CN107991294B - 一种聚唾液酸的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种聚唾液酸的检测方法，该方法直接取微量的聚唾液酸生产菌株培养菌液滴到点样滤纸的样品检测区，经显色液显色后，用醋酸水溶液清洗掉未结合的显色液，直接对比点样滤纸上标准品的颜色，找出标品对照区中与样品颜色深浅接近点位，该点位对应的聚唾液酸标准品浓度即为培养菌液中聚唾液酸浓度。本发明发明操作简单，发酵过程中随时可以监控产生聚唾液酸的含量，样品采集量很少，仅5μL就可以检测结果，且检测仅需要5分钟，全过程不需要离心，不需要乙醇沉淀过滤，不需要除去杂蛋白，不需要各种仪器，且培养菌液中所含的杂质对检测结果影响不大，聚唾液酸不需要纯化可以直接检测，不受发酵液及其菌体影响。

Description

一种聚唾液酸的检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种聚唾液酸的检测方法。
背景技术
聚唾液酸(Polysialic acid，Colominic acid)是N-乙酰神经胺酸以α-2,8和/或α-2,9键连接的直链同聚物。以α-2,8糖苷键形式连接的聚唾液酸末端相邻的两个单体形成内酯，对聚唾液酸的稳定起到一定作用，这也是聚唾液酸大多以α-2,8糖苷键形式连接的原因之一。
聚唾液酸大都以N-乙酰神经氨酸为组成单元，因此在理化特性上与其相似，聚唾液酸易溶于水，在水溶液中很稳定，4℃可以存放几个月，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，其热稳定性好，在酸性或碱性的环境中易被降解。
目前微生物发酵法是获得聚唾液酸的唯一途径。现阶段报道的聚唾液酸生产菌株以大肠杆菌居多，这些菌株在固体培养时，大多数菌落形态不规则，中间有凸体，边缘呈锯齿状，菌落表面呈湿润透明状；在液体培养时，菌体表面的聚唾液酸大都以电荷吸附的方式覆盖在细胞表面，大部分比较容易释放到培养液中，但是有一部分聚唾液酸以磷脂键的形式锚在细胞膜上，不易从细胞表面脱落。通常在微生物发酵过程中要随时监控聚唾液酸的含量，现有的检测方法是间苯二酚法，具体检测方法是：发酵液→离心→取上清(加氯化钠加过量乙醇)→沉淀(加去离子水)→溶解→去除杂蛋白(碱性蛋白酶，十六烷基吡啶)→络合物沉淀→解离→聚唾液酸沉淀(加过量乙醇)→溶解层析分离(加去离子水)→洗脱液→透析液→聚唾液酸→间苯二酚法检测→对照标准曲线分析计算结果。此法操作较为复杂，步骤比较多，检测需要10小时以上，而且需要仪器，每次取样量较多，不太适合实时监测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简单，快捷迅速，能在较短的时间内检测出菌株产生聚唾液酸含量的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、将聚唾液酸标准品加入去离子水中，分别配制不同浓度的聚唾液酸标准品溶液，取2～10μL不同浓度的聚唾液酸标准品溶液均匀滴加到点样滤纸的标品对照区的对应浓度点位上，自然晾干或吹风机吹干。
2、取与标准品溶液相同体积的聚唾液酸生产菌株培养菌液，滴加到点样滤纸的样品检测区的点位上，自然晾干或吹风机吹干。
3、将整个点样滤纸浸泡到显色液中，反应20～30秒，取出点样滤纸甩掉显色液，然后将点样滤纸浸泡到洗脱液中，在脱色摇床上洗涤30～60秒倒掉洗脱液，用洗脱液再重复洗涤2～3次，最后用自来水冲洗点样滤纸，自然晾干或用吹风机吹干。
4、将样品检测区与标品对照区进行对比，找出标品对照区中与样品颜色深浅接近点位，该点位对应的聚唾液酸标准品浓度即为培养菌液中聚唾液酸浓度。
上述的显色液是溶解有阿尔新蓝的醋酸水溶液，显色液中阿尔新蓝的浓度为0.9～1.8mg/mL，溶解阿尔新蓝所用的醋酸水溶液中醋酸的体积分数为2％～3％。
上述的洗脱液是质量分数为8％～15％的醋酸水溶液。
上述步骤1中，优选将聚唾液酸标准品加入去离子水中，分别配制聚唾液酸浓度为3μg/μL、2μg/μL、1μg/μL、0.5μg/μL、0.25μg/μL、0.10μg/μL、0μg/μL的标准品溶液，按照聚唾液酸浓度从高到低或者从低到高的顺序依次将聚唾液酸标准品溶液均匀滴加到点样滤纸的标品对照区的对应浓度点位上。
上述的点样滤纸为定性滤纸或者定量滤纸。
本发明操作简单，发酵过程中随时可以监控产生聚唾液酸的含量，样品采集量很少，仅5μL就可以检测结果，且检测仅需要5分钟，全过程不需要离心，不需要乙醇沉淀过滤，不需要除去杂蛋白，不需要各种仪器，直接取聚唾液酸生产菌株发酵过程中的培养菌液滴到试纸上，脱色观察结果，根据标品对照对应的浓度即是发酵过程中产生的聚唾液酸含量。
本发明方法中，培养菌液中所含的杂质对检测结果影响不大，聚唾液酸不需要纯化可以直接检测，不受发酵液及其菌体影响。
附图说明
图1是大肠菌株(Escherichia coli)K235-WXJ4发酵过程中按照时间梯度采集样品检测的结果。
图2是大肠菌株(Escherichia coli)K235-WXJ4发酵完成后纯化聚唾液酸稀释到原发酵浓度和直接取发酵液检测结果的对比结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、将聚唾液酸标准品加入去离子水中，分别配制聚唾液酸浓度为3μg/μL、2μg/μL、1μg/μL、0.5μg/μL、0.25μg/μL、0.10μg/μL、0μg/μL的标准品溶液，取5μL不同浓度的聚唾液酸标准品溶液均匀滴加到点样滤纸的标品对照区的对应浓度点位上，自然晾干。
2、将大肠菌株(Escherichia coli)K235-WXJ4按接种量为1％接种于装有30mL发酵培养基的250mL三角摇瓶中，所述的发酵培养基中含30g/L固体山梨醇、5g/LNH4Cl、0.4g/L胰蛋白胨、20g/L K2HPO4·3H2O，其余为水，发酵培养基的pH＝7.2，在250r/min、37℃培养50h。在整个发酵过程中每隔3小时采集5μL样品，滴加到点样滤纸的样品检测区的点位上，自然晾干。
3、将整个点样滤纸浸泡到显色液中，反应30秒，取出点样滤纸甩掉显色液，然后将点样滤纸浸泡到洗脱液中，在脱色摇床上洗涤60秒倒掉洗脱液，用洗脱液再重复洗涤2次，最后用自来水冲洗点样滤纸，自然晾干。其中所述的显色液是含1.2mg/mL阿尔新蓝的醋酸水溶液，醋酸水溶液中醋酸的体积分数为2％；所述的洗脱液是质量分数为10％的醋酸水溶液。
4、将样品检测区与标品对照区进行对比，找出标品对照区中与样品颜色深浅接近点位，该点位对应的聚唾液酸标准品浓度即为培养菌液中聚唾液酸浓度。由图1可见，从右向左颜色逐渐加深，说明随着发酵时间延长产生聚唾液酸逐渐增多。
为了证明本发明方法的准确性，发明人采用间苯二酚法对实施例1中培养50小时的培养菌液进行分析检测，具体检测方法如下：
取培养菌液100mL，经高速离心除去菌体，所得上清液中加入2.5g氯化钠充分搅拌使其溶解，然后加入2倍体积乙醇水溶液，沉淀出聚唾液酸，静置1.5小时，离心即得到聚唾液酸沉淀，用体积浓度为75％的乙醇水溶液洗涤2次，再用去离子水溶解聚唾液酸，所得溶液经高速离心除去杂蛋白，调节滤液pH值到8，加入1mL碱性蛋白酶，在50℃恒温水浴条件下处理4小时，再加入2g十六烷基吡啶，静置10小时形成络合物，离心并收集沉淀，加入10mL0.5mol/L氯化钠水溶液解离沉淀，解离后的上清液中加入4倍体积体积浓度为95％的乙醇水溶液，沉淀出聚唾液酸，静置1小时后，高速离心分离出聚唾液酸。为了得到更纯的聚唾液酸再用体积浓度为75％乙醇水溶液洗涤2次，然后再用5mL去离子水溶解透析除盐，即得到纯度98％以上的聚唾液酸水溶液。取相同量纯度98％以上的聚唾液酸水溶液两份，均稀释成聚唾液酸浓度2μg/μL、1μg/μL、0.5μg/μL，分别用间苯二酚法和实施例1方法进行检测比较，试验结果显示，本发明方法的检测结果和间苯二法检测结果基本一致。但是间苯二酚法需要经过纯化后才能准确的检测，如果从纯化后开始计算检测时间间苯二酚法需要一个小时以上，而本发明方法仅需要5分钟。
同时，发明人将上述纯度98％以上的聚唾液酸水溶液用去离子水稀释至原发酵液浓度，再用实施例1的点样滤纸进行检测，结果见图2。从图2可以看出，纯化前后的检测结果一致，说明培养菌液中所含的杂质对检测结果影响不大，聚唾液酸不需要纯化可以直接检测，不受发酵液及其菌体影响。

Claims (3)

1.一种实时快速检测聚唾液酸生产菌株培养菌液中聚唾液酸含量的方法，其特征在于它由下述步骤组成：
（1）将聚唾液酸标准品加入去离子水中，分别配制不同浓度的聚唾液酸标准品溶液，取2～10µL不同浓度的聚唾液酸标准品溶液均匀滴加到点样滤纸的标品对照区的对应浓度点位上，自然晾干或吹风机吹干；
（2）取与标准品溶液相同体积的聚唾液酸生产菌株培养菌液，滴加到点样滤纸的样品检测区的点位上，自然晾干或吹风机吹干；
（3）将整个点样滤纸浸泡到显色液中，反应20～30秒，取出点样滤纸甩掉显色液，然后将点样滤纸浸泡到洗脱液中，在脱色摇床上洗涤30～60秒倒掉洗脱液，用洗脱液再重复洗涤2～3次，最后用自来水冲洗点样滤纸，自然晾干或用吹风机吹干；
（4）将样品检测区与标品对照区进行对比，找出标品对照区中与样品颜色深浅接近点位，该点位对应的聚唾液酸标准品浓度即为培养菌液中聚唾液酸浓度；
上述的显色液是溶解有阿尔新蓝的醋酸水溶液，其中溶解阿尔新蓝所用的醋酸水溶液中醋酸的体积分数为2%～3%，显色液中阿尔新蓝的浓度为0.9～1.8mg/mL；
上述的洗脱液是质量分数为8%～15%的醋酸水溶液；
上述的点样滤纸为定性滤纸或者定量滤纸。
2.根据权利要求1所述的实时快速检测聚唾液酸生产菌株培养菌液中聚唾液酸含量的方法，其特征在于：在步骤（1）中，将聚唾液酸标准品加入去离子水中，分别配制聚唾液酸浓度为3µg/µL、2µg/µL、1µg/µL、0.5µg/µL、0.25µg/µL、0.10µg/µL、0µg/µL的标准品溶液。
3.根据权利要求2所述的实时快速检测聚唾液酸生产菌株培养菌液中聚唾液酸含量的方法，其特征在于：在步骤（1）中，按照聚唾液酸浓度从高到低或者从低到高的顺序依次将聚唾液酸标准品溶液均匀滴加到点样滤纸的标品对照区的对应浓度点位上。
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