CN111172233A - 一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法。该方法以天然动物皮为原料，制备含蛋白多糖复合物的皮粉底物；糖苷酶催化皮粉中蛋白多糖复合物水解并从皮粉中溶出，以单位时间内反应液中总糖的产生量来表征酶活力。本发明的糖苷酶活力表征方法包括以下步骤：（1）底物的制备；（2）糖苷酶活力的测定；（3）糖苷酶活力计算。本方法所用底物含与胶原结合紧密的、难以被普通酸碱破坏的动物皮中原有的蛋白多糖复合物，反应过程模拟了制革、制裘等动物皮加工过程中的固液反应，可以在较宽的pH范围测定不同糖苷酶的活力和性能，测定结果能为制革或制裘生产中糖苷酶的筛选、应用条件的优化和技术的开发提供指导。

Description

一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性 能评价方法

技术领域

本发明涉及糖苷酶的活力检测方法，具体涉及制革和制裘等动物皮加工利用领域中所使用的糖苷酶的活力测定和性能评价方法及其应用。

背景技术

蛋白多糖复合物，这里主要包括蛋白多糖和糖蛋白，是动物皮内纤维间质中的主要成分。它们能够使毛粘附于毛囊、胶原分子粘结形成胶原纤维。因此，在制革和制裘生产中必须去除这些物质，以便达到纤维分散和脱毛的效果。研究表明这些物质的去除与皮革或裘皮的质量紧密相关，这些物质的含量越低，皮革或裘皮的柔软度越好。

糖苷酶能特异性水解蛋白多糖复合物中的糖苷键，因此能在温和的条件下有效破坏并去除蛋白多糖复合物。另一方面，糖苷酶能够水解其中的糖链而不水解蛋白，比蛋白酶更安全。研究表明α-淀粉酶和α-半乳糖苷酶能够促进纤维分散，提高成革柔软度，木聚糖酶能够去除皮垢和皮上的色素，获得粒面洁白的皮革。实际上，能够水解糖苷键的糖苷酶是一个巨大的家族，有超过200类糖苷酶，因此具有巨大的开发潜力。可以从其中筛选合适的糖苷酶并开发更清洁、价廉、高效的去除蛋白多糖复合物的糖苷酶技术。

不同的糖苷酶对不同的蛋白多糖复合物具有水解特异性，包括糖苷键、组成糖苷键的糖基和糖基配体的特异性。为了筛选合适的糖苷酶应用于制革和制裘领域，需要评价具有不同底物特异性的糖苷酶对动物皮内蛋白多糖复合物的水解活力。但目前糖苷酶的活力测定和性能评价方法中使用的底物都是基于其应用领域如食品、饲料、纺织和酿造工业等，例如以淀粉为底物评价淀粉酶的活力，以滤纸为底物评价纤维素酶活力，以木聚糖为底物评价木聚糖酶活力。这些底物与动物原料皮中具有三维空间结构的胶原微原纤维复合在一起的蛋白多糖复合物结构差异巨大，因此现有方法并不能反映糖苷酶对皮内蛋白多糖复合物的实际去除效果，也不能指导其实际应用。此外，这些方法所测定的不同种类的糖苷酶活力之间不能相互比较。

发明内容

为填补目前尚未有适合制革、制裘等动物皮加工利用领域的糖苷酶活力测定方法的空白，使不同糖苷酶的水解效果具有可比性，本发明提供了一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法。该方法以含动物皮内原有的蛋白多糖复合物的皮粉为底物，通过测定糖苷酶水解皮粉中蛋白多糖复合物后反应液中可溶性总糖的增加量来表征酶活力。

本发明的另一目的在于根据所述检测糖苷酶活力的方法，从而优选出能有效去除皮内蛋白多糖复合物的糖苷酶，应用于制革和制裘生产过程，促进纤维分散和脱毛、促进制革和制裘清洁生产并获得高质量皮革或裘皮。

可实现上述发明目的一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法，包括以下步骤：

1）含蛋白多糖复合物皮粉底物的制备：

取保存较好的动物皮（如猪皮、羊皮和牛皮等，包括新鲜的、盐腌的或冷冻保存的动物皮等）100份，充分水洗，去肉、脱脂后剖层，取厚约0.5-1.5 mm的粒面层，称重后放入转鼓或振荡器中，加入清水100-400份，防腐剂0-0.5份，在15-25℃下浸泡或间隙转动3-12 h，再用300-500份水洗涤3次，每次30min，然后进行去毛，将皮切成小块，自然干燥或冷冻干燥后用皮革碾磨仪打成皮粉，并过50-150目筛，然后加入100-800份洗涤液反复洗涤，直到上清液中的总糖含量低于检测限，将皮粉再次干燥，得到含糖量0.01%-2%的皮粉底物；

2)糖苷酶活力的测定：

准确称取含蛋白多糖复合物的皮粉底物0.1-5 g，加入锥形瓶中，加入皮粉质量10-50倍的缓冲液，在水浴振荡器中于设定的温度下保温并振荡5-240 min使皮粉完全润湿；

将待测糖苷酶的样品用相应的缓冲溶液溶解，经过离心去除不溶性杂质，经过超滤和/或柱层析去除分子量低于5000Da的可溶性杂质，再将酶液稀释至适当的倍数，使酶液的活力浓度为1-50 U/mL，将酶液在预设的温度中预热5 min，然后加入1mL待测酶溶液，在设定温度下振荡反应0.5-4h，再加入1 mL的1-6 mol/L的硫酸溶液将pH值快速调至3.0以下，终止酶反应。空白对照样为在反应样的终止操作的同时，加入1mL1-6 mol/L硫酸溶液和1mL酶溶液，其他操作和酶反应实验完全相同；

反应终止后立即于转速5000-12000 rpm，温度4 ℃条件下离心10-20 min，取上清液用去离子水稀释至适当的倍数，然后按照以下方法测上清液中总糖含量；具体为：取2 mL 经适当稀释的样品，加入1mL 浓度为6%的苯酚溶液，混匀后立即沿试管壁以一定速度加入5mL浓硫酸，静置10 min后混匀，90℃保温静置30 min后，然后冷却至室温，测定490nm处吸光度值，并以稀释至不同浓度的葡萄糖溶液做出相应的标准曲线，根据标准曲线计算产物的量；

3）糖苷酶活力的计算

糖苷酶活力定义：1 g固体酶（或1 mL液体酶），在一定条件下（温度和pH值）水解皮粉中蛋白多糖复合物，每分钟产生1 μg总糖，即为1个活力单位，以U/g或U/mL表示；

糖苷酶活力U=

（U/g或U/mL）

式中

A₁：根据实验组OD值计算得到的反应样液中的总糖含量，μg/mL；

A₂：根据空白组OD值计算得到的反应样液中的总糖含量，μg/mL；

V：反应体系的总体积mL；

N：酶样品的稀释倍数。

上述技术方案中，用于制备底物皮粉的动物皮为各种适合制革和制裘用的原料皮，优选地选用动物皮中蛋白多糖复合物含量高的粒面层，即最上层处厚度约0.5-1.5mm的皮层。

上述技术方案中，制备的皮粉底物含有动物皮中原有的且结合牢固的蛋白多糖复合物，含糖量0.01%-2%，皮粉的目数为50-150目。

上述技术方案中，溶解酶和稀释酶液所用的缓冲液为伯瑞坦-罗宾森缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液或者Tris-HCl缓冲液；待测酶液经过离心、超滤和/或柱层析去除去除不溶性及分子量低于5000Da的可溶性杂质，特别是含糖成分的杂质。

上述技术方案中，底物用量为0.1-5g，最优用量为2g；反应时间为0-4小时，最优为2小时；加入糖苷酶溶液的活力浓度为1-50 U/mL，优选为5-35 U/mL； pH值为2-14；反应温度为5-55℃。

本发明还提供了一种上述方法的应用，上述方法适用于在制革、制裘等动物皮加工利用领域中测定各种糖苷酶对动物皮中的蛋白多糖复合物水解活力及性能。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明建立了一种表征糖苷酶活力的评价方法，解决了目前基于食品、饲料、酿造等领域的不同种类的具有不同水解特异性的糖苷酶活力测试中使用不同底物、活力结果相互之间不能比较的问题，填补了制革、制裘等动物皮加工利用领域中糖苷酶活力和性能表征方法的空白，拓宽了各种糖苷酶的应用领域。

底物针对性强，皮粉底物中的蛋白多糖复合物成分为动物皮中原有成分，反应条件与动物皮处理过程中酶对皮内蛋白多糖复合物作用的条件相近，测定结果对以动物皮为原料的制革、制裘等动物皮加工利用领域糖苷酶的选择和应用条件的优化具有指导意义。

该方法通过硫酸苯酚法测试糖苷酶破坏动物皮内蛋白多糖复合物而产生的可溶性总糖的质量变化，来表征糖苷酶对动物皮内蛋白多糖的作用效果，能对比不同糖苷酶对蛋白多糖复合物的溶出效果，测试过程简单。

适合的测定pH值范围广泛，能在pH2-14范围内对糖苷酶的活力进行测定和性能评价。

附图说明

图1是糖苷酶pH曲线 (30°C)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例1糖苷酶活力的测定

（1）含蛋白多糖复合物底物皮粉的制备

取保存完好的牛盐腌皮的腹肷部，充分水洗，去肉、脱脂并剖层，取厚约1 mm的粒面层，称重后放入转鼓中，每100份皮加入200份清水，0.01份防腐剂，于常温下间隙转动4小时，再加入500份水，水洗3次，每次30min，用剃毛机剃除毛，将皮剪成小块，冷冻干燥后用皮革碾磨仪打成皮粉，剃除小毛并过50-150目标准筛网，然后加入400份0.1 mol/L BR缓冲液反复洗涤，直到浴液中的总糖含量低于检测限，将皮粉再次干燥，得到皮粉底物。

将皮粉混合均匀后，从皮粉底物中随机称取6份，每份0.200 ±0.001 g，分别加入4 mL浓度为6 mol/L的HCl溶液在100℃条件下水解至皮屑消失，冷却后用去离子水定容至10 mL，然后经适当稀释，取2 mL稀释后的样品，加入1 mL 浓度为6%的苯酚溶液，混匀后立即沿试管壁以一定速度加入5 mL浓硫酸，静置10 min后混匀，90℃保温静置30min后，然后冷却至室温，测定490nm处吸光度值，根据葡萄糖浓度-吸光度标准曲线计算皮内糖类物质含量，结果如表1所示。

表1 皮粉内糖含量(%，基于干皮粉质量)

如表1所示，制备的皮粉中糖类含量为0.1979%，也即1g皮粉中含有1979μg蛋白多糖复合物，糖含量比较充分。而且皮粉中剩余的蛋白多糖复合物与胶原紧密结合，作为糖苷酶的底物，可针对性地测试糖苷酶对普通方法难以除去的蛋白多糖复合物的水解效果。测试结果的相对标准偏差低至2.15%，表明这些底物皮粉比较均匀。

（2）糖苷酶活力的测定（pH6.0，30℃）

准确称取黄牛皮粉2.000±0.001 g制备的皮粉于100mL锥形瓶中，加入pH值为6的0.1mol/L伯瑞坦-罗宾森缓冲液（B-R缓冲液）20mL，30℃水浴震荡2小时，确保皮粉充分润湿。

将待测糖苷酶的样品经pH值为6的0.1 mol/LB-R缓冲液溶解，经过离心去除不溶性杂质，经过bestdex G-25 盐析柱处理去除分子量低于5000Da的可溶性杂质，根据预实验测定的待测淀粉酶的活力结果，用相同的缓冲液将酶液再稀释至适当的倍数，使酶液的活力浓度为10-25 U/mL，酶液在30℃的水浴中预热5 min，加入1mL待测酶溶液，在30℃下振荡反应2h后，加入1 mL的6 mol/L的硫酸溶液将pH值快速调至3.0以下，终止酶反应。空白对照样为在反应样的终止操作的同时，加入1mL6 mol/L硫酸溶液和1mL酶溶液，其他操作和酶反应实验完全相同。

反应终止后立即离心(转速6000 rpm，4℃，10 min)，取上清液稀释至适当的倍数，然后按照以下方法测上清液中总糖含量。具体为：取2 mL经适当稀释的样品，加入1mL浓度为6%的苯酚溶液，混匀后立即沿试管壁以一定速度加入5 mL浓硫酸，静置10 min后混匀，90℃保温静置30 min后，然后冷却至室温，测定490nm处吸光度值（OD值），并以稀释至不同浓度的葡萄糖标准溶液做出相应的标准曲线，根据葡萄糖浓度-吸光度标准曲线计算产物中的总糖量。然后根据发明内容中的酶活力计算公式计算糖苷酶活力。基于建立的方法的几种商业糖苷酶的活力结果如表2所示。

表2 糖苷酶活力 (U/g, 30 ^oC, 2 h, pH 6.0)

表2表明这些糖苷酶的活力不同，虽然这些糖苷酶具有不同的糖苷键水解特异性，但是基于该方法测定的不同种类的糖苷酶活力可以相互比较，而且同一种酶最终测试结果相对偏差较小。因此，为了筛选能够高效去除动物皮中与胶原蛋白紧密结合的蛋白多糖复合物的糖苷酶应用于制革、制裘等动物皮加工利用领域，建立这种方法是必要的。

实施例2 pH值对糖苷酶活力的影响

底物的制备同实施例1中底物的制备。

制备不同pH值的系列缓冲溶液(0.1mol/L的伯瑞坦-罗宾森缓冲液)，测定几类糖苷酶在不同pH条件下的酶活力。测定过程中，只是加入的缓冲溶液pH值不同，其他操作和实施例1中的操作相同。

几种具有不同糖苷键水解特异性的糖苷酶的pH值-酶相对活力曲线见附图1。

由附图1可知，pH值作为实际生产过程中重要的控制条件，其大小直接影响糖苷酶的活力。这些糖苷酶的最适pH值偏酸性，其中淀粉酶和β-半乳糖苷酶的最适pH值为6，其余几种糖苷酶如木聚糖酶、纤维素酶和葡聚糖酶的最适pH值大约为5。说明这些酶更适合用于弱酸性和中性条件下，尤其适合于制裘生产。但是除了木聚糖酶外，大多数酶在pH值为9时仍然能够保持40%以上活力。因此在实际生产中，也可以应用于浸水、脱灰、软化工序等弱碱性条件中。此外，也能够与中性蛋白酶复合在中性条件下脱毛。

实施例3糖苷酶活力与制革生产中糖苷酶浸水效果的关系

选择经盐腌牛皮的皮心部位，分成4块，去肉并充分水洗，称重。分别放入不同的转鼓中，按照动物皮质量，每100份皮加入200份水，调节pH值为6，加入不同用量的糖苷酶，保持转鼓温度为30℃，转动4小时后静置过夜，第二天转动30分钟后，取废液离心，然后取上清液稀释至合适倍数，测定废液中总糖的含量。将上述皮按照常规制革工艺制备得到加脂蓝皮，按照标准方法采用柔软度测定仪测定这些皮块的柔软度，结果如表3所示。

表3糖苷酶活力浓度、废液中总糖含量与成革柔软度的关系

表3表明，糖苷酶处理皮块后，废液中的总糖含量与糖苷酶活力呈正相关，酶活力越大，对皮内蛋白多糖复合物的破坏效果越强，废液中糖含量越高，而且成革越柔软。因此，基于皮粉的糖苷酶活力测试方法适合于制革业中对糖苷酶的筛选和性能评价，对于实际应用具有指导意义。

Claims (7)

1.一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法，其特征在于所述方法包括以下步骤，所用材料按照质量份计；

（1）含蛋白多糖复合物皮粉底物的制备

取保存较好的动物皮100份，充分水洗，去肉、脱脂后剖层，取厚约0.5-1.5 mm的粒面层，称重后放入转鼓或振荡器中，加入清水100-400份，防腐剂0-0.5份，在15-25 ℃下浸泡或间隙转动3-12 h，再用300-500份水洗涤3次，每次30 min，然后进行去毛，将皮切成小块，自然干燥或冷冻干燥后用皮革碾磨仪打成皮粉，并过50-150目筛，然后加入100-800份洗涤液反复洗涤，直到上清液中的总糖含量低于检测限，将皮粉再次干燥，得到含糖量0.01%-2%的皮粉底物；

（2）糖苷酶活力的测定

准确称取含蛋白多糖复合物的皮粉底物0.1-5g，加入锥形瓶中，加入皮粉质量10-50倍的缓冲液，在水浴振荡器中于设定温度下保温并振荡5-240 min使皮粉完全润湿；

将待测糖苷酶的样品用相应的缓冲溶液溶解，经过离心去除不溶性杂质，经过超滤和/或柱层析去除分子量低于5000 Da的可溶性杂质，再将酶液稀释至适当的倍数，使酶液的活力浓度为1-50 U/mL，酶液在预设温度的水浴中预热5 min，加入1 mL待测酶溶液于锥形瓶中，在设定温度下振荡反应0.5-4 h后，加入1 mL的1-6 mol/L的硫酸溶液将pH快速调至3.0以下，终止酶反应；空白对照样是在反应样的终止操作的同时，加入1mL的1-6 mol/L硫酸溶液和1mL酶溶液，其他操作和酶反应实验完全相同；

反应终止后立即于转速5000-12000 rpm，温度4 ℃条件下离心10-20 min，取上清液稀释至适当的倍数，然后按照以下方法测上清液中总糖含量；具体为：取2 mL 经适当稀释的样品，加入1mL 浓度为6%的苯酚溶液，混匀后立即沿试管壁以一定速度加入5 mL浓硫酸，静置10 min后混匀，90℃保温静置30min后，然后冷却至室温，测定490 nm处吸光度值，并以稀释至不同浓度的葡萄糖标准溶液做出相应的标准曲线，根据标准曲线计算产物的量；

（3）糖苷酶活力的计算

糖苷酶活力定义：1g固体酶或1mL液体酶，在一定温度和pH值条件下水解皮粉中蛋白多糖复合物，每分钟产生1μg总糖，即为1个活力单位，以U/g或U/mL表示；

糖苷酶活力

（U/g或U/mL）

式中

A₁：根据实验组OD值计算得到的反应样液中的总糖含量，μg/mL；

A₂：根据空白组OD值计算得到的空白样液中的总糖含量，μg/mL；

V：反应体系的总体积mL；

N：酶样品的稀释倍数。

2.如权利要求1所述的一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定方法，其特征在于，用于制备底物皮粉的动物皮为各种适合制革和制裘用的原料皮，优选地选用动物皮中蛋白多糖复合物含量高的粒面层，即最上层处厚度约0.5-1.5 mm的皮层。

3.如权利要求1所述的一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法，其特征在于制备的皮粉底物含有动物皮中原有的且结合牢固的蛋白多糖复合物，含糖量0.01%-2%，皮粉的目数为50-150目。

4.如权利要求1所述的一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法，其特征在于，所述的溶解酶和稀释酶液所用的缓冲液为伯瑞坦-罗宾森缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液或者Tris-HCl缓冲液；待测酶液经过离心、超滤和/或柱层析去除不溶性及分子量低于5000Da的可溶性杂质，特别是含糖成分的杂质。

5.如权利要求1所述的一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法，其特征在于，测定条件为：底物用量为0.1-5 g，最优用量为2g；反应时间为0.5-4小时，优选为2小时；加入糖苷酶溶液的活力浓度为1-50 U/mL，优选为5-35 U/mL；pH值为2-14；反应温度为5-55℃。

6.如权利要求1所述的一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法，其特征在于，取保存较好的动物皮主要是猪皮、羊皮和牛皮等，包括新鲜的、盐腌的或冷冻保存的动物皮等。

7.如权利要求1-6所述的一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法及其应用，其特征在于，该方法适用于在制革、制裘等动物皮加工利用领域中测定各种糖苷酶对动物皮中的蛋白多糖复合物水解活力及性能。

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