CN112630338B - 反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法 - Google Patents

反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法。所述检测方法包括如下步骤：采用水提取蚯蚓样品，离心后取上清夜，经稀释后进行反相高效液相色谱串联质谱检测，得到待测蚯蚓样品中亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的峰面积；根据每种氨基酸的峰面积与浓度之间的标准曲线，即得到蚯蚓样品中各氨基酸的浓度。本发明与以往检测氨基酸的方法相比，减少了繁琐的衍生化过程，并且前处理较为简单，直接用水提取即可，避免使用有机有毒试剂，对研究者而言是一种更加有益健康的方法，还能为生物毒理学研究提供可靠的理论支撑。

Description

反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检 测方法
技术领域
本发明涉及一种反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法。
背景技术
七种氨基酸(亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)除了合成多肽和蛋白质外，还参与一些特殊的代谢反应，而代谢过程可以直接反映生物体在当前所处的生理环境的变化情况。这7种代谢物的变化主要影响机体的三羧酸循环过程。三羧酸循环是三大营养素(氨基酸、糖类和脂类)的最终代谢途径，又是这三种主要代谢相互联系的枢纽。这些代谢物的显著变化严重影响了三羧酸循环过程，导致机体的各代谢之间的不协调，从而影响机体的正常生命活动。
目前，大量的代谢组学研究都采用核磁共振光谱对代谢物进行检测和分析，但是由于核磁共振低灵敏度的局限性与生物样品的复杂性导致核磁共振光谱检测较为有限。而高效液相色谱串联电喷雾三重四极杆质谱(HPLC-ESI-MS)因其灵敏度和限行范围方面具有的优势被大量使用测定代谢物。联用技术的使用为生物代谢物来了极大的方便。如中国专利申请(公开号CN111638293A)公开了一种采用LC-MS/MS同时检测动物组织中的氨基酸和核苷酸的检测方法。该方法采用LC-MS/MS同时检测动物组织中的氨基酸和核苷酸，采用超高效液相色谱-静电离子轨道肼质谱系统可以同时采用正负离子模式检测氨基酸和核苷酸，这对与质谱仪器的要求较高，仪器使用费用消耗非常大，并且仪器价格昂贵，使用的几率较低。如中国专利申请(公开号为CN111307975A)公开了一种采用HPLC-FLD分离测定小鼠皮层中8中氨基酸的检测方法。该方法中需采用衍生化试剂进行衍生化反应之后，检测化合物的不同吸光度，从而获得化合物含量，增加了检测的复杂性，衍生化试剂的配制与进行衍生化反应，可以引入实验的系统误差，导致结果的误差值变大。在检测中，要求实验的系统误差尽可能的小，以确保实验结果的准确度高。因此有必要对现有检测方法进行改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用反相高效液相色谱串联质谱检测蚯蚓体内氨基酸的方法，省去繁琐的衍生化过程，避免其他离子的干扰，可以在短时间内实现多种代谢物的同时检测，为生物代谢物大量同时检测提供理论依据。
本发明所提供的反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法，包括如下步骤：
采用水提取蚯蚓样品，离心后取上清夜，经稀释后进行反相高效液相色谱串联质谱检测，得到待测蚯蚓样品中亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的峰面积；
根据每种氨基酸的峰面积与浓度之间的标准曲线，即得到蚯蚓样品中各氨基酸的浓度。
上述的检测方法中，所述反相高效液相色谱串联质谱检测的条件如下：
液相条件为：
色谱柱为：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱；
流动相A：体积比为1000：1的水与甲酸的混合液；
流动相B：体积比为1000：1的乙腈与甲酸的混合液；
梯度洗脱的程序如下：
0～1min，流动相A的体积分数为99％；
1～8min，流动相A的体积分数由99％下降至90％；
8～9min，流动相A的体积分数保持为90％；
9.01～10min，流动相A的体积分数由90％上升至99％；
流速为0.2mL/min；
柱温为30℃；
进样量为5μL。
质谱条件为：
采用正离子监测模式(MRM)进行检测；
子离子、碎裂电压和碰撞能参数如下表1所示：
表1母离子、子离子、碎裂电压和碰撞能参数
Figure BDA0002843564450000021
上述的检测方法中，所述提取的步骤如下：
向所述蚯蚓样品中加入水后依次经涡旋和超声，然后加入蛋白酶XIV，再次涡旋后于室温下黑暗振荡12～36h，如24h；然后置于55～6℃的热水浴中进行超声辅助提取，如60℃。
上述的检测方法中，所述水的添加量为45～55ml/g蚯蚓样品，如50ml/g。
上述的检测方法中，加入所述蛋白酶XIV前，所述涡旋的时间为30～60s，如30s，所述超声的时间为5～15min，如10min。
上述的检测方法中，加入所述蛋白酶XIV后，所述涡旋的时间为0.5～1.5min，如1min，所述振荡的时间为18～32h，如24h。
上述的检测方法中，所述超声辅助提取的时间为1～2h，如1h。
本发明与以往检测氨基酸的方法相比，减少了繁琐的衍生化过程，并且前处理较为简单，直接用水提取即可，避免使用有机有毒试剂，对研究者而言是一种更加有益健康的方法，还能为生物毒理学研究提供可靠的理论支撑。
附图说明
图1为各氨基酸的标准曲线，图中，Ala表示丙氨酸，Gly表示甘氨酸，Leu表示亮氨酸，Lys表示赖氨酸，Phe表示苯丙氨酸，Tyr表示酪氨酸，Val表示缬氨酸。
图2为各氨基酸在不同亚硒酸钠暴露浓度下的含量，从左至右依次为0.15mg/kg、0.3mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、70mg/kg。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、检测亚硒酸钠暴露的蚯蚓体内氨基酸含量为例：
(1)样品前处理：称取蚯蚓样品0.1g于15mL离心管中，加5mL超纯水，涡旋30s，超声10min，加2mg蛋白酶XIV，涡旋1min，在室温下黑暗振荡24h，在60℃的热水浴中超声辅助提取1h，在4℃下，离心(5300r·min-1)45min，离心后立即将上清液移出并用超纯水稀释1000倍后，通过注射器过滤器(PTFE 0.22μm)过滤，放入进样瓶中上机。
(2)建立标准曲线
配制一系列不同浓度的各种氨基酸的标准溶液，进行检测，得到各氨基酸的峰面积与浓度之间的标准曲线如图1所示。
其中，液相色谱条件如下：
使用以微粒C18为填料的ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱。
高效液相色谱仪设置参数如下：水-甲酸(1000：1)为流动相A，以乙腈-甲酸(1000：1)为流动相B，梯度洗脱：0～1min：99％A，8min：90％A，8～9min：90％A，9.01～10min：99％A；流速为0.2mL/min；柱温30℃；进样量5μL。
质谱采用MRM正离子监测模式进行检测，子离子、碎裂电压和碰撞能参数如表1所示。
表1母离子、子离子、碎裂电压和碰撞能参数
Figure BDA0002843564450000041
(3)暴露后蚯蚓体内氨基酸的浓度的测定：
检测暴露后的蚯蚓，得出各氨基酸的峰面积，依据标准曲线得到各氨基酸的含量，如图2所示，可以看出，不同暴露浓度对蚯蚓的生长代谢影响不同，高浓度的亚硒酸钠对蚯蚓的代谢影响程度更大。
本发明检测方法，前处理简单，并且不使用有机有毒试剂，可直接纯水提取蚯蚓体内游离氨基酸的液相色谱串联质谱的检测方法，大大节省了检测时间，提高检测效率，为生物毒理学研究提供一定的理论与技术支持。

Claims (5)

1.一种反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法，包括如下步骤：
采用水提取蚯蚓样品，离心后取上清夜，经稀释后进行反相高效液相色谱串联质谱检测，得到待测蚯蚓样品中亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的峰面积；
根据每种氨基酸的峰面积与浓度之间的标准曲线，即得到蚯蚓样品中各氨基酸的浓度；
所述反相高效液相色谱串联质谱检测的条件如下：
液相条件为：
色谱柱为：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱；
流动相A：体积比为1000：1的水与甲酸的混合液；
流动相B：体积比为1000：1的乙腈与甲酸的混合液；
梯度洗脱的程序如下：
0～1min，流动相A的体积分数为99％；
1～8min，流动相A的体积分数由99％下降至90％；
8～9min，流动相A的体积分数保持为90％；
9.01～10min，流动相A的体积分数由90％上升至99％；
流速为0.2mL/min；
柱温为30℃；
进样量为5μL；
所述反相高效液相色谱串联质谱检测的条件如下：
质谱条件为：
采用正离子监测模式进行检测，其中，酪氨酸的参数为：母离子的m/z为182.2，子离子的m/z为165.2，碎裂电压为75V，碰撞能为6eV；苯丙氨酸的参数为：母离子的m/z为166，子离子的m/z为120.1，碎裂电压为95V，碰撞能为15eV；赖氨酸的参数为：母离子的m/z为147.2，子离子的m/z为84.1，碎裂电压为80V，碰撞能为16eV；亮氨酸的参数为：母离子的m/z为132.2，子离子的m/z为86.1，碎裂电压为55V，碰撞能为9eV；缬氨酸的参数为：母离子的m/z为118.2，子离子的m/z为72.1，碎裂电压为44V，碰撞能为5eV；丙氨酸的参数为：母离子的m/z为90.1，子离子的m/z为44.1，碎裂电压为22V，碰撞能为15eV；甘氨酸的参数为：母离子的m/z为76.1，子离子的m/z为30.2，碎裂电压为80V，碰撞能为8eV；
所述提取的步骤如下：
向所述蚯蚓样品中加入水后依次经涡旋和超声，然后加入蛋白酶XIV，再次涡旋后于室温下黑暗振荡；然后置于55～65℃的热水浴中进行超声辅助提取。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述水的添加量为45～55ml/g蚯蚓样品。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：加入所述蛋白酶XIV前，所述涡旋的时间为30～60s，所述超声的时间为5～15min。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：加入所述蛋白酶XIV后，所述涡旋的时间为0.5～1.5min，所述振荡的时间为18～32h。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述超声辅助提取的时间为1～2h。
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