CN113325105A - 一种富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，将富硒鱼捣碎用Tris‑HCl缓冲溶液溶解鱼肉样品；在得到的混合溶液中依次加入胰蛋白酶和蛋白酶K酶解；将得到的酶解液离心，在上清液中加入乙腈后静置，再得到上清液，将上清液过滤后得到待测液；将系列标准溶液中的硒代蛋氨酸分离后进行检测，绘制基质匹配标准曲线；使用高效液相色谱将待测液中的硒代蛋氨酸分离后检测，根据母离子及子离子构成的离子对提取色谱峰，通过积分得到色谱峰面积；将通过待测液得到的色谱峰面积带入基质匹配标准曲线中，根据上清液的体积和鱼肉样品的质量，得到富硒鱼中硒代蛋氨酸的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及硒代蛋氨酸检测技术领域，具体为一种富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法。
背景技术
硒是人体必需的一种微量营养素，在甲状腺激素代谢、抗氧化防御系统和免疫功能等几个主要代谢途径中起着关键作用。硒的缺乏与一系列严重的疾病有关，如癌症、心血管疾病和炎症性疾病，以及其他与自由基有关的问题，如过早衰老。人类对硒的需求主要是通过饮食获得的，其中包括无机形态(硒酸盐和亚硒酸盐)和有机形态(主要是硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸)。虽然硒对人类健康有着重要的作用，但长期口服过量硒会导致硒中毒，无论是有机硒还是无机硒，只有在推荐摄入量范围内使用才是安全的。
目前市面上出售的富硒食品和药物的标签，只提供总硒量，并没有提供不同形态硒的具体含量。硒的化学形态而不是其总含量或浓度决定了硒的生物利用率、毒性和生物效应。因此，在评价食物中硒化合物的营养价值和推荐摄入量时，除应考虑总硒浓度外，还应考虑食物中硒化合物的化学形态。总硒量的检测已不能满足富硒产业发展的需求，应加大对各种硒形态的分析。目前检测硒形态的主要技术手段是高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)，这种方法是将有机形态硒经过消解转化为无机硒再进行检测，通过保留时间对不同形态硒进行定性，虽然该方法灵敏度高，检出限低，但是该方法存在较多的多原子离子干扰，需要在ICP-MS前加电热蒸发或反向气，以减少干扰离子，分离时间较长。
相较于HPLC-ICP-MS，高效液相色谱-电喷雾质谱技术(HPLC-ESI-MS)具有灵敏度高、检出限低、选择性好，分析速度快等优点。由于多反应监测(英文名称为multiplereaction monitoring，简写为MRM)技术在质谱检测中的应用，使得在检测过程中有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，可以有效降低背景噪音，提高信噪比。
鱼是高蛋白、低脂、低热量的肉类食品，鱼肉含有非常丰富的蛋白质，大多数鱼的蛋白质含量都在20％左右，而且鱼的蛋白质是全蛋白质，必需氨基酸的含量和比例都是比较适合人体的，所以更容易消化吸收。另外，食用富硒的动物肉蛋的效果显著好于补充无机硒、植物态硒，这是因为在富硒蛋或富硒肉中硒元素主要存在于硒蛋白或含硒蛋白中。因此，富硒鱼是人们选择富硒食品时一个较好的选择，但HPLC-ESI-MS技术应用于富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测还未见报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，灵敏度高，重现性好，可准确分析出富硒鱼中硒代蛋氨酸的浓度值。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，将待检测的富硒鱼样品捣碎后形成鱼肉样品，用pH值为7.2～7.5的Tris-HCl缓冲溶液溶解鱼肉样品，得到混合溶液；
步骤2，在混合溶液中依次加入胰蛋白酶和蛋白酶K进行酶解，得到酶解液；
步骤3，将酶解液离心，得到第一上清液，在第一上清液中加入乙腈后静置，得到第二上清液，将第二上清液过滤后得到待测液；
步骤4，使用高效液相色谱将硒代蛋氨酸基质匹配的系列标准溶液中的硒代蛋氨酸分离后通过电喷雾质谱法进行检测，根据提取到的色谱峰面积与硒代蛋氨酸基质匹配标准溶液中硒代蛋氨酸的浓度绘制基质匹配标准曲线；
使用高效液相色谱将待测液中的硒代蛋氨酸分离后通过电喷雾质谱法进行检测，根据硒代蛋氨酸的母离子及子离子构成的离子对提取色谱峰，通过积分得到色谱峰面积；
步骤5，将通过待测液得到的色谱峰面积带入基质匹配标准曲线中，得到待测液中硒代蛋氨酸的浓度，再根据第二上清液的体积、第一上清液的体积和鱼肉样品的质量，得到富硒鱼中硒代蛋氨酸的浓度。
优选的，步骤1中所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为30～50mM。
进一步，步骤1所述鱼肉样品与Tris-HCl缓冲溶液的比例为1g：20mL。
优选的，步骤2所述的胰蛋白酶与鱼肉样品的质量比为(1～2)：200，酶解温度为30～50℃；蛋白酶K与鱼肉样品的质量比为(1～2)：200，酶解温度为50～70℃。
进一步，所述的胰蛋白酶在30～50℃下震荡提取4～6h；蛋白酶K在50～70℃下震荡提取4～6h。
优选的，步骤3所述的离心在8000～10000rpm的速率下进行10～30min。
进一步，加入乙腈的体积与第一上清液的体积相同，静置时间为10～30min。
优选的，步骤3中，第二上清液用0.22μm的水系微孔滤膜进行过滤，得到待测液。
优选的，步骤4中所用的高效液相色谱具体参数如下：
色谱柱为Hypersil GOLD柱，流动相A为甲酸的水溶液，甲酸的体积占溶液体积的0.2％；流动相B为甲酸的乙腈溶液，甲酸的体积占溶液体积的0.2％；
流动相梯度洗脱程序为：0-3min内，流动相A的体积比例由0线性增加至20％；3min-6min内，流动相A的体积比例由20％线性增加至30％；6min-12min内，流动相A的体积由30％线性增加至40％；12min-12.1min内，流动相A的体积比例由40％线性减小至0；12.1min-15min内，流动相A的比例保持0。
优选的，步骤4中所用的电喷雾质谱法具体参数如下：
毛细管电压在正离子模式下为3～3.5kV，离子源温度为320～350℃，全扫描模式下，分辨率设定为35000～70000FWHM，自动增益控制的目标值定为1.0～5.0×106，扫描范围为70-400m/z，最大注入时间为100ms；
二级扫描方式为全扫描/数据依赖扫描模式，分辨率设定为17500～35000FWHM，自动增益控制的目标值定为1.0～5.0×105，触发时间为3-6s，最大注入时间为35ms，动态背景扣除为10.0～15.0s。
相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明一种富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，根据富硒鱼中硒代蛋氨酸的存在状态，建立了其提取方法，具体是利用Tris-HCl缓冲溶液来溶解鱼肉样品中的有效全蛋白质，之后加入胰蛋白酶和蛋白酶K进行酶解，胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，属于特异性最强的蛋白酶，而蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，可以切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，因此使用这两种蛋白酶酶解可以使硒代蛋氨酸更好地游离出来，使用离心便可分离出硒代蛋氨酸，再向第一上清液中加入乙腈可沉淀不需要的蛋白质，使上清液中主要含有硒代蛋氨酸，这样过滤后形成的待测液可使用高效液相色谱分离出硒代蛋氨酸，再用电喷雾质谱法进行检测，该方法选择性好，灵敏度高，可得到硒代蛋氨酸的母离子及子离子构成的离子对，通过该离子对提取色谱峰，通过积分得到色谱峰面积，结合相同方法得到的基质匹配标准曲线可得到待测液的浓度，最后再根据第二上清液的体积、第一上清液的体积和鱼肉样品的质量，可方便地求得到富硒鱼中硒代蛋氨酸的浓度。本发明建立的富硒鱼中硒代蛋氨酸的提取及检测方法对评价富硒鱼的质量具有重要意义，也可为人们合理消费富硒食品提供参考。
附图说明
图1为本发明所述方法的系统化流程图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明原理及优势进行解释和说明，以便本领域技术人员更好的理解本发明。下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限定。
本发明一种富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，如图1所示，包括以下步骤：
步骤1，将捣碎后的富硒鱼样品溶解；
具体地，将待提取的富硒鱼样品使用研钵捣碎后，装于离心管中，使用pH值为7.2～7.5、浓度为30～50mM的Tris-HCl缓冲溶液溶解，鱼肉样品与Tris-HCl缓冲溶液的比例为1g:20mL。
步骤2，使用胰蛋白酶和蛋白酶K进行酶解，胰蛋白酶的用量为5～10mg，酶解条件为30～50℃，震荡提取4～6h；蛋白酶K的用量为5～10mg，酶解条件为50～70℃，震荡提取4～6h；
具体地，胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，是特异性最强的蛋白酶；蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，可以切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，使用两种蛋白酶可以使硒代蛋氨酸更好地游离。
步骤3：酶解后离心，离心速率为8000～10000rpm，15～30min，取上清液，加入等体积的乙腈沉淀蛋白质后静置10～30min，再次离心，以便将蛋白质去除，得到上清液；
具体地，经过酶解，与蛋白质结合的硒代蛋氨酸转化为游离态，存在于上清液中。
步骤4：离心后的上清液过0.22μm水系微孔滤膜，得到待测样液。
步骤5：使用高效液相色谱-电喷雾质谱法对待测样液进行检测。
色谱条件：
色谱柱为Hypersil GOLD柱，规格为(100×2.1mm，5μm)，(Thermo FisherScientific公司)；
流动相A为甲酸的水溶液，甲酸体积占溶液体积的2％；流动相B为甲酸的乙腈溶液，甲酸的体积占溶液体积的0.2％；
流动相梯度洗脱程序为：0-3min内，流动相A的体积比例由0线性增加至20％；3min-6min内，流动相A的体积比例由20％线性增加至30％；6min-12min内，流动相A的体积由30％线性增加至40％；12min-12.1min内，流动相A的体积比例由40％线性减小至0；12.1min-15min内，流动相A的比例保持0。
柱温：25℃，进样体积：10μL。
质谱条件：
电喷雾离子化(ESI)，采用正模式；鞘气的压力为40～50arb，辅助气的压力为10～15arb；
毛细管电压：正离子模式下3～3.5kV；离子源温度：320～350℃；
全扫描模式下，分辨率设定为35000～70000FWHM，自动增益控制的目标值定为1.0～5.0×106，扫描范围为70-400m/z，最大注入时间为100ms。
二级扫描方式为全扫描/数据依赖扫描模式(英文名称为Full MS/dd-MS2)，分辨率设定为17500～35000FWHM，自动增益控制的目标值定为1.0～5.0×105，触发时间(英文名称为Apex Trigger)为3-6s，最大注入时间为35ms，动态背景扣除为10.0～15.0s，选择TOP 5模式。
下面以富硒鱼为例进行具体说明。
实施例
本发明一种天然富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法：
1、硒代蛋氨酸标准储备液的配制
精密称取硒代蛋氨酸标品10mg于10mL棕色容量瓶中，加水溶解后加乙腈定容至刻度，摇匀，作为标准储备液。
2、检出限和定量限
取硒代蛋氨酸标准储备液,用空白样品提取液逐级稀释,配置基质匹配的系列标准溶液，浓度范围为0-150μg/L，按照上述方法进行检测。以色谱峰面积(Y)为纵坐标,浓度(X)为横坐标绘制基质匹配标准曲线,以信噪比S/N≥3和S/N≥10计算该方法的检出限(英文名称为limit of detection,简写为LOD)和定量限(英文名称为limit ofquantitation,简写为LOQ)。得到检出限为0.52μg/L，定量限为1.73μg/L。
3、基质效应、回收率和精密度
用空白基质提取液逐级稀释硒代蛋氨酸标准储备液,获得基质匹配标准曲线溶液；同时用乙腈按照相同的稀释倍数稀释硒代蛋氨酸标准储备溶液,得到与基质匹配标准曲线溶液相对应的溶剂标准曲线溶液。
基质效应系数以η表示：η＝(基质匹配标准曲线的斜率-溶剂标准曲线的斜率)/溶剂标准曲线的斜率。选择空白基质，硒代蛋氨酸的加标水平分别为50μg/L、100μg/L、150μg/L，每个添加水平进行6次平行实验，计算回收率和精密度。得到基质效应为-22％，表现为基质抑制效应，回收率为89％-101.9％，相对标准偏差(英文简写为RSD)为2.4％-6.8％。
4、样品前处理
将富硒鱼用研钵捣碎后精密称取2g于50mL离心管中，加入40mLTris-HCl缓冲溶液(浓度为30mM，pH为7.5)；
向上述体系中，加入10mg胰蛋白酶，在37℃水浴下震荡提取4h后，加入10mg蛋白酶K，在50℃水浴下震荡提取4h；
酶解结束后在10000rpm条件下，离心20min，离心后取上清液10mL，加入等体积的乙腈，静置10min，然后再次离心，条件为10000rpm，20min；将离心所得上清液过0.22μm滤膜得到待测样液。
5、样品检测
使用高效液相色谱-电喷雾质谱法进行检测。
其中色谱条件：色谱柱：Hypersil GOLD柱，100×2.1mm，5μm(Thermo FisherScientific公司)；流动相：0.2％甲酸+水(A)，0.2％甲酸+乙腈(B)；流动相梯度洗脱程序：0-3min，0％-20％A；3-6min，20％-30％A；6-12min，30％-40％A；12-12.1min，40％-0％A；12.1-15min，0％A。柱温：25℃，进样体积：10μL。
质谱条件：电喷雾离子化(ESI)，采用正模式；鞘气的压力为48arb，辅助气的压力为10arb；
毛细管电压：正离子模式3.5kV；离子源温度：350℃；
全扫描模式下(Full Scan)，分辨率设定70000FWHM，自动增益控制的目标值(AGC)定为1.0×106，扫描范围70-400m/z，最大注入时间100ms。
二级扫描方式为全扫描/数据依赖扫描模式(Full MS/dd-MS2)，分辨率设定为35000FWHM，自动增益控制的目标值定为1.0×105，触发时间(Apex Trigger)为3-6s，最大注入时间35ms，动态背景扣除为10.0s，选择TOP 5模式。
利用高效液相色谱较好的分离能力，将即硒代蛋氨酸在保留时间为4.41min时洗脱出来进入质谱，根据待测组分的保留时间与标品的保留时间可确定样品中含有硒代蛋氨酸。
根据硒代蛋氨酸的母离子及子离子构成的离子对进行定性及定量，即根据该离子对提取色谱峰，通过积分得到色谱峰面积。使用基质匹配外标法进行定量，即根据基质匹配标准曲线计算待测液中硒代蛋氨酸的浓度，计算所得值为1.82μg/L。根据样品前处理过程反推样品中硒代蛋氨酸的含量。待测液的体积为20mL，计算待测液中硒代蛋氨酸含量为0.0364μg，第一次离心后取上清液10mL，即10mL上清液中硒代蛋氨酸含量为0.0364μg；第一次离心得到上清液为38mL，取10mL上清液，换算得38mL上清液中硒代蛋氨酸含量为0.1383μg，即2g鱼肉中硒代蛋氨酸含量为0.1383μg，经换算可得到鱼肉样品中硒代蛋氨酸的含量为69.15μg/kg。
Claims (10)
1.一种富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将待检测的富硒鱼样品捣碎后形成鱼肉样品，用pH值为7.2～7.5的Tris-HCl缓冲溶液溶解鱼肉样品，得到混合溶液；
步骤2，在混合溶液中依次加入胰蛋白酶和蛋白酶K进行酶解，得到酶解液；
步骤3，将酶解液离心，得到第一上清液，在第一上清液中加入乙腈后静置，得到第二上清液，将第二上清液过滤后得到待测液；
步骤4，使用高效液相色谱将硒代蛋氨酸基质匹配的系列标准溶液中的硒代蛋氨酸分离后通过电喷雾质谱法进行检测，根据提取到的色谱峰面积与硒代蛋氨酸基质匹配标准溶液中硒代蛋氨酸的浓度绘制基质匹配标准曲线；
使用高效液相色谱将待测液中的硒代蛋氨酸分离后通过电喷雾质谱法进行检测，根据硒代蛋氨酸的母离子及子离子构成的离子对提取色谱峰，通过积分得到色谱峰面积；
步骤5，将通过待测液得到的色谱峰面积带入基质匹配标准曲线中，得到待测液中硒代蛋氨酸的浓度，再根据第二上清液的体积、第一上清液的体积和鱼肉样品的质量，得到富硒鱼中硒代蛋氨酸的浓度。
2.根据权利要求1所述的富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，其特征在于，步骤1中所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为30～50mM。
3.根据权利要求2所述的富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，其特征在于，步骤1所述鱼肉样品与Tris-HCl缓冲溶液的比例为1g：20mL。
4.根据权利要求1所述的富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，其特征在于，步骤2所述的胰蛋白酶与鱼肉样品的质量比为(1～2)：200，酶解温度为30～50℃；蛋白酶K与鱼肉样品的质量比为(1～2)：200，酶解温度为50～70℃。
5.根据权利要求4所述的富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，其特征在于，所述的胰蛋白酶在30～50℃下震荡提取4～6h；蛋白酶K在50～70℃下震荡提取4～6h。
6.根据权利要求1所述的富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，其特征在于，步骤3所述的离心在8000～10000rpm的速率下进行10～30min。
7.根据权利要求6所述的富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，其特征在于，加入乙腈的体积与第一上清液的体积相同，静置时间为10～30min。
8.根据权利要求1所述的富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，其特征在于，步骤3中，第二上清液用0.22μm的水系微孔滤膜进行过滤，得到待测液。
9.根据权利要求1所述的富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，其特征在于，步骤4中所用的高效液相色谱具体参数如下：
色谱柱为Hypersil GOLD柱，流动相A为甲酸的水溶液，甲酸的体积占溶液体积的0.2％；流动相B为甲酸的乙腈溶液，甲酸的体积占溶液体积的0.2％；
流动相梯度洗脱程序为：0-3min内，流动相A的体积比例由0线性增加至20％；3min-6min内，流动相A的体积比例由20％线性增加至30％；6min-12min内，流动相A的体积由30％线性增加至40％；12min-12.1min内，流动相A的体积比例由40％线性减小至0；12.1min-15min内，流动相A的比例保持0。
10.根据权利要求1所述的富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法，其特征在于，步骤4中所用的电喷雾质谱法具体参数如下：
毛细管电压在正离子模式下为3～3.5kV，离子源温度为320～350℃，全扫描模式下，分辨率设定为35000～70000FWHM，自动增益控制的目标值定为1.0～5.0×106，扫描范围为70-400m/z，最大注入时间为100ms；
二级扫描方式为全扫描/数据依赖扫描模式，分辨率设定为17500～35000FWHM，自动增益控制的目标值定为1.0～5.0×105，触发时间为3-6s，最大注入时间为35ms，动态背景扣除为10.0～15.0s。
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