转速为100~150rpm的发酵罐中进行培养，发酵过程中均分5次加入共计已灭菌的50g/L的CaCO3，发酵时间为144h。
种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，乙酸钠2g/L，柠檬酸三胺2g/L，吐温80 1mL/L，MgSO4.7H2O 0.2 g/L，K2HPO4 2g/L，MnSO4·4H2O 0.05g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.0，用0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃备用。
发酵培养基的配方为：糖度为18.2%的玉米淀粉水解液824mL，蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸三胺2g/L，MgSO4.7H2O 0.2g/L，K2HPO4 2g/L，MnSO4·4H2O 0.05g/L，乙酸钠2g/L，吐温80 1mL/L，抗坏血酸0.3g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.0，用0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃，加入20mL/L的95%（wt.）乙醇，搅拌均匀后备用。
玉米淀粉水解液的制备方法为：将150目的玉米淀粉加水配制成体积百分比为20%的溶液，以每100克干淀粉加入α-淀粉酶0.04mL，在70℃保温30min，然后在90~100℃液化60min，然后降温至60~65℃，加入糖化酶0.05mL，于60~65℃保温60min后离心取上清液备用，糖度为18.2 %。
本专利技术用手性柱Chirex 3126的高效液相法检测发酵过程中的D-乳酸和L-乳酸的含量，Chirex 3126是一种配体交换柱，以固相化与过渡金属离子（Cu2+）配位的配体为固定相，基于流动相中的配体与固定相的配体间交换平衡以及稳定性来分离L-乳酸和D-乳酸，具体步骤参考以下文献：刘冬梅、吴晖、余以刚、等.高效液相色谱法对泡菜中L-乳酸和D-乳酸的手性分离和测定，现代食品科技，2007，23（8）：74-76。采用高效液相色谱仪系统，配备Waters 600 泵多通道输送系统；Waters 717 自动进样器；Waters 2996 PDA 二极管阵列检测器；色谱柱：手性柱Chirex 3126 (D)-penicillami，4.6 mm ID×250 mm L。分析条件：流动相为0.002moL/L的硫酸铜溶液溶剂为5%（wt.）的异丙醇溶液，使用前经0.45μm滤膜过滤，超声脱气；流动相流速为0.7 mL/min；柱温30℃；二极管阵列Waters 2996，检测波长为254nm；标准和样品溶液用前均经过0.45μm滤膜过滤后超声脱气；进样量为10μL；用Empower积分软件积分，进行峰面积法外标定量。
HPLC检测结果如图1所示，可看出L-乳酸的出峰时间为12.722min，D-乳酸的出峰时间为15.304min。
乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL9010随着发酵时间的产D-乳酸的变化曲线如图2所示，可以看出，用乳杆菌DMDL9010进行D-乳酸发酵，抽取了12、24、36、48、72、96、120、144h的发酵液，随着发酵时间的延长，D-乳酸的产量由12h的12.045g/L上升到48h的27.255g/L，48h后产D-乳酸的量呈直线上升，到120h时D-乳酸的量达到72.00g/L，到144 h发酵结束D-乳酸的量为75.00g/L。在整个发酵过程中D-乳酸的光学纯度达到84%。
本发明中的乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL9010能利用的原料广泛，例如能利用大量半纤维素、木质素等废弃物的降解产物中的木糖、阿拉伯糖等五碳糖和六碳糖（如：阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、核糖、山梨糖、海藻糖、七叶灵）发酵产生D-乳酸，其产量高达65 g/L以上，而且D-乳酸在发酵液中光学纯度可达到80%以上，具有重要的社会和商业价值。
实施例2
（1）将乳杆菌DMDL9010的冻干粉0.2g置于6mL的种子培养基中，于35℃静止培养20h，制成第一次种子液；
（2）以体积比为10：100的比例，将第一次活化液接入种子培养基中，于35℃静止培养24h，制成第二次种子液；
（3）以体积比为10：100的比例，将第二次活化液接入种子培养基中，于35℃静止培养24h，制成第三次种子液；
（4）以体积比为8：100的比例，将第三次种子液接入到发酵培养基中，于35℃下，在搅拌转速为100~150rpm的发酵罐中进行培养，发酵过程中均分2次加入已灭菌的共计20g/L的CaCO3，每发酵24h后以1.0ml/min的流速加入已灭菌的40%（wt）氨水，调节pH为6.8，发酵时间为120 h。
种子培养基的配方为：葡萄糖15g/L，蛋白胨8g/L，牛肉膏15g/L，酵母粉7.5g/L，乙酸钠1.5g/L，柠檬酸三胺1g/L，吐温80 1.5mL/L，MgSO4.7H2O 0.1g/L，K2HPO4 1g/L，MnSO4·4H2O 0.07g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.8，用0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃备用。
发酵培养基的配方为：糖度为25.3 %的玉米淀粉水解液653mL，蛋白胨8g，酵母粉7.5g，牛肉膏15g/L，葡萄糖15g/L，柠檬酸三胺1g/L，MgSO4.7H2O 0.1g/L，K2HPO4 1g/L，MnSO4·4H2O 0.07g/L，乙酸钠1.5g/L，吐温80 1.5mL/L，抗坏血酸0.2g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.8，用0.10MPa灭菌20min，冷却至35℃，加入5mL/L的95%（wt.）乙醇，搅拌均匀后备用。
玉米淀粉水解液的制备方法为：将150目的玉米淀粉加水配制成体积百分比为30%的溶液，以每100克干淀粉加入α-淀粉酶0.02mL，在70℃保温30min，然后在90~100℃液化60min，然后降温至60~65℃，加入糖化酶0.10mL，于60~65℃保温60min后离心取上清液备用，糖度为25.3%。
利用手性柱高效液相色谱法测定D-乳酸的含量确定发酵终点。
到120h发酵结束D-乳酸的量为85.00g/L。在整个发酵过程中D-乳酸的光学纯度达到90%。
实施例3
（1）将乳杆菌DMDL9010的冻干粉0.3g置于7mL的种子培养基中，于30℃静止培养24h，制成第一次种子液；
（2）以体积比为10：100的比例，将第一次活化液接入种子培养基中，于30℃静止培养24h，制成第二次种子液；
（3）以体积比为10：100的比例，将第二次活化液接入种子培养基中，于30℃静止培养24h，制成第三次种子液；
（4）以体积比为5：100的比例，将第三次种子液接入到发酵培养基中，于30℃下，在搅拌转速为100~150rpm的发酵罐中进行培养，发酵过程中均分3次加入已灭菌的共计30g/L的Ca（OH）2，每发酵24h后以1.0 ml/min的流速加入已灭菌的40 %（wt）的NaOH溶液，调节pH为7.0，发酵时间为144 h。
种子培养基的配方为：葡萄糖15g/L，蛋白胨12g/L，牛肉膏5g/L，酵母粉2g/L，乙酸钠3.5g/L，柠檬酸三胺1.5g/L，吐温80 0.5mL/L，MgSO4.7H2O 0.3g/L，K2HPO4 3.5g/L，MnSO4·4H2O 0.09g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为7.0，用0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃备用。
发酵培养基的配方为：糖度为25.0%的玉米秸秆水解液600mL，蛋白胨12g，酵母粉2g，牛肉膏5g/L，葡萄糖25g/L，柠檬酸三胺1.5g/L，MgSO4.7H2O 0.3g/L，K2HPO4 3.5g/L，MnSO4·4H2O 0.09g/L，乙酸钠3.5g/L，吐温80 0.5mL/L，抗坏血酸0.4g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为7.0，用0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃，加入7.5mL/L的95%（wt.）乙醇，搅拌均匀后备用。
玉米秸秆水解液的制备方法为：先将玉米秸秆磨碎，以重量计，在玉米秸秆中加入重量为10倍重的2%的H2SO4水溶液，升温至95~105℃，水解120分钟，降温离心后除沉淀取上清液，用折光仪测定糖浓度，糖浓度为6.5%，用质量分数5%的Ca(OH)2溶液中和，调节pH为7.0，低温真空浓缩使糖浓度为25%。
利用手性柱高效液相色谱法测定D-乳酸的含量确定发酵终点。
到144 h发酵结束D-乳酸的量为65.00 g/L。在整个发酵过程中D-乳酸的光学纯度达到80.5%。
实施例4
（1）将乳杆菌DMDL9010的冻干粉0.4g置于8mL的种子培养基中，于30℃静止培养24h，制成第一次种子液；
（2）以体积比为10：100的比例，将第一次活化液接入种子培养基中，于30℃静止培养24h，制成第二次种子液；
（3）以体积比为10：100的比例，将第二次活化液接入种子培养基中，于30℃静止培养24h，制成第三次种子液；
（4）以体积比为5：100的比例，将第三次种子液接入到发酵培养基中，于30℃下，在搅拌转速为100~150rpm的发酵罐中进行培养，发酵过程中均分4次加入已灭菌共计40 g/L的Ca（OH）2，每发酵24 h后以1.0 ml/min的流速加入已灭菌的40 %（wt）氨水，使pH调节为6.5，发酵时间为108 h。
种子培养基的配方为：葡萄糖18g/L，蛋白胨11g/L，牛肉膏8g/L，酵母粉8g/L，乙酸钠2g/L，柠檬酸三胺3g/L，吐温80 0.8mL/L，MgSO4.7H2O 0.15g/L，K2HPO4 2.5g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.5，用0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃备用。
发酵培养基的配方为：糖度为25.0%的甘蔗渣水解液625mL，蛋白胨11g，酵母粉8g，牛肉膏8g/L，葡萄糖18g/L，柠檬酸三胺3g/L，MgSO4.7H2O 0.15g/L，K2HPO4 2.5g/L，MnSO4·4H2O 0.0 g/L，乙酸钠2g/L，吐温80 0.8mL/L，抗坏血酸0.24g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.5，用0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃，加入15mL/L的95%（wt.）乙醇，搅拌均匀后备用。
甘蔗渣水解液的制备方法为：先将甘蔗磨碎，以重量计，在甘蔗渣中加入重量为10倍重的2%的H2SO4水溶液，升温至95~105℃，水解120分钟，降温离心后除沉淀取上清液，用折光仪测定糖浓度，糖浓度为6.5%，其中木糖纯度为60%，用质量分数5%的Ca(OH)2溶液中和，调节pH为6.5，低温真空浓缩使糖浓度为24%。
利用手性柱高效液相色谱法测定D-乳酸的含量确定发酵终点。
到108 h发酵结束D-乳酸的量为70.00g/L。在整个发酵过程中D-乳酸的光学纯度达到80.0%。
实施例5
（1）将乳杆菌DMDL9010的冻干粉0.5g置于9mL的种子培养基中，于30℃静止培养24h，制成第一次种子液；
（2）以体积比为10：100的比例，将第一次活化液接入种子培养基中，于30℃静止培养24h，制成第二次种子液；
（3）以体积比为10：100的比例，将第二次活化液接入种子培养基中，于30℃静止培养24h，制成第三次种子液；
（4）以体积比为5：100的比例，将第三次种子液接入到发酵培养基中，于30℃下，在搅拌转速为100~150rpm的发酵罐中进行培养，发酵过程中均分2次加入已灭菌的共计20 g/L的Ca（OH）2，每发酵24 h后以2.0 ml/min的流速加入已灭菌的40 %（wt）的NaOH溶液，调节pH为6.2，发酵时间为120 h。
种子培养基的配方为：葡萄糖22g/L，蛋白胨9g/L，牛肉膏12g/L，酵母粉6g/L，乙酸钠0.75 g/L，柠檬酸三胺2.5 g/L，吐温80 1.2 mL/L，MgSO4.7H2O 0.25 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，MnSO4·4H2O 0.08 g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.2，用0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃备用。
发酵培养基的配方为：糖度为20.0 %的葡萄糖液750 mL，蛋白胨9 g，酵母粉6 g，牛肉膏12 g/L，葡萄糖22 g/L，柠檬酸三胺2.5 g/L，MgSO4.7H2O 0.25 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，MnSO4·4H2O 0.08 g/L，乙酸钠0.75 g/L，吐温80 1.2 mL/L，抗坏血酸0.35 g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.2，用0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃，加入10mL/L的95%（wt.）乙醇，搅拌均匀后备用。
葡萄糖液的制备方法为：以重量计，葡萄糖以200g/L加入到水中，溶解后备用，用折光仪测定波美度，为20 %。
利用手性柱高效液相色谱法测定D-乳酸的含量确定发酵终点。
到120 h发酵结束D-乳酸的量为82.50g/L。在整个发酵过程中D-乳酸的光学纯度达到89.5%。
实施例6
（1）将乳杆菌DMDL9010的冻干粉1.0 g置于10 mL的种子培养基中，于30 ℃静止培养24 h，为第一次种子液；
（2）以体积比为10：100的比例，将第一次活化液接入种子培养基中，于30 ℃静止培养24 h，制成第二次种子液；
（3）以体积比为10：100的比例，将第二次活化液接入种子培养基中，于30 ℃静止培养24 h，制成第三次种子液；
（4）以体积比为5：100的比例，将第三次种子液接入到发酵培养基中，于30 ℃下，搅拌转速为100~150 rpm的发酵罐中进行培养，发酵过程中均分2次加入已灭菌的共计20 g/L的CaCO3，每发酵12 h后以2.0 ml/min的流速加入已灭菌的40 %（wt）的氨水，调节pH为6.7，发酵时间为144 h。
种子培养基的配方为：葡萄糖19 g/L，蛋白胨10.5 g/L，牛肉膏13 g/L，酵母粉4 g/L，乙酸钠0.6 g/L，柠檬酸三胺1.8 g/L，吐温80 0.6 mL/L，MgSO4.7H2O 0.28 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，MnSO4·4H2O 0.04 g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.7，用0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃备用。
发酵培养基的配方为：糖度为25.0 %的马铃薯淀粉水解液600 mL，蛋白胨10.5 g，酵母粉4 g，牛肉膏13 g/L，葡萄糖19 g/L，柠檬酸三胺1.8 g/L，MgSO4.7H2O 0.28g/L，K2HPO4 1.5 g/L，MnSO4·4H2O 0.04 g/L，乙酸钠0.6 g/L，吐温80 0.6 mL/L，抗坏血酸0.22 g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.7，用0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃，加入7.5mL/L的95%（wt.）乙醇，搅拌均匀后备用。
马铃薯淀粉水解液为：将150目的马铃薯淀粉加水配制成体积百分比为30 %的溶液，以每100克干淀粉加入α-淀粉酶0.03mL，在70 ℃保温30 min，然后在90~100 ℃液化60 min，降温至60~65 ℃，加入糖化酶0.15mL，于60~65 ℃保温60 min后离心取上清液，糖度为25.3%。
利用手性柱高效液相色谱法测定D-乳酸的含量确定发酵终点。
到144h发酵结束D-乳酸的量为87.50g/L。在整个发酵过程中D-乳酸的光学纯度达到89.4%。
实施例7
（1）将乳杆菌DMDL9010的冻干粉0.5 g置于9 mL的种子培养基中，于20 ℃静止培养24 h，为第一次种子液；
（2）以体积比为10：100的比例，将第一次活化液接入种子培养基中，于20 ℃静止培养24 h，制成第二次种子液；
（3）以体积比为10：100的比例，将第二次活化液接入种子培养基中，于20 ℃静止培养24 h，制成第三次种子液；
（4）以体积比为5：100的比例，将第三次种子液接入到发酵培养基中，于20 ℃下，搅拌转速为100~150 rpm的发酵罐中进行培养，发酵过程中均分2次加入已灭菌的共计20 g/L的CaCO3，每发酵12 h后以1.5 ml/min的流速加入已灭菌的40 %（wt）的氨水，调节pH为6.9，发酵时间为144 h。
种子培养基的配方为：葡萄糖16 g/L，蛋白胨8.5 g/L，牛肉膏10.5 g/L，酵母粉6.5 g/L，乙酸钠0.85 g/L，柠檬酸三胺1.2 g/L，吐温80 0.7mL/L，MgSO4.7H2O 0.18 g/L，K2HPO4 0.85 g/L，MnSO4·4H2O 0.03 g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.9，用0.10MPa灭菌20min，冷却至20℃备用。
发酵培养基的配方为：糖度为20.0%的混合糖液750mL，蛋白胨8.5 g，酵母粉6.5 g，牛肉膏10.5 g/L，葡萄糖16 g/L，柠檬酸三胺1.2 g/L，MgSO4.7H2O 0.18 g/L，K2HPO4 0.85 g/L，MnSO4·4H2O 0.03 g/L，乙酸钠0.85 g/L，吐温80 0.7 mL/L，抗坏血酸0.36 g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.9，用0.10MPa灭菌20min，冷却至20℃，加入12 mL/L的95%（wt.）乙醇，搅拌均匀后备用。
混合糖液的制备方法为：以重量百分比，将木糖、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖以：6：2：1：1的比例配制成20 %的溶液，测定混合糖液的糖度为20 %。
利用手性柱高效液相色谱法测定D-乳酸的含量确定发酵终点。
到144h发酵结束D-乳酸的量为68.5 g/L。在整个发酵过程中D-乳酸的光学纯度达到 85.6 %。
实施例8
（1）将乳杆菌DMDL9010的冻干粉0.1 g置于5 mL的种子培养基中，于30 ℃静止培养24 h，为第一次种子液；
（2）以体积比为10：100的比例，将第一次活化液接入种子培养基中，于30 ℃静止培养24 h，制成第二次种子液；
（3）以体积比为10：100的比例，将第二次活化液接入种子培养基中，于30 ℃静止培养24 h，制成第三次种子液；
（4）以体积比为5：100的比例，将第三次种子液接入到发酵培养基中，于30 ℃下，搅拌转速为100~150 rpm的发酵罐中进行培养，发酵过程中分2次加入已灭菌的共计20 g/L的CaCO3，每发酵24 h后以0.5 ml/min的流速加入已灭菌的40 %（wt）的NaOH溶液，调节pH为6.4，发酵时间为144 h。
种子培养基的配方为：葡萄糖17 g/L，蛋白胨11.5 g/L，牛肉膏14 g/L，酵母粉2.5 g/L，乙酸钠2.5 g/L，柠檬酸三胺1.6 g/L，吐温80 0.9 mL/L，MgSO4.7H2O 0.12 g/L，K2HPO4 3.0 g/L，MnSO4·4H2O 0.06 g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.4，用0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃备用。
发酵培养基的配方为：糖度为25.0%的甘蔗液600 mL，蛋白胨11.5 g，酵母粉2.5 g，牛肉膏14 g/L，葡萄糖17 g/L，柠檬酸三胺1.6 g/L，MgSO4.7H2O 0.12g/L，K2HPO4 3.0 g/L，MnSO4·4H2O 0.06 g/L，乙酸钠2.5 g/L，吐温80 0.9 mL/L，抗坏血酸0.23 g/L；制备方法为：称取上述原料用蒸馏水定容至1000mL，搅拌溶解均匀后调节pH为6.4，用0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃，加入16mL/L的95%（wt.）乙醇，搅拌均匀后备用。
甘蔗液的制备方法为：将甘蔗榨汁，调节pH为6.4，低温真空浓缩至糖度25 %。
利用手性柱高效液相色谱法测定D-乳酸的含量确定发酵终点。
到144 h发酵结束D-乳酸的量为65.00g/L。在整个发酵过程中D-乳酸的光学纯度达到80.3%。
<110> 华南理工大学
<120> 一种乳杆菌及利用其发酵生产D-乳酸的方法
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工引物
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<223> 上游引物 F8
<400> 1
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
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<223> 下游引物 R1492
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TACGYTACCTTGTTACGACT 20
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<212> RNA
<213>Lactobacillus pentosusCGMCC NO. 5172中的16S rDNA测序序列
<220>
<223>Lactobacillus pentosus中的16S rDNA同源片段
<400> 3
gcggctggtt cctaaaaggt taccccaccg actttgggtg ttacaaactc tcatggtgtg 60
acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac 120
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caaatgtaaa tcatgatgca agcaccaatc aataccagag ttcgttcgac ttgcatgtat 1440
a 1441
Claims (10)
1.一种乳杆菌，其特征在于，所述菌株为乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL9010，于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO. 5172。
2.一种利用权利要求1所述的乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL9010发酵生产D-乳酸的方法，其特征在于，包括如下步骤和工艺条件：
第一步：将乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL9010的冻干粉0.1~0.5g置于种子培养基中，每5~10 mL培养基加入冻干粉0.1~0.5g，于20~35℃静止培养20~28h，制成第一次种子液；
第二步：以体积比为5~10：100的比例，将第一次种子液接入种子培养基中，于20~35℃静止培养20~28h，制成第二次种子液；
第三步：以体积比为5~10：100的比例，将第二次种子液接入种子培养基中，于20~35℃静止培养20~28h，制成第三次活化液；
第四步：以体积比为（2~8）：100的比例，将第三步得到的第三次活化液接入到发酵培养基中，加入中和剂调节发酵培养基的pH为6.0~7.0，于20~35℃下，在搅拌转速为100~150rpm的发酵罐中发酵，得到D-乳酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的配方为：以重量份数计，蛋白胨0.8~1.2份，酵母粉0.2~0.8份，葡萄糖1.5~2.5份，柠檬酸三胺0.1~0.3份，七水合硫酸镁0.01~0.03份，牛肉膏0.5~1.5份，磷酸氢二钾0.05~0.35份，四水合硫酸锰0.001~0.009份，乙酸钠0.05~0.35份，吐温80 0.05~0.15份，蒸馏水92.8~96.7份；所述种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后用0.08~0.10MPa灭菌15~20min，冷却至20~35℃备用；所述种子培养基的pH为6.0~7.0。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：以重量份数计，糖度为15~25%的淀粉质水解液或生物质糖液60~80份，蛋白胨0.8~1.2份，酵母粉0.2~0.8份，牛肉膏0.5~1.5，葡萄糖1.5~2.5份，柠檬酸三胺0.1~0.3份，七水合硫酸镁0.01~0.03份，磷酸氢二钾0.05~0.35份，四水合硫酸锰0.001~0.009份，乙酸钠0.05~0.35份，吐温80 0.05~0.15份，抗坏血酸0.02~0.04份，蒸馏水10.8~35.9份；所述发酵培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后用0.08~0.10 MPa灭菌15~20 min，冷却至20~35 ℃，加入0.5~2.0份的95%的乙醇，搅拌均匀后备用；所述发酵培养基的pH为6.0~7.0。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述淀粉质水解液的制备方法为：将60~200目的淀粉质粉体加水配制成体积百分比为15~30%的溶液，以每100g干淀粉加入α-淀粉酶为0.02~0.04mL，在70~80℃保温30~40min，然后在90~100℃液化60~90min，降温至60~65℃，以每100g干淀粉加入糖化酶0.05~0.15mL，于60~65℃保温30~60min后离心取上清液即为淀粉质水解液；所述淀粉质粉体为玉米淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、大米粉或糙米粉中的一种或两种以上。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物质糖液为甘蔗糖液、蔗糖液、纤维素水解液、半纤维素水解液、半乳糖液或木糖液，以及由纤维二糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、核糖或山梨糖中的一种或两种以上糖组成的混合液。
7.根据权利要求2~6所述的方法，其特征在于，第四步中所述搅拌的过程中采用氧化还原电位的变化进行转速控制，使氧化还原电位为-150~-180，同时利用手性柱高效液相色谱法测定D-乳酸的含量确定发酵终点。
8.根据权利要求2~6任意一项所述的方法，其特征在于，第四步中发酵时间为108~144 h。
9.根据权利要求2~6任意一项所述的方法，其特征在于，所述中和剂为已灭菌的碱土金属氢氧化物、碱土金属碳酸盐或氨水中的一种或两种以上；所述中和剂加入的方式为一次性加入、分批加入或流加入；所述分批加入为每发酵12~24小时加入一次中和剂，每次加入量不超过发酵培养基总体积的0.5~1.0 %；所述流加入的流速为0.5~2mL/min。
10.根据权利要求2~6任意一项所述的方法，其特征在于，第三步所述第二次种子液与种子培养基的体积比为5：100，发酵温度为30℃；第一步、第二步和第三步的发酵温度均为30℃，培养时间均为24h。
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