CN108845133B - 一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价方法 - Google Patents

一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定方法及其应用，包括以下步骤：（1）铬鞣皮粉底物的制备：加入一定量的铬鞣剂对皮粉进行鞣制，再经充分洗涤、干燥、粉碎、过20‑200目筛；（2）制备待测反应液：向50‑200 mg铬鞣皮粉中加入1‑20 mL缓冲液，混匀，加热至测定温度，加入蛋白酶溶液0.1‑5.0mL，在测定温度下振荡反应，反应结束后离心，取上清液进行消解，消解液经稀释后即为待测反应液；（3）消解液中的羟脯氨酸浓度测定及酶活力计算。该方法适用于在皮革领域中表征蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的水解活力及蛋白酶对蓝湿革作用性能的评价。

Description

一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定方法及其应用，特别涉及一种表征蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的水解活力及蛋白酶对蓝湿革作用性能的评价方法，属于蛋白酶活力测定领域。
背景技术
随着对环境保护关注度的提高，越来越多的制革厂趋向于以购买蓝湿革作为生产原料。但是，购买的蓝湿革普遍存在皮革纤维结构分散不足、血筋和痘疤等伤残明显，不同来源的蓝湿革由于前处理工艺的不同导致的性能差异较大，在较长时间的储存和运输中导致的霉斑、色素、皮的板结、多皱纹和折痕等缺陷，严重影响后续加工工艺的统一和成革的性能及使用价值，因此，大多数以蓝湿革为原料的制革厂，在湿染整工段的第一个工序是对蓝湿革进行酶软化处理。
蓝湿革的酶软化过程是指用酶制剂处理蓝湿革中的蛋白、油脂和纤维间质等成分，最主要是用蛋白酶处理蛋白成分，来促进纤维结构的松散，减轻皮革粒面缺陷，达到增加成革均匀性、提高成革的柔软性、得革率和成革的物理机械性能和改善粒面感官性能等目的。因此，可以根据蓝湿革的状况和成革的性能要求，通过选择适当的酶制剂和软化工艺条件来控制处理程度，缩小不同来源的蓝湿革间的差异性，便于后处理工序的标准化，降低生产管理的难度。
动物皮中的主要蛋白成分是胶原蛋白，蓝湿革中的胶原蛋白纤维是被铬鞣后的胶原蛋白纤维，因此，蓝湿革的软化处理主要是用蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维进行作用，但是，经过良好铬鞣的胶原蛋白纤维有较高的耐酶性，而且，蛋白酶对铬鞣蛋白纤维的作用能力会受含铬量的影响，鞣制后的蛋白纤维对不同蛋白酶的耐受性也存在差异。目前，以酪蛋白、变性血清蛋白和明胶等为底物的蛋白酶活力的测定方法，能表征蛋白酶的相对活力大小，但这些底物的结构、性质和状态与动物皮内胶原蛋白纤维相差较大，因而测定结果对制革过程中蛋白酶的优选并无实际指导意义。以未鞣制胶原蛋白纤维为底物的分析方法，根据羟脯氨酸是胶原蛋白特征的氨基酸这一原理，通过测定蛋白酶对未鞣制胶原蛋白纤维作用后所得水解液中的羟脯氨酸的含量来计算蛋白酶的胶原蛋白纤维水解活力，能更有效的表征酶对胶原蛋白纤维的作用活力，但是，铬鞣后的胶原蛋白纤维结构特征发生了较大的变化，其结果并不能反映蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的作用性能。由于缺乏表征蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维作用性能的方法，目前的蓝湿革酶软化技术在蛋白酶的选择和软化条件的控制上主要是以经验判断，存在较大的盲目性。因此，为了正确选择适合的蓝湿革软化用蛋白酶，首先要建立定量表征蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维作用性能的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定方法及其应用，以解决由于缺乏定量表征蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维作用性能的方法而导致的蓝湿革酶软化技术在蛋白酶的选择和软化条件的控制上存在较大盲目性的问题。
可实现本发明上述目的一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定方法，包括以下步骤：
（1）铬鞣皮粉底物的制备
将由动物皮中间网状层制取的皮粉分散在浓度为0.05-0.10 g/mL的NaCl溶液中，形成皮粉浓度为0.05-0.20 g/mL的悬浮液，于20-50°C下振荡1-24小时，使皮粉充分吸水后，用适量酸溶液调整浴液pH至2.0-4.0，然后每质量份皮粉加入0.05-0.60质量份的铬鞣剂，于20-45°C振荡使铬鞣剂与皮粉中的胶原纤维充分接触，再加入适量提碱剂调整浴液pH至3.5-4.5使铬鞣剂与胶原纤维发生结合；于20-50°C静置1-5天，之后经过滤所得皮粉用水洗涤至洗出液呈无色，洗涤后的皮粉再经过脱水、干燥、粉碎、过20-200目筛，制得铬鞣皮粉底物。
所述的铬鞣剂为以碱式硫酸铬为主要成分，碱度为10%-40%的固体或者液体铬鞣剂。
（2）制备待测反应液和空白对照液
向50-200 mg铬鞣皮粉中加入1-20 mL缓冲液，混匀，加热至测定温度，加入将蛋白酶用对应pH的缓冲液溶解并稀释N1倍形成的蛋白酶溶液0.1-5.0 mL，在振荡下于测定温度进行酶解反应T小时，控制酶解反应的时间使铬鞣皮粉不被完全消耗，酶解反应后立即离心，并取1 mL上清液加入12mol/L的盐酸1 mL于100-140°C条件下消解6-48小时，消解液经去离子水稀释N2倍即为待测反应液。
向50-200 mg铬鞣皮粉中加入1-20 mL缓冲液，混匀，加热至测定温度，加入对应pH的缓冲液0.1-5.0 mL，于测定温度振荡T小时，立即离心，取1 mL上清液加入12mol/L的盐酸1 mL于100-140°C条件下水解6-48小时，消解液经去离子水稀释N2倍即为空白对照液。
所述的蛋白酶为酸性蛋白酶、中性蛋白酶或者碱性蛋白酶。
（3）消解液中的羟脯氨酸浓度测定及酶活力计算：分别测定空白对照液和待测反应液的盐酸消解液中的羟脯氨酸浓度，记为H0和H，根据式（1）计算蛋白酶对铬鞣胶原纤维的水解活力，
Figure 487052DEST_PATH_IMAGE001
（1）
式（1）中，H 0 和H分别为空白对照液和待测反应液的盐酸消解液中的羟脯氨酸浓度，μg/mL；N 2 为盐酸消解液的稀释倍数；V为酶解反应体系的总体积，mL；T为酶解反应的时间，h；N 1 为蛋白酶的稀释倍数。
在上述技术方案中，所述的酸为甲酸、乙酸、硫酸、盐酸和芳香族磺酸中的至少一种；优选的为甲酸和硫酸。
在上述技术方案中，所述的提碱剂为碳酸钠、碳酸氢钠、氧化镁或碳酸钙中的至少一种；优选的为碳酸氢钠。
在上述技术方案中，步骤（1）所述的制得的铬鞣皮粉为过20-200目筛的铬鞣皮粉；优选的为过40-120目筛的铬鞣皮粉。
在上述技术方案中，所述的羟脯氨酸浓度的测定方法可以是氯胺-T法、氨基酸分析仪法或HPLC法等可定量测定羟脯氨酸的方法中的至少一种；优选的为氨基酸分析仪法。
在上述技术方案中，所述的缓冲液的pH值为2-9；优选的pH值为3-7。
在上述技术方案中，所述的缓冲液为伯瑞坦-罗宾森缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液或者Tris-HCl缓冲液中的至少一种。
在上述技术方案中，所述的测定的温度范围为10-65°C。
上述技术方案中，酶活力定义为：在测定温度和pH值条件下，每小时催化铬鞣皮粉水解生成1 μg羟脯氨酸所需的蛋白酶的量为一个活力单位。
本发明还提供了一种上述方法的应用，上述方法适用于在皮革领域中表征蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的水解活力及蛋白酶对蓝湿革作用性能的评价。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提供的一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定新方法，该方法采用铬鞣剂对主要成分为胶原蛋白纤维的动物皮中间网状层皮粉进行鞣制，皮粉中的胶原蛋白纤维与铬鞣剂发生结合，制备铬鞣皮粉底物，类似于制革过程皮革的铬鞣工序生产蓝湿革时对皮革内胶原蛋白纤维的鞣制，因此，铬鞣皮粉底物中的胶原蛋白纤维的形态和结构特征接近于蓝湿革内的胶原蛋白纤维，酶活力测定的反应体系接近实际应用，因而本发明所述方法测定的蛋白酶活力结果对蓝湿革软化工序中蛋白酶的选择和软化条件的控制更具有指导意义。
本发明提供的一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定新方法，该方法通过测定蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维作用后所得水解液中的胶原蛋白的特征氨基酸——羟脯氨酸（Hypro）的含量来表征蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能，并以产生的羟脯氨酸的量来计算蛋白酶的活力，并且，羟脯氨酸的含量可通过多种方法进行定量测定，包括氯胺-T法、氨基酸分析仪法和HPLC法等，因而本发明所述方法具有精确、灵敏、测试方法灵活的优势，易于推广应用。
本发明提供的一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定新方法，该方法中的铬鞣皮粉底物中的铬含量可以通过铬鞣剂的加入量来调控，制得的不同铬含量的皮粉可以用于测定蛋白酶对铬鞣胶原纤维的作用能力随含铬量变化的情况。
本发明所述的方法适用于在较宽的pH值条件下测定酶活力，对酸性、中性和碱性蛋白酶均适用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。
下述各实施例中，所述的537酶是一种酸性蛋白酶；所述的AS1.398酶是一种中性蛋白酶；所述的2709酶是一种碱性蛋白酶。
实施例1——不同类型蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定
（1）试剂的准备
配制0.1mol/L的伯瑞坦-罗宾森缓冲液（B-R缓冲液）：称取6.183g硼酸溶解于适量蒸馏水中，加入11.529g磷酸和6.005g乙酸，用蒸馏水定容至1L后，用4mol/L的NaOH溶液分别调节pH值至3.0、7.0或9.0。
配制0.08 g/mL的NaCl溶液：称取0.5g NaCl用蒸馏水溶解并定容至100mL。
蛋白酶537用pH3.0的B-R缓冲液溶解并稀释100倍，离心后取上清液即得537酶溶液；蛋白酶AS1.398用pH7.0的B-R缓冲液溶解并稀释100倍，离心后取上清液即得AS1.398酶溶液；蛋白酶2709用pH9.0的B-R缓冲液溶解并稀释100倍，离心后取上清液即得2709酶溶液。
（2）铬鞣皮粉底物的制备：黄牛皮经浸水、脱脂后，取中间网状层充分水洗，然后用丙酮脱水，自然干燥，粉碎、过40目筛后制得牛皮皮粉；称取该皮粉10 g置于锥形瓶中，加入NaCl溶液100 mL，振荡至皮粉均匀分散并形成皮粉悬浮液，于25oC振荡3 h使皮粉充分吸水，用H2SO4（1:10稀释）调整浴液pH至3.2左右，加入铬粉1.4 g，于25°C振荡2 h使铬鞣剂与皮粉中的胶原蛋白纤维充分接触，用碳酸氢钠调整浴液pH至4.0左右使铬鞣剂与胶原蛋白纤维发生结合，于25°C静置5天，然后用去离子水洗涤皮粉至洗出液呈无色，将洗涤后的皮粉自然干燥，研磨，过40目筛，即制得铬鞣皮粉底物，皮粉中的铬含量为2.11%。
（3）制备待测反应液和空白对照液
称取100 mg铬鞣皮粉作为底物，分别加入5 mL pH3.0（537酶）、7.0（AS1.398酶）或9.0（2709酶）的B-R缓冲液，混匀，加热至40°C后分别加入1 mL所述酶溶液，在水浴恒温振荡器中在振荡条件下于40°C酶解反应4h，此时铬鞣皮粉未被完全消耗，立即离心，取1mL上清液加入12 mol/L的浓盐酸1mL，于120°C条件下消解12 h，消解液用去离子水定容至5 mL即为待测反应液，酶解反应体系离心前的总体积为6 mL；
在上述待测反应液的制备中用相同体积的对应pH的缓冲液代替待测酶溶液，称取的皮粉质量和酶反应实验的量一致，按照相同操作即得空白对照液。
（4）消解液中的羟脯氨酸浓度测定及酶活力计算：分别用氨基酸分析仪分析法和氯胺T法测定空白对照液和待测反应液中的羟脯氨酸浓度，记为H0和H，根据式（1）计算蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解活力，酶活力定义为：在温度为40°C，pH 3.0、7.0或9.0的条件下，每小时催化铬鞣皮粉水解生成1 μg羟脯氨酸所需的蛋白酶的量为一个活力单位（1U）。
Figure 418099DEST_PATH_IMAGE001
（1）
式（1）中，H 0 和H分别为空白对照液和待测反应液的盐酸消解液中的羟脯氨酸浓度，μg/mL；N 2 为盐酸消解液的稀释倍数；V为酶解反应体系的总体积，mL；T为酶解反应的时间，h；N 1 为蛋白酶的稀释倍数。
三种商业蛋白酶制剂对不同底物、不同测试方法的活力测定结果见表1。
由表1可以看出，本发明方法测定的蛋白酶活力的结果与国标法有显著的差异，本发明的方法，以铬鞣皮粉为底物，蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维进行作用，反应体系接近实际应用，测得结果对蓝湿革软化工序中蛋白酶的选择和软化条件的控制更具有指导意义。
表1 蛋白酶活力测定结果（U/g）。
Figure 110111DEST_PATH_IMAGE002
实施例2——碱性蛋白酶2709在不同pH条件下对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定
铬鞣皮粉底物的制备和消解液中的羟脯氨酸浓度测定及酶活力计算方法与实施例1相同，羟脯氨酸浓度测定选用氨基酸分析仪分析法。试剂的准备以及制备待测反应液和空白对照液步骤如下：
（1）试剂的准备
配制0.1mol/L的伯瑞坦-罗宾森缓冲液（B-R缓冲液）：称取6.183g硼酸溶解于适量蒸馏水中，加入11.529g磷酸和6.005g乙酸，用蒸馏水定容至1L后，用4mol/L的NaOH溶液分别调节pH值至6.0、7.0、8.0和9.0。
蛋白酶2709分别用pH6.0、7.0、8.0或9.0的B-R缓冲液溶解并稀释100倍，分别离心后取上清液即得不同pH的2709酶溶液。
（2）制备待测反应液和空白对照液
称取100 mg铬鞣皮粉作为底物，分别加入5 mL pH6.0、7.0、8.0或9.0的B-R缓冲液，混匀，加热至40°C后分别加入1 mL所述酶溶液，在水浴恒温振荡器中在振荡条件下于40oC酶解反应4h，此时铬鞣皮粉未被完全消耗，立即离心，取1mL上清液加入12 mol/L的浓盐酸1mL，于120°C条件下消解12 h，消解液用去离子水定容至5 mL即为待测反应液，酶解反应体系离心前的总体积为6 mL；
在上述待测反应液的制备中用相同体积的对应pH的缓冲液代替待测酶溶液，称取的皮粉质量和酶反应实验的量一致，按照相同操作即得空白对照液。
2709碱性蛋白酶在相同的酶用量、液比和温度等测定条件，不同的pH条件下酶活力的测定结果见表2。
由表2可以看出，本发明方法测定的碱性蛋白酶2709活力显示，碱性蛋白酶2709对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能和酶活力在pH6.0-9.0范围内随pH的升高而升高。
表2 2709碱性蛋白酶活力随pH变化情况。
Figure 784806DEST_PATH_IMAGE003
实施例3——碱性蛋白酶2709在不同温度条件下对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定
试剂的准备、铬鞣皮粉底物的制备和消解液中的羟脯氨酸浓度测定及酶活力计算方法与实施例2相同，选用的B-R缓冲液pH为9.0。制备待测反应液和空白对照液步骤如下：
分别称取5份100 mg铬鞣皮粉作为底物，分别加入5 mL pH9.0的B-R缓冲液，混匀，分别加热至30、35、40、45和50°C后分别加入1 mL所述酶溶液，在水浴恒温振荡器中在振荡条件下分别于30、35、40、45和50°C酶解反应4h，此时铬鞣皮粉未被完全消耗，立即离心，取1mL上清液加入12 mol/L的浓盐酸1mL，于120°C条件下消解12 h，消解液用去离子水定容至5 mL即为待测反应液，酶解反应体系离心前的总体积为6 mL；
在上述待测反应液的制备中用相同体积的对应pH的缓冲液代替待测酶溶液，称取的皮粉质量和酶反应实验的量一致，按照相同操作即得空白对照液。
2709碱性蛋白酶在相同酶用量、液比和pH等测定条件，不同温度条件下酶活力的测定结果见表3。
由表3可以看出，本发明方法测定的碱性蛋白酶2709活力显示，碱性蛋白酶2709对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能和酶活力在温度30-50°C范围内随温度的升高而升高。
表3 2709碱性蛋白酶活力随温度变化情况
Figure 744410DEST_PATH_IMAGE004

Claims (3)

1.一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）铬鞣皮粉底物的制备
将由动物皮中间网状层制取的皮粉分散在浓度为0.05-0.10g/mL的NaCl溶液中，形成皮粉浓度为0.05-0.20g/mL的悬浮液，于20-50°C下振荡1-24小时，使皮粉充分吸水后，用适量酸溶液调整浴液pH至2.0-4.0，然后每质量份皮粉加入0.05-0.60质量份的铬鞣剂，于20-45°C振荡使铬鞣剂与皮粉中的胶原纤维充分接触，再加入适量提碱剂调整浴液pH至3.5-4.5使铬鞣剂与胶原纤维发生结合；于20-50°C静置1-5天，之后经过滤所得皮粉用水洗涤至洗出液呈无色，洗涤后的皮粉再经过脱水、干燥、粉碎、过20-200目筛，制得铬鞣皮粉底物；
所述的铬鞣剂包括：碱式硫酸铬，所述的铬鞣剂是碱度10%-40%的固体或者液体铬鞣剂；
（2）制备待测反应液和空白对照液
向50-200 mg铬鞣皮粉中加入1-20 mL缓冲液，混匀，加热至测定温度，加入将蛋白酶用对应pH的缓冲液溶解并稀释N 1 倍形成的蛋白酶溶液0.1-5.0 mL，在振荡下于测定温度进行酶解反应T小时，控制酶解反应的时间使铬鞣皮粉不被完全消耗，酶解反应后立即离心，并取1 mL上清液加入12mol/L的盐酸1 mL于100-140°C条件下消解6-48小时，消解液经去离子水稀释N2倍即为待测反应液；
向50-200 mg铬鞣皮粉中加入1-20 mL缓冲液，混匀，加热至测定温度，加入对应pH的缓冲液0.1-5.0 mL，于测定温度振荡T小时，立即离心，取1 mL上清液加入12mol/L的盐酸1 mL于100-140°C条件下水解6-48小时，消解液经去离子水稀释N 2 倍即为空白对照液；
缓冲液的pH值为2-9；
所述缓冲液为伯瑞坦-罗宾森缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液或者Tris-HCl缓冲液中的至少一种；
所述的蛋白酶为酸性蛋白酶、中性蛋白酶或者碱性蛋白酶；
（3）消解液中的羟脯氨酸浓度测定及酶活力计算：分别测定空白对照液和待测反应液的盐酸消解液中的羟脯氨酸浓度，记为H 0 和H，根据式（1）计算蛋白酶对铬鞣胶原纤维的水解活力
Figure 560208DEST_PATH_IMAGE002
（1）
式（1）中， H 0 和 H 分别为空白对照液和待测反应液的盐酸消解液中的羟脯氨酸浓度，μg/mL； N 2 为盐酸消解液的稀释倍数； V 为酶解反应体系的总体积，mL； T 为酶解反应的时间，h； N 1 为蛋白酶的稀释倍数；
所述的酸为甲酸、乙酸、硫酸、盐酸和芳香族磺酸中的至少一种；
所述的提碱剂为碳酸钠、碳酸氢钠、氧化镁或碳酸钙中的至少一种；
该方法适用于在皮革领域中表征蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的水解活力及蛋白酶对蓝湿革作用性能的评价。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定方法，其特征在于所述羟脯氨酸浓度的测定方法是氯胺-T法、氨基酸分析仪法或HPLC法的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定方法，其特征在于所述测定的温度范围为10-65°C。
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