CN112630316B - 基于hplc-icp-ms分析富硒蛋白多糖硒形态的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于HPLC‑ICP‑MS分析富硒蛋白多糖硒形态的方法。富硒蛋白多糖中加入蛋白酶K和Tris‑HCl缓冲液，37℃恒温酶解18小时，并应用高效液相色谱电感耦合等离子体质谱（HPLC‑ICP‑MS）分析酶解上清液中的硒化合物：亚硒酸钠（Na2SeO3）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒甲基硒代半胱氨酸（SeMeCys）和硒代蛋氨酸（SeMet）。本发明方法酶解仅获得4种硒化合物，与标准品高度匹配，定量准确；回收率在78.35%~111.42%之间，该方法回收率高、条件温和、稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于HPLC-ICP-MS分析富硒蛋白多糖硒形态的方法。
背景技术
硒元素是许多酶如谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心（Jagtap，2016），同时，它具有抗癌和预防衰老等功能（Axley，1991）。然而，亚硒酸钠的需要量与中毒量之间范围很窄，并且硒发挥其生物学功能与其形态密切相关（Suhajda，2000）。无机硒主要有硒酸盐和亚硒酸盐两种形态，有机硒则有硒代氨基酸、硒代小肽以及硒代蛋白质三种形态（Maseko，2013）。有机硒与无机硒相比较，具有较高的生物活性和较低的毒性，更容易被机体吸收（Kieliszek，2013；Kouba，2014）。目前大多数研究侧重于对总硒的测定，但这对于硒的营养和毒性分析是远远不够的。因此，建立硒的形态分析方法是十分必要的。
为了在前处理过程中不改变硒的形态，选择合适的前处理方法十分重要。比较常见的有热水提取法和酸提取法（Tie，2015）。然而这两种方法适合提取无机硒及游离态的有机硒，而在提取硒代蛋氨酸（SeMet）和硒代半胱氨酸（SeCys）等与蛋白质结合的有机硒时效率很低（Zembrzuska，2014；Bierla，2008），另外，酸提取法条件难以控制，常常造成硒代氨基酸被破坏（Tie，2015）。酶解法相对温和，是对水溶性含硒化合物提取的补充，用于消化的酶有蛋白酶和脂肪酶等（Pedrero，2009），蛋白酶中使用较多的是XIV酶（Huerta，2004）。然而，一般酶解过程较长，大多数需要在37℃孵化24小时以上（Moreno，2001），并且在此过程中硒代化合物之间容易发生结构上的转化（Capelo，2004），文献报道，采用蛋白酶K和脂肪酶组合酶解葛根粉以获得硒代化合物（Yuping Cao，2016）。
就硒的形态检测而言，目前较为常用是高效液相色谱法（HPLC），如离子交换色谱法、反相色谱法、离子对色谱法以及体积排阻色谱法（Zheng，2000；Chen，2001；Casiot，1999）。上述色谱与电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）联用是近年发展起来的十分普遍的技术（Zheng，2000）。HPLC-ICP-MS（高效液相色谱电感耦合等离子体质谱）在硒的形态分析方面具有很高的灵敏度（Zhao，2011；Maneetong，2013；da Silva，2013；Torres，2016），并且样品通常不需要经过浓缩等有可能影响硒化合物组成的步骤（Tie，2014）。
发明内容
针对现有富硒蛋白多糖中硒形态分析技术的缺乏以及富硒蛋白多糖中硒形态检测的需要，本发明提供了一种基于HPLC-ICP-MS分析富硒蛋白多糖硒形态的方法，灵敏度高、准确度高、方法稳定。
一种基于HPLC-ICP-MS分析富硒蛋白多糖硒形态的方法，在待测富硒蛋白多糖Z0206中加入蛋白酶K，以Tris-HCl缓冲液作为媒介进行酶解，酶解时间为18h，应用HPLC-ICP-MS对酶解液中进行定量分析，得到4种硒化合物：亚硒酸钠（Na2SeO3）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒甲基硒代半胱氨酸（SeMeCys）和硒代蛋氨酸（SeMet）。
所述的HPLC-ICP-MS对酶解液中进行定量分析，通过参照标准曲线得到待测富硒蛋白多糖中硒化合物的含量。
所述的方法，具体步骤如下：
称取15 mg的富硒蛋白多糖于2 mL EP管中，加入5 mg蛋白酶K，再加入1.5 mL的Tris-HCl缓冲液，0.1 mol/L，pH=7.48，37℃下恒温200 rpm振荡18小时，然后将酶解液离心10 min，转速为6000 rpm/min，收集上清液，通过HPLC-ICP-MS对所得酶解液中硒化合物进行分离定量。
本发明的有益效果：
本发明采用蛋白酶K对Z0206富硒蛋白多糖进行水解，使结合态的硒游离出来成为水溶性的硒代化合物；筛选得到酶解效率更高的蛋白酶K用于Z0206富硒蛋白多糖水解；用Tris-HCl作为媒介，避免使用酸、碱等试剂，条件温和，易于控制；无需24小时或更长时间的酶解；至关重要也是出乎意料的是：使用上述方法酶解仅获得4种硒化合物，与标准品高度匹配，定量准确；回收率在78.35%~111.42%之间，该方法回收率高、方法稳定性好。
附图说明
图1是不同浓度混合标准溶液色谱图。
图2是富硒多糖色谱图。
图3A是Proteinase XIV的最佳酶解时间图。
图3B是Proteinase K的最佳酶解时间图。
图3C是不同酶的最佳酶解时间图。
图4 是Trypsin的酶解效果图。
图5A 是组合酶Proteinase XIV+ Proteinase K酶解液色谱图。
图5B是组合酶Proteinase XIV+Trypsin酶解液色谱图。
图5C是组合酶Proteinase K+Trypsin酶解液色谱图。
图5D是组合酶Proteinase XIV+ Proteinase K+Trypsin酶解液色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步详细的说明。
方法原理
Z0206富硒蛋白多糖中的硒结合在蛋白质上，在酶的作用下含硒蛋白质转变为水溶性硒化合物，通过与标样比对，应用HPLC-ICP-MS对富硒蛋白多糖中的硒化合物定性，并应用外标法对其定量。
操作步骤
准确称取15 mg左右的富硒蛋白多糖于2 mL离心管中，加入15 mg蛋白酶K，再加入1.5 mL的Tris-HCl缓冲液（0.1 mol/L，pH=7.48），37℃下恒温振荡18小时（200 rpm），然后将酶解液离心10 min，转速为6000 rpm/min，收集上清液，并应用HPLC-ICP-MS对酶解上清液中的硒化合物：Na2SeO3、SeCys2、SeMeCys和SeMet进行分析。
仪器与试剂
Thermo iCAP RQ电感耦合等离子体质谱仪（美国Thermo Fisher公司），Ultimate3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司），Hypersil GOLD C18色谱柱（美国ThermoFisher公司），参数见表1.
高速冷冻离心机（美国Thermo公司），摇床（上海溪乾仪器有限公司），纯水仪（日本Yamato公司）。
蛋白酶K（Tritirachium album，Sigm-Aldrich公司）、亚硒酸钠、硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸纯度均为98%，从上海百灵威公司购买。色谱纯甲醇来自Sigm-Aldrich公司，磷酸二氢钾和七氟丁酸等为分析纯，来自国药集团化学试剂有限公司。
Z0206富硒蛋白多糖和Z0206蛋白多糖由本实验室发酵（Xu，2009；Wang，2016）。
实施例1 标准曲线的绘制
准确称取25.0 mg Na2SeO3溶解在水中，配成50 µg/mL的Na2SeO3标准储备液；准确称取20.0 mg SeCys2，加入含稀酸的水中，配成200 µg/mL的标准储备液；准确称取20.0 mgSeMeCys，加入水中，配成200 µg/mL的标准储备液；准确称取20.0 mg SeMet，加入水中，配成200 µg/mL的标准储备液。将上述标准储备按比例进行混合，使得Na2SeO3、SeCys2、SeMeCys和SeMet浓度范围分别为5~250 µg/L、1~25 µg/L、1~25 µg/L、4~100 µg/L的系列混合标准工作液。按表1条件，应用HPLC-IPC-MS分析，制作标准曲线见表2。
实施例2 样品中Na2SeO3、SeCys2、SeMeCys和SeMet含量测定
分别准确称取5份15 mg左右的富硒蛋白多糖和蛋白多糖于2 mL离心管中，加入5mg蛋白酶K，再加入1.5 mL的Tris-HCl缓冲液（0.1 mol/L，pH=7.48），37℃下恒温振荡18小时（200 rpm），然后将酶解液离心10 min，转速为6000 rpm/min，收集上清液，并应用HPLC-ICP-MS对酶解上清液中的硒化合物：Na2SeO3、SeCys2、SeMeCys和SeMet进行分析。富硒蛋白多糖水解图见图2，含量测定结果见表3。
实施例3样品中Na2SeO3、SeCys2、SeMeCys和SeMet的回收率测定
准确称取3份15 mg的Z0206蛋白多糖于2 mL离心管中，按表4添加低、中、高4种混合标准物质，重复5次。分别加入15 mg蛋白酶K，再加入Tris-HCl缓冲液（0.1 mol/L，pH=7.48）至体系终体积为1.5 mL，37℃下恒温振荡18小时（200 rpm），然后将酶解液离心10min，转速为6000 rpm/min，收集上清液，并应用HPLC-ICP-MS对酶解上清液中的硒化合物：Na2SeO3、SeCys2、SeMeCys和SeMet进行分析并分别按照标准曲线计算Na2SeO3、SeCys2、SeMeCys和SeMet的含量和回收率。
根据以上实施例1-3得到的结果与讨论：
标准曲线的绘制
对Na2SeO3、SeCys2、SeMeCys和SeMet制作标准曲线，结果见表1。Na2SeO3线性回归方程为：y = 353.48x + 408.91（R2=0.999)；SeCys2线性回归方程为：y = 334.64x -28.919（R2=0.993)，SeMeCys线性回归方程为：y = 726.91x + 199.74（R2=0.996)，SeMet的线性回归方程分别为y = 551.89x - 1799.4（R2=0.999)。Na2SeO3在5~250 µg/L的浓度范围、SeCys2在1~25 µg/L的浓度范围，SeMeCys在1~25 µg/L的浓度范围，SeMet在4~100 µg/L的浓度范围内，浓度与面积均呈现良好的线性关系，所得R2均大于0.990，最低检出限（LOD）定义为3信躁比，最低定最限（LQD）定义为10倍信躁比，能达到本实验的检测要求。上述结果见表2所示。
酶解条件的选择和优化
（1）酶解时间的优化
使用三种酶（蛋白酶K，蛋白酶XIV和胰蛋白酶）在不同提取时间（6 h，12 h，18 h，24 h，30 h，36 h和72 h）提取Se-EPS。如图3A-图3C所示，蛋白酶XIV，蛋白酶K和胰蛋白酶的最佳提取时间分别为12h，18h，36h。
（2）酶种类的优化
使用三种酶（蛋白酶XIV，蛋白酶K和胰蛋白酶）分别对Se-EPS酶解12h，18h，36h，如图4所示，3种酶对硒代氨基酸的提取效率：蛋白酶K＞蛋白酶XIV＞胰蛋白酶。
（3）酶的组合使用及是否超滤
使用组合酶对Se-EPS进行酶解，如图5A-5D所示，组合酶酶解时会引入杂质，使得样品中的硒代氨基酸不易定性和定量。我们采用3 KDa的超滤离心管对酶解液进行超滤，以去掉杂质的影响，结果发现超滤会造成氨基酸的大量损失。因此，在后续的实验中并未采取组合酶和超滤的方法。
综上，最终确立提取硒代氨基酸的最优酶解条件为：使用蛋白酶K对样品酶解18h。
Na2SeO3、SeCys2、SeMeCys和SeMet含量测定结果
5次测得富硒蛋白多糖中Na2SeO3、SeCys2、SeMeCys和SeMet含量分别为648.53±29.76 µg/g、0.25±0.05 µg/g和43.16±4.91 µg/g，结果见表3。向蛋白糖样品中分别添加150 µL的Na2SeO3、SeCys2、SeMeCys和SeMet系列标准溶液，计算回收率，回收率在78.35%~111.42%之间，方法可靠。结果如表4所示。
Claims (2)
1.一种基于HPLC-ICP-MS分析富硒蛋白多糖硒形态的方法，其特征是：在待测富硒蛋白多糖Z0206中加入蛋白酶K，以Tris-HCl缓冲液作为媒介进行酶解，酶解时间为18h，应用HPLC-ICP-MS对酶解液中进行定量分析，得到4种硒化合物：亚硒酸钠Na2SeO3、硒代胱氨酸SeCys2、硒甲基硒代半胱氨酸SeMeCys和硒代蛋氨酸SeMet；所述HPLC-ICP-MS使用的是反相色谱和Hypersil GOLD C18色谱柱；所述反相色谱的流动相为20mM磷酸二氢钾+甲醇，95：5；其中磷酸二氢钾pH 3.7，含0.1%七氟丁酸；
所述方法具体步骤如下：
称取15 mg的富硒蛋白多糖于2 mL EP管中，加入5 mg蛋白酶K，再加入1.5 mL的Tris-HCl缓冲液，0.1 mol/L，pH=7.48，37℃下恒温200 rpm振荡18小时，然后将酶解液离心10min，转速为6000 rpm/min，收集上清液，通过HPLC-ICP-MS对所得酶解液中硒化合物进行分离定量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的HPLC-ICP-MS对酶解液中进行定量分析，通过参照标准曲线得到待测富硒蛋白多糖中硒化合物的含量。
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