CN111693472A - 一种角膜羟脯氨酸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种角膜羟脯氨酸检测方法，包括如下步骤:步骤一、标准曲线的建立；步骤二、角膜的消解；步骤三、消解后角膜吸光度的测定；步骤四、角膜羟脯氨酸的确定。其中角膜消解的步骤为将经过干燥恒重处理的角膜先用酶消解，通过酶解将角膜大部分转变成氨基酸和多肽，再用稀释后的一定浓度的硫酸进行酸消解。本发明所采用的角膜消解方法可明显降低角膜中羟脯氨酸的损失，消解过程中角膜消解无碳化现象发生，无需过滤，可大幅度提升检测的准确性和可靠性。
Description
技术领域
本发明涉及羟脯氨酸检测技术领域，具体涉及一种角膜羟脯氨酸检测方法。
背景技术
角膜病是最主要的致盲眼病之一。有关数据表明： “角膜盲人”占全部盲人总数的1/4，人数约为800万，在这些患者中，绝大多数是9岁以下的儿童以及40－69岁的青壮年人，而复明的唯一手段就是角膜移植手术。但是，由于眼角膜的捐献者太少，全国各大医院每年可以完成的角膜移植手术只有2000-3000例，绝大多数的失明者目前只能在黑暗中苦苦地等待，人工生物角膜对于那些处于黑暗之中的人们来说迫切需要的，人工生物角膜有着它特别大的优点，其生物相容性好，人体的神经，细胞可以长在里面，从而使其变成自己身体的一部分，而角膜中胶原蛋白含量是评价角膜生物相容性好坏的一项重要指标，角膜本身胶原蛋白含量极高，经过干燥恒重处理，使单位质量角膜中胶原蛋白含量更高，普通的酸消解和碱消解都不能使其完全水解，使测得的羟脯氨酸含量偏低。胶原蛋白含量一般采用间接法检测其羟脯氨酸含量来换算，所以建立一种快速，准确，经济的羟脯氨酸测定方法是非常重要的。
羟脯氨酸的间接测定方法，主要是经前处理将样品水解，前处理的好坏直接影响到最终的测定结果。样品水解的方法主要有酸解法，碱解法和酶解法，酶解法由于不能使样品水解完全，碱解法在完全水解样品的同时会对有羟基的氨基酸造成破坏。而使用比色法检测时，含羟基的氨基酸也是其中的关键部分。现在技术对于胶原蛋白致密的角膜来说，酸解过程中会导致其碳化变黑，酸解不彻底，造成实验数据不准确。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种角膜羟脯氨酸检测方法。该方法通过先酶解后酸解的方法来对角膜进行前处理，先用酶消解，通过酶解破坏角膜致密结构，在保护角膜中羟脯氨酸的前提下最大限度的将角膜中的胶原蛋白转化为氨基酸和多肽，再酸解，可以使消解更完全，并有效降低羟脯氨酸的损失，同时避免碳化和杂质的产生，提高检测的准确性。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、建立标准曲线：取不同浓度的羟脯氨酸标准溶液测定吸光度，以羟脯氨酸标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标建立标准曲线；
步骤二、消解角膜：将角膜置于酶解液中，于水浴条件下酶解，向含角膜的酶解液中加入酸解液对角膜进行酸解，得到消解后角膜；
步骤三、测定吸光度：将消解后角膜冷却稀释后进行吸光度测定，记录结果；
步骤四、确定羟脯氨酸含量：将步骤三所得结果与步骤一所述标准曲线对比，得到角膜中羟脯氨酸的含量。
上述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，步骤二中所述酶解液中角膜含量为15g/L～25g/L。
上述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，所述酶解液中角膜含量为20g/L。
上述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，步骤二中所述酶解液包括蛋白酶K、氯化钙、三羟甲基氨基甲烷和水，所述酶解液中蛋白酶K的含量为1g/L，所述蛋白酶K、氯化钙和三羟甲基氨基甲烷的质量比为1:1.11:6.057。
上述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，所述酶解液的配制为取氯化钙和三羟甲基氨基甲烷加水溶解，加入pH调节剂调节溶液pH至7.4~8.0，向调节pH后的溶液中加入蛋白酶K，所述pH调节剂为HCl溶液。
上述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，步骤二中酶解的温度为55℃~65℃，酶解的时间为6h～10h。
上述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，步骤二中所述酸解液为浓度为3.0mol/L~4.5mol/L的硫酸溶液。
上述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，所述酸解液为浓度为3.8mol/L的硫酸溶液。
上述的一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，步骤二中酸解的温度为 90℃～120℃，酸解的时间为10h～16h。
本发明突出特点在于：
1.本发明采用先酶解后酸解的方法来对角膜进行前处理，先用酶消解，通过酶解破坏角膜致密结构，在保护角膜中羟脯氨酸的前提下最大限度的将角膜中的胶原蛋白转化为氨基酸和多肽；本发明优选酸解液为稀释后的硫酸溶液，破坏力小且不易挥发，可以有效降低羟脯氨酸的损失，在酶解大部分角膜之后，加入本酸解液，可以使消解更完全，同时避免碳化和杂质的产生，提高检测的准确性。
2.本发明所采用的对角膜的前处理方法不会引入新的杂质，后处理过程不需过滤，从而提高羟脯氨酸含量检测的准确性。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为羟脯氨酸标准溶液浓度-吸光值的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1
配制柠檬酸缓冲液：称取一水柠檬酸26.0g，氢氧化钠14.0g，无水乙酸钠78.0g置于1L容量瓶中，加水500mL使其溶解后再加入250mL正丙醇，用水定容至刻度，摇匀。
配制氯胺T溶液：称取1.14g氯胺T置于容量瓶中，用100mL柠檬酸钠缓冲液稀释定容至刻度，摇匀，临用前配制。
配制显色剂:称取10.0g对二甲氨基苯甲醛，加入35.0mL 60%高氯酸溶液溶解，缓慢加入65.0mL异丙醇，摇匀，临用前配制。
配制羟脯氨酸标准储备液：精密称取羟脯氨酸标准品50mg置于100mL容量瓶中，用适量水溶解，加3mol/L硫酸溶液一滴，加水定容至刻度，摇匀，即得（该溶液在4℃下可稳定存放1个月）。
配制羟脯氨酸标准工作液：吸取1.0mL上述羟脯氨酸标准储备液置于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，分别吸取该溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀即得。所得标准工作液的浓度依次为：0.5ug/mL、1.0ug/mL、1.5ug/mL、2.0 ug/mL。临用前配制。
移取4mL上述各浓度的羟脯氨酸标准工作液于10mL的带盖的螺口玻璃比色管中，加入2mL的上述氯氨T溶液，混匀后放置在25℃的条件下20min；
加入2mL的对二甲氨基苯甲醛溶液于比色管中，拧紧后迅速放入60℃的水浴锅中，加热20min，用流动水冲洗3min，室温下冷却30min；
空白对照:用所用水作为稀释液，按照如上步骤操作，在558nm处测得吸光值作为空白；
以吸光值为纵坐标，以对应羟脯氨酸标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线如图1所示。
配制酶解液: 先配制CaCl2含量为1.11g/L Tris含量为 6.057g/L的水溶液，在上述水溶液中加入HCl，调节pH至7.4-8.0后加入蛋白酶K，蛋白酶K含量为1g/L，摇匀。
配制酸解液：分别量取50mL的纯化水于500mL的烧杯中，在搅拌下缓慢的加入浓硫酸，冷却至室温，将液体移入100mL的容量瓶中，用水定容至刻度线，配制成浓度从3.0mol/L到4.5mol/L的酸解液。
实施例2
准确称取200mg干燥恒重的角膜至50mL的玻璃比色管中，加入10mL的酶解液，于60℃的恒温水浴锅中反应6h。向酶解后溶液中加入20mL 3.8mol/L的酸解液，密封，放置于105℃的干燥箱中酸解10h；
将上述角膜消解后溶液转移到250mL的容量瓶中，用10mL的纯化水分三次冲洗比色管，将其一并转移到容量瓶中定容至刻度线；从上述稀释后溶液中取出5mL，纯化水定容进行二次稀释，溶液中羟脯氨酸含量在0.5ug/mL-2ug/mL之间；
移取4mL的上述二次稀释液， 于10mL的带盖的螺口玻璃比色管中，加入2mL的上述氯氨T溶液，混匀后放置在25℃的条件下20min；
加入2mL的对二甲氨基苯甲醛溶液比色管中，拧紧后迅速放入60℃的水浴锅中，加热20min，用流动水冲洗3min，室温下冷却30min，在紫外-可见分光光度计558nm处测其吸光度；
样品中羟脯氨酸含量按如下公式计算:
X：样品中羟脯氨酸的含量（%）
c：由标准曲线中得到的样品中羟脯氨酸的浓度，单位为ug/mL
m：样品称样量g
V：量取样品溶液的体积mL。
实施例3
准确称取150mg干燥恒重的角膜至50mL的玻璃比色管中，加入10mL的酶解液，于60℃的恒温水浴锅中反应6h。向酶解后溶液中加入20mL 3.8mol/L的酸解液，密封，放置于105℃的干燥箱中酸解16h；
将上述角膜消解后溶液转移到250mL的容量瓶中，用10mL的纯化水分三次冲洗比色管，将其一并转移到容量瓶中定容至刻度线；从上述稀释后溶液中取出5mL，纯化水定容进行二次稀释，溶液中羟脯氨酸含量在0.5ug/mL-2ug/mL之间；
移取4mL的上述二次稀释液， 于10mL的带盖的螺口玻璃比色管中，加入2mL的上述氯氨T溶液，混匀后放置在25℃的条件下20min；
加入2mL的对二甲氨基苯甲醛溶液于比色管中，拧紧后迅速放入60℃的水浴锅中，加热20min，用流动水冲洗3min，室温下冷却30min，在紫外-可见分光光度计558nm处测其吸光度；
样品中羟脯氨酸含量按计算方法同实施例2。
实施例4
准确称取250mg干燥恒重的角膜至50mL的玻璃比色管中，加入10mL的酶解液，于60℃的恒温水浴锅中反应6h。向酶解后溶液中加入20mL 3.8mol/L的酸解液，密封，放置于105℃的干燥箱中酸解10h；
将上述角膜消解后溶液转移到250mL的容量瓶中，用10mL的纯化水分三次冲洗比色管，将其一并转移到容量瓶中定容至刻度线；从上述稀释后溶液中取出5mL，纯化水定容进行二次稀释，溶液中羟脯氨酸含量在0.5ug/mL-2ug/mL之间；
移取4mL的上述二次稀释液， 于10mL的带盖的螺口玻璃比色管中，加入2mL的上述氯氨T溶液，混匀后放置在25℃的条件下20min；
加入2mL的对二甲氨基苯甲醛溶液于比色管中，拧紧后迅速放入60℃的水浴锅中，加热20min，用流动水冲洗3min，室温下冷却30min，在紫外-可见分光光度计558nm处测其吸光度；
样品中羟脯氨酸含量按计算方法同实施例2。
实施例5
准确称取200mg干燥恒重的角膜至50mL的玻璃比色管中，加入10mL的酶解液，于55℃的恒温水浴锅中反应8h。向酶解后溶液中加入20mL 3.0mol/L的酸解液，密封，放置于120℃的干燥箱中酸解12h；
将上述角膜消解后溶液转移到250mL的容量瓶中，用10mL的纯化水分三次冲洗比色管，将其一并转移到容量瓶中定容至刻度线；从上述稀释后溶液中取出5mL，纯化水定容进行二次稀释，溶液中羟脯氨酸含量在0.5ug/mL-2ug/mL之间；
移取4mL的上述二次稀释液， 于10mL的带盖的螺口玻璃比色管中，加入2mL的上述氯氨T溶液，混匀后放置在25℃的条件下20min；
加入2mL的对二甲氨基苯甲醛溶液于比色管中，拧紧后迅速放入60℃的水浴锅中，加热20min，用流动水冲洗3min，室温下冷却30min，在紫外-可见分光光度计558nm处测其吸光度；
样品中羟脯氨酸含量按计算方法同实施例2。
实施例6
准确称取200mg干燥恒重的角膜至50mL的玻璃比色管中，加入10mL的酶解液，于65℃的恒温水浴锅中反应10h。向酶解后溶液中加入20mL 4.5mol/L的酸解液，密封，放置于90℃的干燥箱中酸解16h；
将上述角膜消解后溶液转移到250mL的容量瓶中，用10mL的纯化水分三次冲洗比色管，将其一并转移到容量瓶中定容至刻度线；从上述稀释后溶液中取出5mL，纯化水定容进行二次稀释，溶液中羟脯氨酸含量在0.5ug/mL-2ug/mL之间；
移取4mL的上述二次稀释液， 于10mL的带盖的螺口玻璃比色管中，加入2mL的上述氯氨T溶液，混匀后放置在25℃的条件下20min；
加入2mL的对二甲氨基苯甲醛溶液于比色管中，拧紧后迅速放入60℃的水浴锅中，加热20min，用流动水冲洗3min，室温下冷却30min，在紫外-可见分光光度计558nm处测其吸光度；
样品中羟脯氨酸含量按计算方法同实施例2。
对比例1
准确称取200mg干燥恒重的角膜至50mL的玻璃比色管中，加入30mL的3mol/L硫酸酸解，密封，放置于105℃的干燥箱中酸解16h后取出，室温静置10min，将上述角膜消解后溶液用圆形滤纸转移到250mL的容量瓶中，用10mL的3mol/L硫酸溶液分三次冲洗比色管和滤纸，将其一并转移到容量瓶中定容至刻度线；从上述稀释后溶液中取出5mL，纯化水定容进二次稀释，溶液中羟脯氨酸含量在0.5ug/mL-2ug/mL之间；
移取4mL的上述稀释液， 于10mL的带盖的螺口玻璃比色管中，加入2mL的上述氯氨T溶液，混匀后放置在25℃的条件下20min；
加入2mL的对二甲氨基苯甲醛溶液于比色管中，拧紧后迅速放入60℃的水浴锅中，加热20min，用流动水冲洗3min，室温下冷却30min，在紫外-可见分光光度计558nm处测其吸光度；
样品中羟脯氨酸含量按计算方法同实施例2。
对比例2
准确称取200mg干燥恒重的角膜至50mL的玻璃比色管中，加入30mL的酶解液，封口后摇匀，于60℃的恒温水浴锅中反应10h。室温静置10min，趁热用圆形滤纸将酶解产物过滤至250mL容量瓶中，用10mL的纯化水分三次冲洗比色管，将其一并转移到容量瓶中定容至刻度线；从上述稀释后溶液中取出5mL，纯化水定容进行二次稀释，溶液中羟脯氨酸含量在0.5ug/mL-2ug/mL之间；
移取4mL的上述二次稀释液， 于10mL的带盖的螺口玻璃比色管中，加入2mL的上述氯氨T溶液，混匀后放置在25℃的条件下20min；
加入2mL的对二甲氨基苯甲醛溶液于比色管中，拧紧后迅速放入60℃的水浴锅中，加热20min，用流动水冲洗3min，室温下冷却30min，在紫外-可见分光光度计558nm处测其吸光度；
样品中羟脯氨酸含量按计算方法同实施例2。
对比例3
准确称取200mg干燥恒重的角膜至50mL的玻璃比色管中，加入30mL的2.5mol/L的NaOH溶液，于60℃的高压灭菌锅中蒸汽加热消解 6h。取出，用稀硫酸将pH调节到6-8之间。室温静置30min，趁热用圆形滤纸将水解产物过滤至250mL容量瓶中，用10mL的纯化水分三次冲洗比色管，将其一并转移到容量瓶中定容至刻度线；从上述稀释后溶液中取出5mL，纯化水定容进行二次稀释，溶液中羟脯氨酸含量在0.5ug/mL-2ug/mL之间；
移取4mL的上述二次稀释液， 于10mL的带盖的螺口玻璃比色管中，加入2mL的上述氯氨T溶液，混匀后放置在25℃的条件下20min；
加入2mL的对二甲氨基苯甲醛溶液于比色管中，拧紧后迅速放入60℃的水浴锅中，加热20min，用流动水冲洗3min，室温下冷却30min，在紫外-可见分光光度计558nm处测其吸光度；
样品中羟脯氨酸含量按计算方法同实施例2。
本发明羟脯氨酸的检出限度0.03000ug/mL，定量限度为0.10000ug/mL，线性范围是0.5ug/mL-2.5ug/mL，样品回收率(96.50±3.00)%(RSD3.11%)，方法平行样品的RSD为0.30%-0.60%，准确度和精确度满足分析要求。
表1 实施例2前处理后样品加标后回收率情况
通过表1可知，实施例2平均回收率为102.927%，回收率相对平均偏差为1.25%，由此可见，使用本发明的前处理方法可以在促进角膜水解的基础上最大程度的保护羟脯氨酸。
表2样品测定优化的结果
由表2可知实施例2所取用角膜含量为20g/L的样品为本发明中优选，角膜消解后所得羟脯氨酸平均含量超过9.5%；不同方法的对比结果显示，本发明中所选用的先酶解后酸解的方法所获得的角膜羟脯氨酸含量明显高于其他方法，说明本发明消解方法使得角膜消解更完全，羟脯氨酸损失更低。
以上所述仅为本发明的实施例证，并非因此而限制本发明的发明范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等同交换，或直接或间接运用到相关技术领域，均在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、建立标准曲线：取不同浓度的羟脯氨酸标准溶液测定吸光度，以羟脯氨酸标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标建立标准曲线；
步骤二、消解角膜：将角膜置于酶解液中，于水浴条件下酶解，向含角膜的酶解液中加入酸解液对角膜进行酸解，得到消解后角膜；
步骤三、测定吸光度：将消解后角膜冷却稀释后进行吸光度测定，记录结果；
步骤四、确定羟脯氨酸含量：将步骤三所得结果与步骤一所述标准曲线对比，得到角膜中羟脯氨酸的含量。
2.根据权利要求1所述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，步骤二中所述酶解液中角膜含量为15g/L～25g/L。
3.根据权利要求2所述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，所述酶解液中角膜含量为20g/L。
4.根据权利要求1所述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，步骤二中所述酶解液包括蛋白酶K、氯化钙、三羟甲基氨基甲烷和水，所述酶解液中蛋白酶K的含量为1g/L，所述蛋白酶K、氯化钙和三羟甲基氨基甲烷的质量比为1:1.11:6.057。
5.根据权利要求4所述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，所述酶解液的配制为取氯化钙和三羟甲基氨基甲烷加水溶解，加入pH调节剂调节溶液pH至7.4~8.0，向调节pH后的溶液中加入蛋白酶K，所述pH调节剂为HCl溶液。
6.根据权利要求1所述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，步骤二中酶解的温度为55℃~65℃，酶解的时间为6h～10h。
7.根据权利要求1所述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，步骤二中所述酸解液为浓度为3.0mol/L~4.5mol/L的硫酸溶液。
8.根据权利要求7所述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，所述酸解液为浓度为3.8mol/L的硫酸溶液。
9.根据权利要求1所述的一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，步骤二中酸解的温度为90℃～120℃，酸解的时间为10h～16h。
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