CN102732576B - 以木质纤维素原料联产生物柴油与生物丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
一种以木质纤维素原料联产生物柴油与生物丁醇的方法，其特征是，木质纤维素原料经过机械粉碎与湿磨研磨预处理及纤维素酶水解获得糖化液，糖化液通过油脂微生物发酵结合酸热法菌体破碎和有机溶剂浸提获得微生物油脂，并以此为原料通过转酯化制备生物柴油；转酯化过程中的副产物粗甘油将被用作发酵原料生产丁醇，实现生物柴油与生物丁醇的联产。木质纤维素原料利用温和的机械粉碎与湿磨法研磨，提高其酶解率。在湿磨预处理过程中，采用粒子衍射方法对预处理效果进行判断，确定最适预处理终点。基因工程菌抗逆性能的提高，可以直接发酵生物柴油副产物粗甘油生产丁醇，同时提高了发酵液中丁醇的浓度，降低了丁醇的后续分离成本，提高了其经济性。
Description
技术领域
本发明属于生物化工及能源技术领域，特别设计一种以木质纤维素资源为原料联产生物柴油和生物丁醇的方法。
背景技术
随着化石能源的不断耗竭，利用可再生的木质纤维素原料生产生物燃料逐渐受到人们的重视。但是，由于木质纤维素原料复杂的物理化学结构，导致利用纤维素酶将木质纤维素原料水解成可发酵单糖前需要一定的预处理过程，以便打破纤维素与半纤维素及木质素间的致密结构，促进纤维素酶与纤维素结构的结合，进而促进酶解效率。传统的酸、碱及汽爆等方法虽然能够有效破坏木质纤维素原料的致密结构，提高酶解效率，但是剧烈的物理化学反应过程会造成部分单糖降解，一方面造成原料浪费，同时也会生成一些对后续发酵过程有抑制作用的副产物。专利CN101230546A公开了一种木质纤维素原料预处理方法，该方法首先将木质纤维素原料在50～200℃条件下进行稀酸处理，回收酸液后加碱利用球磨法进行进一步预处理。该工艺实施过程中需要进行酸碱回收，大大增加了生产成本。专利CN200810049574 通过预处理将原料粒径缩小为198～1651μm，糖得率0.514 g/g玉米秸秆，酶解时间长达3～25天。此外，专利CN102304550A利用湿磨对玉米芯及麦麸进行预处理，只是简单的利用湿磨次数说明预处理过程，该方法无法对研磨过程的最佳终点进行快速准确判断。本发明通过湿磨法减小原料颗粒粒径，提高其酶解速率，并利用粒子衍射法对90%以上颗粒粒径进行判断，快速确定湿磨终点，湿磨原料经过48小时纤维素酶水解，糖得率高达0.653 g/g玉米秸秆。
木质纤维素糖化液经油脂微生物发酵可生产微生物油脂，微生物油脂，主要成分为甘油三酯，在脂肪酸组成上同植物油类似，是生产生物柴油的潜在原料。生物柴油生产过程中同时会产生10%的甘油副产物，目前随着生物柴油产量的不断增大，副产物甘油的产量也迅速增加，如何有效利用生物柴油副产物甘油已成为生物柴油产业发展的一大难题，提高副产物甘油的高值化利用对于提高生物柴油产业经济性具有重要意义。文献报道，有些微生物能够以甘油为碳源生长并产生丁醇等有机溶剂，例如丙酮丁醇梭菌，巴斯德梭菌等。在生物柴油制备过程中，由于转酯化工艺的不同，不同来源生物柴油副产物甘油的成分差别很大。一般情况下，除含有85%左右的甘油之外，还含有甲醇及盐等。因此，在以粗甘油为原料进行生物丁醇发酵过程中，除甘油浓度对微生物生长及溶剂产生有影响之外，复杂的杂质成分也会抑制和影响微生物生长及溶剂的积累。
如果能够直接利用生物柴油副产物粗甘油发酵生产生物丁醇，则可同时提高生物柴油及生物丁醇产业的经济性（如图1），该技术的实施在提高两大产业经济性的同时必能促进生物能源产业的发展。
发明内容
本发明目的在于提供一种以木质纤维素资源为原料联产生物柴油和生物丁醇的方法，属于生物化工及能源技术领域。木质纤维素经过机械研磨和湿磨预处理并利用纤维素酶水解获得糖化液，通过发酵生产微生物油脂，并以此为原料通过转酯化制备生物柴油并副产粗甘油。转酯化过程中的副产物粗甘油将被用作生物丁醇生产菌的原料，通过发酵生产丁醇，实现生物柴油与生物丁醇的联产。
副产物粗甘油直接用作生物丁醇生产菌的原料，该过程节省了粗甘油分离提纯的费用，有效降低了生产成本，通过粗甘油发酵生产丁醇，实现生物柴油与生物丁醇的联产，有效提高了原料及副产物粗甘油的利用率，降低了生产成本。
本发明采用的技术方案是：一种以木质纤维素原料联产生物柴油与生物丁醇的方法，其特征是木质纤维素原料首先经过机械粉碎成1~2 mm的粉末，然后利用湿磨法进行研磨并将研磨后的原料利用纤维素酶进行水解，获得糖化液；以糖化液为原料利用产油脂微生物发酵生产微生物油脂并收集菌体和提取微生物油脂，再以此为原料通过转酯化制备生物柴油；而转酯化过程中的副产物粗甘油通过保藏编号为CCTCC M 2012109巴斯德梭菌SE-6发酵生产生物丁醇，实现生物柴油与生物丁醇的联产。
本方案的具体特点还有，木质纤维素原料包括玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆及枝桠中的一种或几种。
所述湿磨法是指木质纤维素原料利用MKCA6-2型号磨盘(日本增幸产业株式会社)进行研磨，上下磨盘的间隙控制在2-4 μm；湿磨预处理原料的预处理效果利用激光粒度分析仪进行粒度分析，当占湿磨研磨原料90%以上颗粒粒径为20~60μm时，停止研磨过程，进行纤维素酶水解。
所述利用纤维素酶进行水解是指在10%（w/v；干物质含量为10%）酶解体系中加入16 FPU 支顶孢霉复合纤维素酶(日本明治株式会社)每克干物质；混匀后在50℃条件下，200rpm旋转震荡水解48h。
丁醇发酵是以生物柴油转酯化过程的副产物粗甘油为原料，粗甘油未经任何提纯和净化处理。
所述的利用巴斯德梭菌SE-6发酵生物柴油副产物粗甘油产丁醇的发酵过程，控制温度30～35℃；pH值在6.0～6.5。
一种以木质纤维素原料联产生物柴油与生物丁醇的方法，其特征是它包括如下步骤：
第一步，木质纤维素原料通过湿磨预处理，当90%以上颗粒粒径为20～60μm时利用纤维素酶水解制备糖化液；
第二步，以木质纤维素水解液为碳源，利用土生假丝酵母 ATCC 96219（购自美国标准微生物品保藏中心）发酵生产微生物油脂；
第三步，利用管式离心机收集菌体，通过酸热法破碎菌体，然后利用有机溶剂回收微生物油脂；
第四步，微生物油脂通过转酯化反应，制备生物柴油并副产甘油；
第五步，在丁醇发酵培养基中加入甘油10～60 g/L，121℃蒸汽灭菌30min，凉至室温；其中，硫酸亚铁经无菌过滤后加入到丁醇发酵培养基中；
第六步，通过自动控制，温度30～35℃；控制pH值在6.0～6.5；同时，在发酵开始前通入氮气，驱走发酵罐内氧气并接入巴斯德梭菌SE-6（CCTCC M 2012109），进行丁醇发酵。
本发明首先利用机械粉碎与湿磨研磨相结合的方法对木质纤维素原料进行研磨处理，湿磨研磨过程中逐渐调整磨盘间隙至2μm，研磨效果利用LA-950 激光粒度分析仪(日本京都堀场株式会社)进行分析，当占原料90%以上颗粒粒径在20~60μm时停止湿磨预处理过程。经过预处理的原料利用纤维素酶水解，获得糖化液进行微生物油脂发酵。油脂微生物菌体利用管式离心机（辽阳天圣达制药机械有限公司）进行收集，并通过热酸法提取微生物油脂，进而通过转酯化工艺制备生物柴油。将土生假丝酵母菌等油脂微生物接入含有木质纤维素糖化液的培养基中，同时流加浓缩水解液使发酵液中糖浓度控制在60 g/L。并采用10M氢氧化钠溶液控制pH值为5.8，发酵结束时经菌体破碎、浸提等步骤获得微生物油脂。微生物油脂经过转酯化反应制备生物柴油，同时获得副产物甘油。同时，本发明采用转酯化得到的副产物粗甘油为原料，利用产丁醇微生物进行发酵生产丁醇，生物柴油生产过程中分离的副产物粗甘油无需进一步处理即可作为发酵生产丁醇的底物。将巴斯德梭菌等产丁醇微生物接入含有生物柴油副产物粗甘油的种子培养基中，30～35℃培养16～20h，将种子液加入含有生物柴油副产物粗甘油的初始发酵培养基30～35℃厌氧发酵，同时流加生物柴油副产物粗甘油使发酵液中甘油浓度控制在20～60g/L。并采用10M氢氧化钠溶液控制pH值为6.0～6.5，发酵生产生物丁醇并副产1，3-丙二醇（PDO）、乙醇等。
巴斯德梭菌SE-6（CCTCC M 2012109）是通过在巴斯德梭菌中构建PHB（聚β-羟基丁酸）代谢途径获得；巴斯德梭菌SE-6（Clostridium pasteurianum SE-6）保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号 CCTCC NO：M 2012109，该菌株的耐受性较之出发菌株有了明显提高，在粗甘油中的生长速率要高于出发菌株，尤其当粗甘油浓度达到120g/L以后，巴斯德梭菌SE-6的生长速率比出发菌株提高了40%；当丁醇浓度为25 g/L时，巴斯德梭菌SE-6生长速率比出发菌株提高了30%，因此巴斯德梭菌SE-6可以直接以粗甘油为碳源进行发酵生产丁醇。
本发明原料粒径小于100μm，糖得率可达0.653 g/g玉米秸秆，酶解时间为48h，本发明利用激光粒度分析仪对粒径分布进行分析，操作简单，可随时对原料进行分析，在最佳效果时及时终止预处理过程，有效节省时间和研磨能耗。
专利CN200510011867.8发酵生物柴油副产物粗甘油生产1,3-丙二醇，通过流加粗甘油保持发酵液中甘油浓度为30g/L，而本发明由于基因工程菌抗逆性的增强，当甘油浓度保持在60g/L时，发酵过程基本不受影响，丁醇浓度与甘油浓度为30g/L时基本一样。专利CN101311272A利用木薯为原料进行丁醇发酵，最终发酵液中的丁醇浓度为12.5g/L，而本发明由于基因工程菌抗逆性的增强，以生物柴油副产物粗甘油发酵产丁醇的发酵液中，丁醇浓度高达16.8 g/L，增加了发酵强度，同时也降低了分离成本。
本发明的有益效果：
1、本发明利用机械粉碎与湿磨研磨法对原料进行预处理，结合纤维素酶水解获得木质纤维素原料糖化液。该方法不需要酸、碱等化学试剂，同时反应条件温和，不会生成对后续发酵有抑制作用的副产物；此外，湿磨预处理过程以水作为介质，因此预处理过程亦不会产生废水。
2、利用粒径分布分析方法对预处理终点进行快速、准确判断，便于工艺的工业化推广应用。
3、利用高耐受性基因工程菌直接以副产物粗甘油为原料发酵生产丁醇，无需对粗甘油进行处理，降低了生产成本。同时，丁醇浓度高于传统单糖丁醇发酵工艺，大大降低后续产物分离成本。
4、本发明直接以副产物粗甘油为原料发酵生产丁醇，实现生物柴油与生物丁醇的联产，即提高了生物柴油产业的经济性，又为生物丁醇生产提供了廉价原料。
巴斯德梭菌SE-6（Clostridium pasteurianum SE-6），它是是通过在巴斯德梭菌中构建PHB（聚β-羟基丁酸）代谢途径获得；该菌株已于2012年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号 CCTCC NO：M 2012109（Clostridium pasteurianum SE-6）。首先于2010年11月于山东济南郊区牛粪中分离产丁醇菌株巴斯德梭菌，之后于2011年12月通过基因工程改造获得基因工程菌巴斯德梭菌SE-6，并保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。
附图说明
图1为本发明工艺过程示意图。
具体实施方式
实施例1：
（ⅰ）玉米秸秆水解
将玉米秸秆用粉碎机粉碎成1~2 mm的粉末。将500g的1~2 mm的玉米秸秆粉与10 L水混匀，4℃下放置3天，其中每天搅拌两次使之混匀。利用湿磨进行研磨，在研磨过程中调节磨盘间隙最终为2 μm，循环处理原料并在每个循环取样利用LA-950 激光粒度分析仪(日本京都堀场株式会社)进行粒度分析。当90%以上原料颗粒粒径小于20μm时，在10%（w/v;干物质含量为10%）酶解体系中加入16 FPU 支顶孢霉复合纤维素酶(日本明治株式会社) 每克干物质；混匀后在50℃条件下，200rpm旋转震荡水解48h，还原糖得率为0.653 g/g玉米秸秆。
（ⅱ）微生物油脂生产
⑴ 菌种：土生假丝酵母 ATCC 96219（购自美国标准微生物品保藏中心）
⑵ 培养基：
| 培养基成分 | 种子培养基（g/L） | 发酵培养基（g/L） |
| 水解液（可发酵糖） | 20 | 60 |
| 酵母粉 | 10 | 10 |
| 蛋白胨 | 10 | 10 |
⑶ 发酵方式
① 种子培养：将土生假丝酵母菌接入种子培养基中（2L 三角瓶，装液量400mL），培养温度30℃，摇床200rpm培养20h。
② 发酵培养：发酵培养采用5L搅拌式发酵罐，装液量3.1L，培养温度30℃，用 10 M氢氧化钠控制PH值5.8。将种子液按5%比例接入含60g/L可发酵糖的初始发酵培养基中，通过流加浓缩水解液使发酵液中糖浓度控制在60 g/L（共计可发酵糖800g）。发酵过程通空气好氧发酵，保持溶氧在30%。
⑶ 发酵结束，利用管式离心机收集菌体，并利用热酸法（每克干菌体加6 mL 4M的盐酸沸水浴消化10 min）破壁和有机溶剂（每克干菌体加6 mL甲醇与氯仿的混合溶液，甲醇与氯仿的比例为1:2）提取微生物油脂，干菌体油脂含量68.7%，油脂得率0.23。
⑷ 利用氢氧化钠催化转酯化工艺制备生物柴油，副产甘油。
（ⅲ）丁醇发酵
⑴ 菌种：巴斯德梭菌SE-6（CCTCC M 2012109）
⑵ 培养基：
| 培养基成分 | 种子培养基（g/L） | 培养基成分 | 发酵培养基（g/L） |
| 甘油 | 10.0 | 酵母粉 | 1.0 |
| 蛋白胨 | 1.0 | 磷酸二氢钾 | 0.5 |
| 牛肉粉 | 1.0 | 磷酸氢二钾 | 0.5 |
| 酵母粉 | 0.3 | 乙酸铵 | 2.2 |
| 葡萄糖 | 0.5 | 硫酸镁 | 0.2 |
| 可溶性淀粉 | 0.1 | 硫酸锰 | 0.01 |
| 氯化钠 | 0.5 | 氯化钠 | 0.01 |
| 醋酸钠 | 0.3 | 对氨基苯甲酸 | 0.001 |
| L-半胱氨酸盐酸盐 | 0.05 | 维生素B1 | 0.001 |
| 生物素 | 0.00001 | ||
| 硫酸亚铁 | 0.01 |
⑶ 发酵方式：
一级种子：将巴斯德梭菌SE-6接入含有20g/L生物柴油副产物甘油的种子培养基中（500 mL 接种瓶，装液量400mL），培养温度35℃，静置培养16 h，种子接入前通氮气驱除罐中的氧气。
二级种子：将一级种子按3%转接到含有20g/L生物柴油副产物甘油的二级种子培养基中（3L 不锈钢接种瓶，装液量2.5L），培养温度30℃，静置培养20 h，种子接入前通氮气驱除罐中的氧气。
② 发酵培养：发酵培养采用30L搅拌式发酵罐，装液量25L，培养温度30℃，用10 M氢氧化钠控制pH值6.5。将种子液接入含30g/L生物柴油副产物粗甘油的初始发酵培养基中，发酵过程通过流加生物柴油副产物粗甘油控制发酵液中甘油浓度为30g/L。发酵过程采用厌氧发酵，种子接入前通氮气驱除罐中的氧气。
⑷ 发酵结束时发酵液中丁醇浓度14.9 g/L，丁醇的摩尔得率为0.27。
实施例2：
（ⅰ）玉米秸秆水解
本实施例与实施例1相同之处不再赘述，不同之处是当90%以上原料颗粒粒径小于30μm时停止湿磨，湿磨原料经纤维素酶水解，还原糖得率为0.647g/g玉米秸秆。
（ⅱ）微生物油脂生产
⑴ 菌种、培养基及发酵工艺同实施例1。
⑵ 利用转酯化工艺制备生物柴油，副产甘油。
（ⅲ）丁醇发酵
⑴ 菌种、培养基同实施例3。
⑵ 发酵方式：
① 种子培养：
一级种子：将巴斯德梭菌SE-6接入含有20g/L生物柴油副产物甘油的种子培养基中（500 mL 接种瓶，装液量400mL），培养温度35℃，静置培养16 h，种子接入前通氮气驱除罐中的氧气。
二级种子：将一级种子按3%转接到含有20g/L生物柴油副产物甘油的二级种子培养基中（3L 不锈钢接种瓶，装液量2.5L），培养温度35℃，静置培养18 h，种子接入前通氮气驱除罐中的氧气。
② 发酵培养：发酵培养采用30L搅拌式发酵罐，装液量25L，接种量为5%，培养温度35℃，用10 M氢氧化钠控制pH值6.0。将种子液接入含30g/L生物柴油副产物粗甘油的初始发酵培养基中，发酵过程通过流加生物柴油副产物粗甘油控制发酵液中甘油浓度为30g/L。发酵过程采用厌氧发酵，种子接入前通氮气驱除罐中的氧气。
⑶ 发酵结束时发酵液中丁醇浓度16.8 g/L，丁醇的摩尔得率为0.32。
实施例3：
（ⅰ）玉米秸秆水解
本实施例与实施例1相同之处不再赘述，不同之处是当90%以上原料颗粒粒径小于60μm时停止湿磨，湿磨原料经纤维素酶水解，还原糖得率为0.502g/g玉米秸秆。
（ⅱ）微生物油脂生产
⑴ 菌种、培养基及发酵工艺同实施例1。
⑵ 利用转酯化工艺制备生物柴油，副产甘油。
（ⅲ）丁醇发酵
① 种子培养：将巴斯德梭菌SE-6接入含有20g/L生物柴油副产物粗甘油的种子培养基中（500mL 蓝口瓶，装液量400mL），培养温度35℃，静置培养18h，种子接入前通氮气驱除罐中的氧气。
② 发酵培养：发酵培养采用5L搅拌式发酵罐，装液量4L，接种量为5%，培养温度35℃，用氢氧化钠控制pH值6.0。将种子液接入含60 g/L生物柴油副产物甘油的初始发酵培养基中，发酵过程通过流加生物柴油副产物粗甘油控制发酵液中甘油浓度为60g/L。发酵过程采用厌氧发酵，种子接入前通氮气驱除罐中的氧气。
⑶ 发酵结束时发酵液中丁醇浓度16.3 g/L，丁醇的摩尔得率为0.32。
Claims (7)
1.一种以木质纤维素原料联产生物柴油与生物丁醇的方法，其特征是木质纤维素原料首先经过机械粉碎成1~2 mm的粉末，然后利用湿磨法进行研磨并将研磨后的原料利用纤维素酶进行水解，获得糖化液；以糖化液为原料利用产油脂微生物发酵生产微生物油脂并收集菌体和提取微生物油脂，再以此为原料通过转酯化制备生物柴油；而转酯化过程中的副产物粗甘油通过保藏编号为CCTCC NO.M 2012109巴斯德梭菌SE-6发酵生产生物丁醇，实现生物柴油与生物丁醇的联产；所述的巴斯德梭菌SE-6（Clostridium pasteurianum SE-6）保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏日期2012年 4 月 11日，保藏编号 CCTCC NO.M 2012109。
2.根据权利要求1所述的以木质纤维素原料联产生物柴油与生物丁醇的方法，其特征是木质纤维素原料包括玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆及枝桠中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的以木质纤维素原料联产生物柴油与生物丁醇的方法，其特征是所述湿磨法是指木质纤维素原料利用磨盘进行研磨，上下磨盘的间隙控制在2-4 μm；湿磨预处理原料的预处理效果利用激光粒度分析仪进行粒度分析，当占湿磨研磨原料90%以上颗粒粒径为20~60μm时，停止研磨过程，进行纤维素酶水解。
4.根据权利要求1所述的以木质纤维素原料联产生物柴油与生物丁醇的方法，其特征是所述利用纤维素酶进行水解是指在干物质含量为10%的酶解体系中加入16 FPU 支顶孢霉复合纤维素酶每克干物质；混匀后在50℃条件下，200rpm旋转震荡水解48h。
5.根据权利要求1所述的以木质纤维素原料联产生物柴油与生物丁醇的方法，其特征是丁醇发酵是以生物柴油转酯化过程的副产物粗甘油为原料，粗甘油未经任何提纯和净化处理。
6.根据权利要求1所述的以木质纤维素原料联产生物柴油与生物丁醇的方法，其特征是所述的利用巴斯德梭菌SE-6发酵生物柴油副产物粗甘油产丁醇的发酵过程，控制温度30～35℃；pH值在6.0～6.5。
7.根据权利要求1所述的以木质纤维素原料联产生物柴油与生物丁醇的方法，其特征是它包括如下步骤：
第一步，木质纤维素原料通过粉碎和湿磨预处理，当90%以上颗粒粒径为20～60μm时利用纤维素酶水解制备糖化液；
第二步，以木质纤维素水解液为碳源，利用土生假丝酵母（Cryptococcus curvatus）美国标准微生物品保藏中心ATCC 96219发酵生产微生物油脂；
第三步，利用管式离心机收集菌体，通过酸热法破碎菌体，然后利用有机溶剂回收微生物油脂；
第四步，微生物油脂通过转酯化反应，制备生物柴油并副产甘油；
第五步，在丁醇发酵培养基中加入甘油10～60 g/L，121℃蒸汽灭菌30min，凉至室温；其中，硫酸亚铁经无菌过滤后加入到丁醇发酵培养基中；
第六步，通过自动控制，温度30～35℃；控制pH值在6.0～6.5；同时，在发酵开始前通入氮气，驱走发酵罐内氧气并接入巴斯德梭菌SE-6CCTCC NO.M 2012109，进行丁醇发酵。
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2012
- 2012-06-15 CN CN2012101977414A patent/CN102732576B/zh active Active
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102732576A (zh) | 2012-10-17 |
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