CN102154249A - 一种生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法 - Google Patents

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王春丽
钞亚鹏
马丽娟
马延和
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本发明公开了一种生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法，其中采用：重量百分比为碳源2％～8％，有机氮源0.1～5％，无机氮源浓度为0～2％，无机盐0.0001～10％，pH调节为3.0～5.0，温度控制为20～40℃，转速控制在100～250转/分，进行深层液态发酵，发酵时间为60～200小时。该方法的特征在于制得的β-葡萄糖苷酶活力高，成本低，质量稳定，无毒无污染，可在食品、医药以及生物能源等行业广泛应用，而且具有生产工艺简单，操作简便，原料来源容易，对环境无污染的优势，可用于大规模生产。

Description

一种生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法
技术领域
本发明属于微生物制造的技术领域，涉及一种生产高活力β-葡萄糖苷酶的发酵培养方法。
背景技术
随着不可再生的化石能源的日渐枯竭，越来越多的研究都集中到了新能源的开发和利用。生物质能由于其来源丰富，成本低廉和可再生性而备受青睐。纤维素作为地球上最为丰富的可再生资源，为生物质能提供丰富的来源。据报道，全球每年的光合作用产生的纤维素总量可达1011吨。但是，纤维素是由葡萄糖分子以1，4-糖苷键结合而成的线状高分子聚合物。纤维素分子难以直接被利用，需经过降解成小分子糖类物质后才可被利用。纤维素可直接通过酸、碱处理或通过酶法处理降解。酶法降解纤维素由于无污染、低能耗的优点而逐渐取代酸、碱处理方法。在利用纤维素酶降解纤维素的过程中，作为纤维素酶组分之一的β-葡萄糖苷酶可将由葡聚糖酶降解得到的纤维二糖水解成葡萄糖，从而去除其对葡聚糖酶的抑制作用，因而有效提高纤维素的降解效率。
除了在纤维素降解中的应用外，β-葡萄糖苷酶还有多种用途。在果汁行业中，人们利用β-葡萄糖苷酶对糖苷键的作用增加果汁的香气；在食品行业中，人们利用它对一些生氰物质降解以脱除食品加工原料的毒性。因此，对β-葡萄糖苷酶的研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效生产β-葡萄糖苷酶的培养方法，该方法是利用廉价的纤维素原料玉米芯生产的β-葡萄糖苷酶，酶活力水平达到国内领先水平。该菌株的培养方法所用原料成本低，易于获取，发酵周期短，产品质量稳定，能够用于工业化生产。
具体而言，本发明提供了一种生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法，包括以下步骤：
步骤一、制备菌种孢子悬浮液；
步骤二、将所述菌株孢子悬浮液接种于装有发酵培养液的250ml三角摇瓶中，所述发酵培养液中包含质量百分比为2％～8％的碳源、0.1％～5％的有机氮源、0～2％的无机氮源、以及0.0001％～10％的无机盐，且所述发酵培养液的PH值调节在3.0～5.0之间；
步骤三、在摇床上震荡旋转所述三角摇瓶，并使所述菌株在所述发酵培养液中发酵一定的时间。
优选的是，所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法中，在所述步骤一中，所述的菌种为黑曲霉，现保存于中国科学院微生物研究所普通菌种保藏中心，并且本发明使用的黑曲霉包括与之相关的所有可能变种。。
优选的是，所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法中，在所述步骤二中，所述发酵培养液的温度控制在26～30℃之间。
优选的是，所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法中，在所述步骤三中，所述容器的转速控制在100～250转/分。
优选的是，所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法中，在所述步骤三中，发酵时间控制为60～200小时。
优选的是，所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法中，还包括：步骤四，将发酵后的黑曲霉的发酵培养液在5000转/分下离心10分钟，并收集上清液为粗酶液，然后测定粗酶液中的β-葡萄糖苷酶活力。
优选的是，所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法中，所述碳源为：包含玉米芯、麸皮、玉米秸秆和/或小麦秸秆在内的纤维素原料；包含葡萄糖、木糖、乳糖、甘露糖和/或麦芽糖在内的糖；或糖醇，甘油；或有机酸，醋酸；或低分子醇，乙醇。
优选的是，所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法中，所述碳源质量百分比含量为3％～5％。
优选的是，所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法中，氮源为：所述有机氮源为酵母粉、蛋白胨、玉米浆、酵母膏和/或尿素；所述无机氮源为硫酸铵、氯化铵和/或硝酸铵。
优选的是，所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法中，所述发酵培养液中，所述有机氮源和所述无机氮源中总氮质量百分比含量为1％.
优选的是，所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法中，所述无机盐包括磷酸二氢钾，硫酸镁和/或氯化钙。
本发明提供的培养方法制得的β-葡萄糖苷酶活力水平高，成本低，质量稳定，无毒无污染，可在食品、医药以及生物能源等行业广泛应用，而且具有生产工艺简单，操作简便，原料来源容易，对环境无污染的优势，可用于大规模生产。
附图说明
图1为玉米芯浓度对产生的β-葡萄糖苷酶的活力的影响的示意图。
具体实施方式
待黑曲霉的孢子斜面长好后，制备孢子悬浮液，取孢子悬浮液接种于装有50ml发酵培养液的500ml摇瓶中，在转速为170转/分，培养温度为28±2℃的条件下培养168±24小时将发酵液在5000转/分下离心10分钟，收集上清液为粗酶液。
本发明使用的为天然的纤维素原料，有玉米芯，麸皮，玉米秸秆和麦秸秆等用粉碎机粉碎而成。
β-葡萄糖苷酶活力的测定所用底物为纤维二糖，一个酶活力单位定义为1分钟内转化1微摩尔纤维二糖所需的酶量。葡萄糖的浓度利用SBA-40C生物传感分析仪测定。β-葡萄糖苷酶活力的测定方法如下：
①向5毫升离心管中加入1毫升适当稀释的酶液。每个样品应至少包括2个稀释度的酶液，一个稀释度在反应条件下释放略少于1.0毫克的葡萄糖，另一稀释度则释放略高于1.0毫克的葡萄糖。同时做底物空白和酶液空白对照，计算时应减去底物和酶液空白中的葡萄糖量。
②将酶溶液加热至50℃，添加1.0毫升的底物溶液，混匀。
③在50℃水浴中反应30分钟。
④沸水浴5.0分钟，终止反应。
⑤冷却，通过生物传感分析仪SBA-40C测定葡萄糖的含量。
实例1：
以黑曲霉菌株(由中国科学院微生物研究所普通菌种保藏中心保藏)为供试菌株，将玉米芯用粉碎机粉碎，麸皮直接从面粉厂购买未进行粉碎处理，取2.0g不同原料加50毫升基本培养基溶液装入250毫升的三角瓶，于120℃灭菌15分钟，冷却后接种黑曲霉孢子悬浮液，于28～30℃，150～220转/分发酵7天，离心取上清液测定β-葡萄糖苷酶活力为23.9国际单位/ml。
发酵培养基：4％玉米芯，3％麸皮，酵母粉0～2.0％，(NH4)2SO4 0～1.0％，KH2PO4 0～1.0％，MgSO4·7H2O 0～0.2％，CaCl2·2H2O 0～0.2％，调节pH为4.0～5.0。
实例2：
将玉米芯、玉米秸秆以及小麦秸秆用粉碎机粉碎，麸皮直接从面粉厂购买未进行粉碎处理，实施方式同实例1，计算各个原料发酵培养的β-葡萄糖苷酶相对活力，如表1所示。
基础液体培养基：酵母粉0～2.0％，(NH4)2SO4 0～1.0％，KH2PO4 0～1.0％，MgSO4·7H2O 0～0.2％，CaCl2·2H2O 0～0.2％，调节pH为4.0～5.0。
表1不同纤维原料的产酶能力比较
Figure BDA0000057140910000041
黑曲霉能够利用玉米芯合成大量β-葡萄糖苷酶，相对酶活力为最高，为实例1的155％。而秸秆类物质虽然纤维素含量较高，但是其纤维结构比玉米芯致密，不易被菌体利用，因此不利于菌体生长及酶的分泌。对于黑曲霉CGMCC3.316菌株来说，麸皮的添加产生β-葡萄糖苷酶的活力较低。
实例2：
取不同量的玉米芯原料，实施方式同实例1，比较不同添加量的玉米芯的产酶能力，结果见图1。
基本液体培养基：同实例2
玉米芯的浓度为5％时，β-葡萄糖苷酶活力为43.96国际单位/毫升，比实例1培养提高了83.43％，高于或者低于5％时产酶水平将有不同程度的下降。
实例4：
根据实例3结果，以5％玉米芯为纤维素原料，将基础培养基中的酵母粉和硫酸铵的去掉，添加不同无机氮(包括硫酸铵，氯化铵，硝酸铵，硝酸钾，硝酸钠)和有机氮源(包括酵母粉，酵母膏，蛋白胨、玉米浆)或者二者混合，发酵方式同实例2，培养7天后测定酶活力，结果发现，对于来说，最佳的无机氮源是硫酸铵，单独添加时相对酶活力为88.9％；最佳的有机氮源是蛋白胨，当其与硫酸铵混合添加到培养基时，其β-葡萄糖苷酶活力的相对活力水平为284％，而且蛋白胨与氯化铵混合时，β-葡萄糖苷酶活力的相对活力水平为274％，仅次于硫酸铵和蛋白胨的混合，产酶能力处于国内领先水平。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备菌种孢子悬液；
步骤二、将所述孢子悬浮液接种于装有发酵培养液的容器中，所述发酵培养液中包含质量百分比为2％～8％的碳源、0.1％～5％的有机氮源、0～2％的无机氮源、以及0.0001％～10％的无机盐，且所述发酵培养液的PH值调节在3.0～5.0之间；
步骤三、将所述容器置摇床上震荡培养，并使所述菌株在所述发酵培养液中发酵一定的时间。
2.如权利要求1所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法，其特征在于，在所述步骤一中，所述菌种包括黑曲霉(Aspergillus niger)和其变种。
3.如权利要求1所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述发酵温度控制在26～30℃之间。
4.如权利要求2所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述容器的转速控制在100～250转/分。
5.如权利要求2所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法，其特征在于，在所述步骤三中，发酵时间控制为60～200小时。
6.如权利要求1所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法，其特征在于，所述碳源为：包含玉米芯、麸皮、玉米秸秆和/或小麦秸秆在内的纤维素原料；包含葡萄糖、木糖、乳糖、甘露糖和/或麦芽糖在内的糖；或糖醇，甘油；或有机酸，醋酸；或低分子醇，乙醇。
7.如权利要求1或6所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法，其特征在于，所述碳源质量百分比含量为3％～5％。
8.如权利要求1所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法，其特征在于，氮源为：所述有机氮源为酵母粉、蛋白胨、玉米浆、酵母膏和/或尿素；所述无机氮源为硫酸铵、氯化铵和/或硝酸铵。
9.如权利要求1或8所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法，其特征在于，所述发酵培养液中，所述有机氮源和所述无机氮源中总氮质量百分比含量为1％。
10.如权利要求1所述的生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法，其特征在于，所述无机盐包括磷酸二氢钾，硫酸镁和/或氯化钙。
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