CN112630338A - 反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法 - Google Patents

反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112630338A
CN112630338A CN202011500831.7A CN202011500831A CN112630338A CN 112630338 A CN112630338 A CN 112630338A CN 202011500831 A CN202011500831 A CN 202011500831A CN 112630338 A CN112630338 A CN 112630338A
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection method
earthworm
mass spectrometry
performance liquid
liquid chromatography
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011500831.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112630338B (zh
Inventor
史雅娟
邵秀清
梁若玉
宋帅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Original Assignee
Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS filed Critical Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Priority to CN202011500831.7A priority Critical patent/CN112630338B/zh
Publication of CN112630338A publication Critical patent/CN112630338A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112630338B publication Critical patent/CN112630338B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明公开了一种反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法。所述检测方法包括如下步骤：采用水提取蚯蚓样品，离心后取上清夜，经稀释后进行反相高效液相色谱串联质谱检测，得到待测蚯蚓样品中亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的峰面积；根据每种氨基酸的峰面积与浓度之间的标准曲线，即得到蚯蚓样品中各氨基酸的浓度。本发明与以往检测氨基酸的方法相比，减少了繁琐的衍生化过程，并且前处理较为简单，直接用水提取即可，避免使用有机有毒试剂，对研究者而言是一种更加有益健康的方法，还能为生物毒理学研究提供可靠的理论支撑。

Description

反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检 测方法
技术领域
本发明涉及一种反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法。
背景技术
七种氨基酸(亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)除了合成多肽和蛋白质外，还参与一些特殊的代谢反应，而代谢过程可以直接反映生物体在当前所处的生理环境的变化情况。这7种代谢物的变化主要影响机体的三羧酸循环过程。三羧酸循环是三大营养素(氨基酸、糖类和脂类)的最终代谢途径，又是这三种主要代谢相互联系的枢纽。这些代谢物的显著变化严重影响了三羧酸循环过程，导致机体的各代谢之间的不协调，从而影响机体的正常生命活动。
目前，大量的代谢组学研究都采用核磁共振光谱对代谢物进行检测和分析，但是由于核磁共振低灵敏度的局限性与生物样品的复杂性导致核磁共振光谱检测较为有限。而高效液相色谱串联电喷雾三重四极杆质谱(HPLC-ESI-MS)因其灵敏度和限行范围方面具有的优势被大量使用测定代谢物。联用技术的使用为生物代谢物来了极大的方便。如中国专利申请(公开号CN111638293A)公开了一种采用LC-MS/MS同时检测动物组织中的氨基酸和核苷酸的检测方法。该方法采用LC-MS/MS同时检测动物组织中的氨基酸和核苷酸，采用超高效液相色谱-静电离子轨道肼质谱系统可以同时采用正负离子模式检测氨基酸和核苷酸，这对与质谱仪器的要求较高，仪器使用费用消耗非常大，并且仪器价格昂贵，使用的几率较低。如中国专利申请(公开号为CN111307975A)公开了一种采用HPLC-FLD分离测定小鼠皮层中8中氨基酸的检测方法。该方法中需采用衍生化试剂进行衍生化反应之后，检测化合物的不同吸光度，从而获得化合物含量，增加了检测的复杂性，衍生化试剂的配制与进行衍生化反应，可以引入实验的系统误差，导致结果的误差值变大。在检测中，要求实验的系统误差尽可能的小，以确保实验结果的准确度高。因此有必要对现有检测方法进行改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用反相高效液相色谱串联质谱检测蚯蚓体内氨基酸的方法，省去繁琐的衍生化过程，避免其他离子的干扰，可以在短时间内实现多种代谢物的同时检测，为生物代谢物大量同时检测提供理论依据。
本发明所提供的反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法，包括如下步骤：
采用水提取蚯蚓样品，离心后取上清夜，经稀释后进行反相高效液相色谱串联质谱检测，得到待测蚯蚓样品中亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的峰面积；
根据每种氨基酸的峰面积与浓度之间的标准曲线，即得到蚯蚓样品中各氨基酸的浓度。
上述的检测方法中，所述反相高效液相色谱串联质谱检测的条件如下：
液相条件为：
色谱柱为：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱；
流动相A：体积比为1000：1的水与甲酸的混合液；
流动相B：体积比为1000：1的乙腈与甲酸的混合液；
梯度洗脱的程序如下：
0～1min，流动相A的体积分数为99％；
1～8min，流动相A的体积分数由99％下降至90％；
8～9min，流动相A的体积分数保持为90％；
9.01～10min，流动相A的体积分数由90％上升至99％；
流速为0.2mL/min；
柱温为30℃；
进样量为5μL。
质谱条件为：
采用正离子监测模式(MRM)进行检测；
子离子、碎裂电压和碰撞能参数如下表1所示：
表1母离子、子离子、碎裂电压和碰撞能参数
Figure BDA0002843564450000021
上述的检测方法中，所述提取的步骤如下：
向所述蚯蚓样品中加入水后依次经涡旋和超声，然后加入蛋白酶XIV，再次涡旋后于室温下黑暗振荡12～36h，如24h；然后置于55～6℃的热水浴中进行超声辅助提取，如60℃。
上述的检测方法中，所述水的添加量为45～55ml/g蚯蚓样品，如50ml/g。
上述的检测方法中，加入所述蛋白酶XIV前，所述涡旋的时间为30～60s，如30s，所述超声的时间为5～15min，如10min。
上述的检测方法中，加入所述蛋白酶XIV后，所述涡旋的时间为0.5～1.5min，如1min，所述振荡的时间为18～32h，如24h。
上述的检测方法中，所述超声辅助提取的时间为1～2h，如1h。
本发明与以往检测氨基酸的方法相比，减少了繁琐的衍生化过程，并且前处理较为简单，直接用水提取即可，避免使用有机有毒试剂，对研究者而言是一种更加有益健康的方法，还能为生物毒理学研究提供可靠的理论支撑。
附图说明
图1为各氨基酸的标准曲线，图中，Ala表示丙氨酸，Gly表示甘氨酸，Leu表示亮氨酸，Lys表示赖氨酸，Phe表示苯丙氨酸，Tyr表示酪氨酸，Val表示缬氨酸。
图2为各氨基酸在不同亚硒酸钠暴露浓度下的含量，从左至右依次为0.15mg/kg、0.3mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、70mg/kg。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、检测亚硒酸钠暴露的蚯蚓体内氨基酸含量为例：
(1)样品前处理：称取蚯蚓样品0.1g于15mL离心管中，加5mL超纯水，涡旋30s，超声10min，加2mg蛋白酶XIV，涡旋1min，在室温下黑暗振荡24h，在60℃的热水浴中超声辅助提取1h，在4℃下，离心(5300r·min-1)45min，离心后立即将上清液移出并用超纯水稀释1000倍后，通过注射器过滤器(PTFE 0.22μm)过滤，放入进样瓶中上机。
(2)建立标准曲线
配制一系列不同浓度的各种氨基酸的标准溶液，进行检测，得到各氨基酸的峰面积与浓度之间的标准曲线如图1所示。
其中，液相色谱条件如下：
使用以微粒C18为填料的ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱。
高效液相色谱仪设置参数如下：水-甲酸(1000：1)为流动相A，以乙腈-甲酸(1000：1)为流动相B，梯度洗脱：0～1min：99％A，8min：90％A，8～9min：90％A，9.01～10min：99％A；流速为0.2mL/min；柱温30℃；进样量5μL。
质谱采用MRM正离子监测模式进行检测，子离子、碎裂电压和碰撞能参数如表1所示。
表1母离子、子离子、碎裂电压和碰撞能参数
Figure BDA0002843564450000041
(3)暴露后蚯蚓体内氨基酸的浓度的测定：
检测暴露后的蚯蚓，得出各氨基酸的峰面积，依据标准曲线得到各氨基酸的含量，如图2所示，可以看出，不同暴露浓度对蚯蚓的生长代谢影响不同，高浓度的亚硒酸钠对蚯蚓的代谢影响程度更大。
本发明检测方法，前处理简单，并且不使用有机有毒试剂，可直接纯水提取蚯蚓体内游离氨基酸的液相色谱串联质谱的检测方法，大大节省了检测时间，提高检测效率，为生物毒理学研究提供一定的理论与技术支持。

Claims (8)

1.一种反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法，包括如下步骤：
采用水提取蚯蚓样品，离心后取上清夜，经稀释后进行反相高效液相色谱串联质谱检测，得到待测蚯蚓样品中亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的峰面积；
根据每种氨基酸的峰面积与浓度之间的标准曲线，即得到蚯蚓样品中各氨基酸的浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱串联质谱检测的条件如下：
液相条件为：
色谱柱为：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱；
流动相A：体积比为1000：1的水与甲酸的混合液；
流动相B：体积比为1000：1的乙腈与甲酸的混合液；
梯度洗脱的程序如下：
0～1min，流动相A的体积分数为99％；
1～8min，流动相A的体积分数由99％下降至90％；
8～9min，流动相A的体积分数保持为90％；
9.01～10min，流动相A的体积分数由90％上升至99％；
流速为0.2mL/min；
柱温为30℃；
进样量为5μL。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱串联质谱检测的条件如下：
质谱条件为：
采用正离子监测模式(MRM)进行检测。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于：所述提取的步骤如下：
向所述蚯蚓样品中加入水后依次经涡旋和超声，然后加入蛋白酶XIV，再次涡旋后于室温下黑暗振荡；然后置于55～65℃的热水浴中进行超声辅助提取。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述水的添加量为45～55ml/g蚯蚓样品。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于：加入所述蛋白酶XIV前，所述涡旋的时间为30～60s，所述超声的时间为5～15min。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的检测方法，其特征在于：加入所述蛋白酶XIV后，所述涡旋的时间为0.5～1.5min，所述振荡的时间为18～32h。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的检测方法，其特征在于：所述超声辅助提取的时间为1～2h。
CN202011500831.7A 2020-12-18 2020-12-18 反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法 Active CN112630338B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011500831.7A CN112630338B (zh) 2020-12-18 2020-12-18 反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011500831.7A CN112630338B (zh) 2020-12-18 2020-12-18 反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112630338A true CN112630338A (zh) 2021-04-09
CN112630338B CN112630338B (zh) 2023-02-24

Family

ID=75316707

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011500831.7A Active CN112630338B (zh) 2020-12-18 2020-12-18 反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112630338B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115469043A (zh) * 2022-09-26 2022-12-13 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 生姜根状茎、地上茎和叶片中游离氨基酸的液相色谱-串联质谱检测方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103845272A (zh) * 2014-03-14 2014-06-11 江苏隆力奇生物科技股份有限公司 具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物及其制备方法和应用
CN109633030A (zh) * 2019-01-22 2019-04-16 江苏澳华生物科技研究院有限公司 一种超高效液相色谱-串联四级杆质谱检测动物体液或组织样本中氨基酸的方法
CN111012726A (zh) * 2019-10-09 2020-04-17 江西沐恩堂生物科技有限公司 一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法
CN111189939A (zh) * 2020-01-14 2020-05-22 上海市农业科学院 一种利用超高效液相色谱-串联质谱检测植物内源游离氨基酸的方法
CN111307975A (zh) * 2020-03-12 2020-06-19 重庆医科大学 小鼠皮层中的8种氨基酸的检测方法
CN111638293A (zh) * 2019-08-30 2020-09-08 华南农业大学 一种同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的lc-ms/ms的检测方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103845272A (zh) * 2014-03-14 2014-06-11 江苏隆力奇生物科技股份有限公司 具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物及其制备方法和应用
CN109633030A (zh) * 2019-01-22 2019-04-16 江苏澳华生物科技研究院有限公司 一种超高效液相色谱-串联四级杆质谱检测动物体液或组织样本中氨基酸的方法
CN111638293A (zh) * 2019-08-30 2020-09-08 华南农业大学 一种同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的lc-ms/ms的检测方法
CN111012726A (zh) * 2019-10-09 2020-04-17 江西沐恩堂生物科技有限公司 一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法
CN111189939A (zh) * 2020-01-14 2020-05-22 上海市农业科学院 一种利用超高效液相色谱-串联质谱检测植物内源游离氨基酸的方法
CN111307975A (zh) * 2020-03-12 2020-06-19 重庆医科大学 小鼠皮层中的8种氨基酸的检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOSÉ FERNANDO OVALLES 等: "Quantitative determination of amino acids in earthworm meal (Eisenia andrei) by a Surveyor HPLC system in conjunction with pre-column 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate derivatization.", 《ARS PHARMACEUTICA》 *
邵秀清 等: "高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内硒代氨基酸", 《环境科学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115469043A (zh) * 2022-09-26 2022-12-13 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 生姜根状茎、地上茎和叶片中游离氨基酸的液相色谱-串联质谱检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112630338B (zh) 2023-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110849988B (zh) 一种检测蜂蜜中33种生物碱的方法
CN107843672B (zh) 高效液相色谱-串联质谱检测血清中氨基酸的方法
CN105403637A (zh) 一种高通量检测人体血浆中多种氨基酸的质谱方法
CN111855883B (zh) 一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法
CN113049719A (zh) 一种检测游离睾酮的方法及试剂盒
WO2023179804A1 (zh) 一种利用超滤法换算平衡透析下游离物质含量的测定方法
CN114720704B (zh) 一种测定血清中游离睾酮的试剂盒及方法
Li et al. Rapid determination of tricaine mesylate residues in fish samples using modified QuEChERS and high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
CN110988193B (zh) 一种检测水产品中晚期糖基化终末产物的方法
CN114509509A (zh) 一种血清中全谱维生素的检测方法
CN112630338B (zh) 反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法
CN111912920A (zh) 一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中霉酚酸及其代谢物的方法
CN111257438B (zh) 西洋参多肽的富集和表征方法
Yu et al. Selenium speciation in biological samples using a hyphenated technique of high-performance liquid chromatography and inductively coupled plasma mass spectrometry
CN112834680B (zh) 一种测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度的方法
CN111474279B (zh) 检测大环内酯抗生素化合物的方法和试剂盒
CN112903836B (zh) 体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法
CN113325105A (zh) 一种富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法
CN112526048A (zh) 一种快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法
CN110609097A (zh) 一种磷脂酰丝氨酸类化合物的筛查方法
CN111829851A (zh) 一种c57小鼠脑组织和血浆中18种氨基酸测定的前处理方法
CN115541778B (zh) 一种测定人血浆中阿普斯特浓度的检测方法
CN115112810B (zh) 一种用于25羟基维生素d检测的样品前处理方法和应用
CN114720570B (zh) 一种检测鱼肉中8种雌激素的方法
CN111812243B (zh) 一种消减全血环孢素测定的基质效应的分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant