CN111257438B - 西洋参多肽的富集和表征方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了西洋参多肽的富集和表征方法。首先制备西洋参提取液；向西洋参提取液中加入乙酸乙酯，得到含有乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；向不含乙酸乙酯的萃取液中加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的含水层萃取液；将含水层萃取液超滤后离心，收集上清液，进行HPLC梯度洗脱，洗脱液即含富集的西洋参多肽。随后用质谱技术和蛋白质组学分析数据库对所富集的多肽进行表征。

Description

西洋参多肽的富集和表征方法
技术领域
本发明属于分离分析、植物组学及生物技术领域，涉及一种从植物复杂成分中有效筛选多肽并富集多肽并基于先进质谱技术进行跟踪、检测，并通过现代质谱技术表征目标多肽的方法。
背景技术
肽是由20种编码氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，被报道的多种植物寡肽、环肽、环肽生物碱、糖肽等，都从不同角度表现出可喜的生理和药理活性，植物中的肽参与多种生理过程,包括生长发育的调节、免疫、遗传变异的估计，突变体的表征，以及植物生长的不同因素的确定。肽是研究基因动态表达的有效方法,在新的治疗方案中可能具有潜力，开发前景广阔。
我国天然产物的化学研究集中在小分子组分，对水溶性较强的多肽研究留存大量的研究空白。西洋参具有抗肿瘤，抗氧化和神经保护作用等。人参皂苷被认为是该物种的主要活性成分。我们的研究团队已经在人参中鉴定出总共308种肽。然而，因为其整个基因组尚未测序，对西洋参中的肽知之甚少。为此有必要从全面的物质基础出发，系统认识西洋参中的多肽及组成特征。
发明内容
鉴于现有技术中存在的不足，本发明建立了基于液质联用技术来筛选多肽，并跟踪和检测目标多肽达到富集纯化。利用质谱的不同碎裂模式，通过对富集后的目标多肽进行质量和碎片离子的匹配，实现对西洋参的高丰度多肽进行深度表征。本发明可以对内源性西洋参肽序列进行深度认识，进而为后续生物活性研究提供筛选。
本发明的一方面提供了一种西洋参多肽的富集方法，所述方法至少包括以下步骤：
a)制备西洋参提取液；
b)向所述西洋参提取液中加入乙酸乙酯，得到含有乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；
c)向所述不含乙酸乙酯的萃取液中加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的含水层萃取液；
d)将所述不含正丁醇的含水层萃取液超滤后离心，收集上清液；
e)将步骤d)中的上清液进行HPLC梯度洗脱，洗脱液即含富集的西洋参多肽。
在优选的实施方式中，所述步骤a)包括：
1)将西洋参样品中加入体积比为0％-70％乙醇水溶液为提取溶剂，西洋参粉末与溶剂的质量体积比为0.1g/ml-0.3g/ml；
2)将步骤1)中的混合物超声分离，收集溶剂；
3)重复步骤1)中提取溶剂的提取步骤和步骤2)中的超声分离，重复提取n次，n为大于等于1的整数，合并各次提取液；
4)将步骤3)所得溶液在氮气氛下干燥，然后将所得干燥物用水重新溶解，并将所得溶液加入到高浓度乙醇中进行醇沉，所得沉淀物用水再次溶解。
在优选的实施方式中，所述醇沉步骤中的乙醇为纯度大于70％的乙醇。
在优选的实施方式中，所述步骤d)使用截止分子量为1-3kDa的离心过滤装置进行超滤。
在优选的实施方式中，步骤e)使用C18色谱柱，进行如下梯度洗脱分析、分离：
分离柱为5um Cosmosil-C18 4.6ID×250mm，二元洗脱体系含有0.2～0.5％甲酸水溶液作为流动相A和乙腈B相，在梯度条件下实现分离。在梯度为>30％乙腈，<35％乙腈内，富集到目标多肽。
本发明的另一方面提供了一种西洋参多肽的鉴定和表征方法，所述方法将上述得到的富集的西洋参多肽进行如下处理：
f)采用质谱仪对所述西洋参多肽进行检测分析；
g)通过蛋白组学质谱数据分析软件，利用多肽二级谱图上的碎片离子质量差，进行denovo从头测序。
在优选的实施方式中，所述质谱仪采用电喷雾离子源正离子模式进行检测。
在优选的实施方式中，通过Progenesis QI软件对所述质谱仪所采集到的数据进行预处理，选择电荷数大于1的离子作为多肽候选物进行二级碎裂，每张质谱图选择强度最强的3-8个离子进行非靶向碰撞诱导解离和碰撞解离碎裂，归一化碰撞能量设定为20％-50％。
在优选的实施方式中，所述denovo测序从波谱的高质量端开始，找到可以互为印证的a,b离子，为了确保正确进一步找到-NH3和H2O的丢失，接着用尽可能一个氨基酸跨度找到下一个b离子，一直到波谱低端的b1离子，实现从C端到N端的测序；另一个方向上的测序则是通过从高质量端开始跟踪y离子实现的。
在优选的实施方式中，所述蛋白组学质谱数据分析软件，进行过滤、解卷积、二级质谱图简化及从头测序以确定西洋参多肽的一级结构。
数据检索来自于从SwissProt数据库网站下载的特定人参蛋白质数据库。
本申请能产生的有益效果包括：
1.本发明使用液质联用为分析检测手段，适合于复杂中药的分离分析，具有高通量和高灵敏度，分离度好和分析速度快，有助于目标化合物与竞争性电离杂质的分离。
2.本发明通过Progenesis QI软件处理质谱数据，ESI源的电离过程会使大部分多肽带有多电荷(z>1)，据此特征，可以多电荷物质的比例作为评估标准来分析各药材的多肽物质相对含量。此方法可以快速筛选出电荷数大于1且小于10的离子作为多肽的候选物。
3.本发明对西洋参中目标多肽类化合物进行分离、富集是一种传统分离技术与生化技术有效结合的方法，其快速、简单、有效、节约成本等优点为植物多肽的研究提供一条可行的途径。
4.本发明对西洋参的目标多肽的表征有助于了解这种草药的药理活性，为药理研究和掺假预防提供科学依据，适用于未来西洋参在加工过程中的质量控制。
5.本发明所建立的西洋参目标多肽的发现、富集和表征的通用技术体系，可辐射应用到植物和微生物代谢组学分析、食品安全代谢组学分析等领域。
附图说明
图1代表通过富集步骤，获得了用于后续LTQ-Orbitrap-MS表征分析的多肽富集物的总离子流图；
图2(a)和图2(b)分别显示了在正离子模式下获得的西洋参样品的基峰色谱(BPC)和西洋参的代表性MS峰。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
本发明提供的西洋参多肽的发现、富集和表征的方法，包括下述步骤：
(1)西洋参多肽的富集；(2)通过液质联用对西洋参目标多肽进行一级碎裂并通过对数据进行预处理，选择多肽候选物进行二级碎裂；(3)通过蛋白组学质谱数据分析软件，进行denovo从头测序和搜索数据库，对富集后的多肽进行表征。
上述方法中，步骤(1)粉碎干燥西洋参切片100g,加入体积比为10％-70％乙醇水溶液为提取溶剂，药材粉末与溶剂的质量体积比为0.30g/ml-1.0g/ml,混合均匀；超声10-40分钟，分离，收集溶剂，重复提取n次,n为大于等于1的整数，合并提取液，得到提取液；将所得溶液在温和的氮气流下干燥，然后分别在80-200mL水中重新溶解；将提取物加入到200-600ml高浓度乙醇中醇沉，沉淀物用30-60ml水溶解；按照体积比1:1向混悬液中加入乙酸乙酯，重复2-3次，得到含乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；取不含乙酸乙酯的萃取液，按照体积比1:1加入正丁醇，重复2-3次，得到含有正丁醇的萃取液和含水层的萃取液；使用Amicon Ultra-4离心过滤装置，截止分子量为1-3kDa的离心过滤装置对水层萃取液进行超滤，4-10℃下超速离心40-60分钟，收集上清；将得到的洗脱液，通过HPLC梯度洗脱分析及富集，使用常规C18色谱柱，进行梯度洗脱分析、分离：分离柱为5um Cosmosil-C184.6ID×250mm，制备分离系统由泵和从190到400nm扫描的光电二极管阵列检测器(DAD)组成。二元洗脱体系含有0.2～0.5％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)，在梯度条件下实现分离：在梯度为>30％乙腈，<35％乙腈内，富集到目标多肽。
上述的方法中，步骤(2)通过液质联用对西洋参目标多肽进行分析，二元洗脱系统，流动相A为浓度为0.5％的甲酸水，B为乙腈。梯度如下：0min:5％B,流速0.3mL/min；7min:100％B,流速0.3mL/min；9min:100％B,流速0.3mL/min；11min:5％B,流速0.3mL/min；在色谱柱温为40℃-60℃下进行色谱分离；进样体积为1-5μl。质谱分析过程通过LTQ-Orbitrap Elite(Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)对西洋参目标多肽的富集样品进行一级和二级碎裂。电喷雾离子源正离子模式进行检测。
上述的方法中，步骤(2)通过Progenesis QI软件提取质谱仪所采集到的一级数据，对数据进行预处理(包括对特征的m/z和保留时间(Retention time)进行对齐和相同的特征进行合并等),生成峰强度列表。Progenesis QI参数如下：Filiter:0.2-1；Absoluteion intensity:100-5000。选择电荷数大于1的离子作为多肽候选物进行二级碎裂，每张质谱图选择强度最强的3-8个离子进行非靶向碰撞诱导解离和碰撞解离碎裂，归一化碰撞能量设定为20％-50％；
质谱二级数据采集包括全傅里叶变换质谱(FTMS)扫描事件，m/z范围为500-1700，分辨率(半高全宽)＝6,000。
上述的方法中，步骤(3)搜库软件对二级数据进行鉴定，表征多肽：通过蛋白组学质谱数据分析软件Peaks Studio 7(BSI,Canada)，进行过滤、解卷积、二级质谱图简化及从头测序以确定这些肽的一级结构。数据细化允许校准母离子的m/z值和电荷状态，从而提供更准确的单同位素m/z值。严格控制误差容限(前体：10.0ppm；在MS/MS谱中观察到的主要碎片也应满足误差小于0.5Da的结果)进行峰质心，电荷解卷积和去极化。数据过滤阈值为>0.3，没有指定用于切割的酶。选择可变翻译后修饰(PTM)，包括甲基化(Δmass，+14.02)，脱氧(Δmass，-15.99)，脱水(Δmass，-18.01)，己糖(Δmass，+162.052)，加入2个己糖(Δmass，+324.11)，氧化(Δmass，+15.99)；固定的PTM是二硫键形成(Δmass，-1.0078)。数据检索来自于从SwissProt数据库www.uniprot.org网站下载的特定人参蛋白质数据库。利用多肽二级谱图上的碎片离子质量差，denovo从头测序。denovo测序从波谱的高质量端开始，找到可以互为印证的a,b离子，为了确保正确还要找到-NH3和H2O的丢失，接着用尽可能小的氨基酸跨度找到下一个b离子，一直到波谱低端的b1离子，实现从C端到N端的测序；另一个方向上的测序则是通过从高质量端开始跟踪y离子实现的。
实施例1
1.富集分离目标多肽
粉碎干燥西洋参切片100g,加入体积比为50％乙醇水溶液为提取溶剂，药材粉末与溶剂的质量体积比为0.125g/ml,混合均匀；超声30分钟，分离，收集溶剂，重复提取2次,合并提取液；将所得溶液在温和的氮气流下干燥，然后分别在100mL水中重新溶解；将提取物加入到300ml乙醇中醇沉，沉淀物用40ml水溶解；按照体积比1:1向混悬液中加入40ml乙酸乙酯，重复3次，得到含乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；取不含乙酸乙酯的萃取液，按照体积比1:1加入40ml正丁醇，重复3次，得到含有正丁醇的萃取液和含水层的萃取液；使用Amicon Ultra-4离心过滤装置对水层萃取液，截止分子量为3kDa的离心过滤装置进行超滤，4℃下超速离心40分钟，收集上清；将得到的洗脱液，通过HPLC梯度洗脱分析及富集，使用常规C18色谱柱(5um Cosmosil-C18 4.6ID×250mm)，进行如下梯度洗脱分析、分离；制备分离系统由泵和从190到400nm扫描的光电二极管阵列检测器(DAD)组成。二元洗脱体系含有0.5％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)，在以下梯度条件下实现分离：0分钟：10％B，流速＝1mL/min；5分钟：20％B，1mL/min；10分钟：30％B，1mL/min；15分钟：40％B，1mL/min；17分钟：100％B，1mL/min。目标多肽富集浓缩在F3级分(10-12.5min)中，收集目标多肽的洗脱液，在氮气保护下浓缩至干，得到西洋参目标多肽富集成品如图1所示(获得了用于后续LTQ-Orbitrap-MS表征分析的多肽富集物的总离子流图)。非标记目标多肽峰富集纯度为85.10％。
2.通过LTQ-Orbitrap(Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)液质联用对西洋参多肽富集物进行一级碎裂并通过对数据进行预处理，选择多肽候选物进行二级碎裂。
①液相色谱为二元洗脱系统，流动相A为浓度为0.5％的甲酸水，B为乙腈。梯度如下：0min:5％B,流速0.3mL/min；7min:100％B,流速0.3mL/min；9min:100％B,流速0.3mL/min；11min:5％B,流速0.3mL/min；在色谱柱温为60℃下进行色谱分离；进样体积为5μl。(图2(a)西洋参基峰色谱图中的峰1和峰2为所目标多肽所在部位)
②质谱进行一级碎裂，电喷雾离子源正离子模式进行检测。图2(b)显示了一级质谱中西洋参的代表性MS(图2(a)西洋参基峰色谱图中的峰1和峰2给出了所选择的6-带电离子的的实例)峰。由于13C同位素的自然丰度，每个的同位素峰对于6电荷离子，观察到离子为0.1667原子质量单位(amu)间隔。通过Progenesis QI软件提取质谱仪所采集到的一级数据，对数据进行预处理(包括对特征的m/z和Retention time进行对齐和相同的特征进行合并等)，生成峰强度列表。Progenesis QI参数如下：Filiter:0.3；Absolute ionintensity:2000。
③选择Progenesis QI处理质谱一级数据得到的电荷数大于1的离子作为多肽候选物进行二级碎裂，每张质谱图选择强度最强的5个离子进行非靶向碰撞诱导解离和碰撞解离碎裂，归一化碰撞能量设定为22％和30％；质谱二级数据采集包括全傅里叶变换质谱(FTMS)扫描事件，m/z范围为500-1700，分辨率(半高全宽)＝6,000。
3.通过蛋白组学质谱数据分析软件，进行denovo从头测序和搜索数据库，对富集后的多肽进行表征
通过蛋白组学质谱数据分析软件Peaks Studio 7(BSI,Canada)，进行过滤、解卷积、二级质谱图简化及从头测序以确定这些肽的一级结构。数据细化允许校准母离子的m/z值和电荷状态，从而提供更准确的单同位素m/z值。严格控制误差容限(前体：10.0ppm；在MS/MS谱中观察到的主要碎片也应满足误差小于0.5Da的结果)进行峰质心，电荷解卷积和去极化。数据过滤阈值为>0.3，没有指定用于切割的酶。选择可变翻译后修饰(PTM)，包括甲基化(Δmass，+14.02)，脱氧(Δmass，-15.99)，脱水(Δmass，-18.01)，己糖(Δmass，+162.052)，加入2个己糖(Δmass，+324.11)，氧化(Δmass，+15.99)；固定的PTM是二硫键形成(Δmass，-1.0078)。数据检索来自于从SwissProt数据库www.uniprot.org网站下载的特定人参蛋白质数据库。利用多肽二级谱图上的碎片离子质量差，denovo测序从波谱的高质量端开始，找到可以互为印证的a,b离子，为了确保正确还要找到-NH3和H2O的丢失，接着用尽可能小的氨基酸跨度找到下一个b离子，一直到波谱低端的b1离子，实现从C端到N端的测序；另一个方向上的测序则是通过从高质量端开始跟踪y离子实现的。对搜索和测序得到的肽序列，结合其可信度(-10logP)、肽链断裂情况、子离子的分配情况及误差的范围逐个进行人工确认，搜索鉴定的假阳性率FDR<1％。得到的结果如表1。
表1总结了所鉴定的肽的分子量，序列，PTM，前体质量误差以及-10logP。
Figure BDA0001888271250000081
Figure BDA0001888271250000091
Figure BDA0001888271250000101
Figure BDA0001888271250000111
实施例2
1.富集分离目标多肽
粉碎干燥西洋参切片100g,加入体积比为30％乙醇水溶液为提取溶剂，药材粉末与溶剂的质量体积比为0.2g/ml,混合均匀；超声30分钟，分离，收集溶剂，重复提取2次,合并提取液；将所得溶液在温和的氮气流下干燥，然后分别在200mL水中重新溶解；将提取物加入到400ml乙醇中醇沉，沉淀物用50ml水溶解；按照体积比1:1向混悬液中加入50ml乙酸乙酯，重复3次，得到含乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；取不含乙酸乙酯的萃取液，按照体积比1:1加入50ml正丁醇，重复3次，得到含有正丁醇的萃取液和含水层的萃取液；使用Amicon Ultra-4离心过滤装置对水层萃取液，截止分子量为3kDa的离心过滤装置进行超滤，10℃下超速离心40分钟，收集上清；将得到的洗脱液，通过HPLC梯度洗脱分析及富集，使用常规C18色谱柱(5um Cosmosil-C18 4.6ID×250mm)，进行如下梯度洗脱分析、分离；制备分离系统由泵和从190到400nm扫描的光电二极管阵列检测器(DAD)组成。二元洗脱体系含有0.5％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)，在以下梯度条件下实现分离：0分钟：10％B，流速＝1mL/min；5分钟：20％B，1mL/min；10分钟：30％B，1mL/min；15分钟：40％B，1mL/min；17分钟：100％B，1mL/min。目标多肽富集浓缩在F3级分(10-12.5min)中，收集目标多肽的洗脱液，在氮气保护下浓缩至干，得到西洋参目标多肽富集成品与图1相似。
2.通过LTQ-Orbitrap(Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)液质联用对西洋参多肽富集物进行一级碎裂并通过对数据进行预处理，选择多肽候选物进行二级碎裂。
①液相色谱为二元洗脱系统，流动相A为浓度为0.2％的甲酸水，B为乙腈。梯度如下：0min:5％B,流速0.3mL/min；7min:100％B,流速0.3mL/min；9min:100％B,流速0.3mL/min；11min:5％B,流速0.3mL/min；在色谱柱温为60℃下进行色谱分离；进样体积为2μl。西洋参基峰色谱图中与图2(a)相似。
②质谱进行一级碎裂，电喷雾离子源正离子模式进行检测。一级质谱中西洋参的代表性MS图与图2(b)相似。由于13C同位素的自然丰度，每个的同位素峰对于6电荷离子，观察到离子为0.1667原子质量单位(amu)间隔。通过Progenesis QI软件提取质谱仪所采集到的一级数据，对数据进行预处理(包括对特征的m/z和Retention time进行对齐和相同的特征进行合并等)，生成峰强度列表。Progenesis QI参数如下：Filiter:0.5；Absolute ionintensity:1000。
③选择Progenesis QI处理质谱一级数据得到的电荷数大于1的离子作为多肽候选物进行二级碎裂，每张质谱图选择强度最强的6个离子进行非靶向碰撞诱导解离和碰撞解离碎裂，归一化碰撞能量设定为28％和30％；质谱二级数据采集包括全傅里叶变换质谱(FTMS)扫描事件，m/z范围为500-1700，分辨率(半高全宽)＝6,000。
3.通过蛋白组学质谱数据分析软件，进行denovo从头测序和搜索数据库，对富集后的多肽进行表征
通过蛋白组学质谱数据分析软件Peaks Studio 7(BSI,Canada)，进行过滤、解卷积、二级质谱图简化及从头测序以确定这些肽的一级结构。数据细化允许校准母离子的m/z值和电荷状态，从而提供更准确的单同位素m/z值。严格控制误差容限(前体：10.0ppm；在MS/MS谱中观察到的主要碎片也应满足误差小于0.5Da的结果)进行峰质心，电荷解卷积和去极化。数据过滤阈值为>0.3，没有指定用于切割的酶。选择可变翻译后修饰(PTM)，包括甲基化(Δmass，+14.02)，脱氧(Δmass，-15.99)，脱水(Δmass，-18.01)，己糖(Δmass，+162.052)，加入2个己糖(Δmass，+324.11)，氧化(Δmass，+15.99)；固定的PTM是二硫键形成(Δmass，-1.0078)。数据检索来自于从SwissProt数据库www.uniprot.org网站下载的特定人参蛋白质数据库。利用多肽二级谱图上的碎片离子质量差，denovo测序从波谱的高质量端开始，找到可以互为印证的a,b离子，为了确保正确还要找到-NH3和H2O的丢失，接着用尽可能小的氨基酸跨度找到下一个b离子，一直到波谱低端的b1离子，实现从C端到N端的测序；另一个方向上的测序则是通过从高质量端开始跟踪y离子实现的。对搜索和测序得到的肽序列，结合其可信度(-10logP)、肽链断裂情况、子离子的分配情况及误差的范围逐个进行人工确认，搜索鉴定的假阳性率FDR<1％。得到的结果与表1相似。
实施例2的结果与实例1中表1、图1、图2(a)和图2(b)，所示一致。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
序列表
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> 西洋参多肽的富集和表征方法
<130> DD180550I
<141> 2018-11-30
<160> 100
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<213> Panax quinquefolius
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<211> 37
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 58
Asp Ile Asn Val Cys Val Asn Gln Gln Ala Thr Arg Phe Val Asp Cys
1 5 10 15
Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg Leu Lys Phe Val Arg Leu
20 25 30
Pro Ser Lys Met Lys
35
<210> 59
<211> 37
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 59
Asp Ile Asn Val Cys Val Asn Gln Gln Ala Thr Arg Phe Val Asp Cys
1 5 10 15
Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg Leu Lys Phe Val Arg Leu
20 25 30
Pro Ser Lys Met Lys
35
<210> 60
<211> 37
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 60
Asp Ile Asn Val Cys Val Asn Gln Gln Ala Thr Arg Phe Val Asp Cys
1 5 10 15
Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg Leu Lys Phe Val Arg Leu
20 25 30
Pro Ser Lys Met Lys
35
<210> 61
<211> 37
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 61
Ser Glu Tyr Val Leu Thr Asp Ile Asn Val Cys Val Asn Gln Gln Ala
1 5 10 15
Thr Arg Phe Val Asp Cys Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg
20 25 30
Leu Lys Phe Val Arg
35
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<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 62
Ser Glu Tyr Val Leu Thr Asp Ile Asn Val Cys Val Asn Gln Gln Ala
1 5 10 15
Thr Arg Phe Val Asp Cys Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg
20 25 30
Leu Lys Phe Val Arg
35
<210> 63
<211> 36
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 63
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1 5 10 15
Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg Leu Lys Phe Val Arg Leu Pro
20 25 30
Ser Lys Met Lys
35
<210> 64
<211> 36
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 64
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1 5 10 15
Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg Leu Lys Phe Val Arg Leu Pro
20 25 30
Ser Lys Met Lys
35
<210> 65
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<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 65
Ser Glu Tyr Val Leu Thr Asp Ile Asn Val Cys Val Asn Gln Gln Ala
1 5 10 15
Thr Arg Phe Val Asp Cys Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg
20 25 30
Leu Lys Phe
35
<210> 66
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<213> Panax quinquefolius
<400> 66
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1 5 10 15
Thr Arg Phe Val Asp Cys Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg
20 25 30
Leu Lys Phe
35
<210> 67
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<213> Panax quinquefolius
<400> 67
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1 5 10 15
Thr Arg Phe Val Asp Cys Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg
20 25 30
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35
<210> 68
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<213> Panax quinquefolius
<400> 68
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1 5 10 15
Thr Arg Phe Val Asp Cys Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg
20 25 30
Leu Lys Phe
35
<210> 69
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<213> Panax quinquefolius
<400> 69
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1 5 10 15
Thr Arg Phe Val Asp Cys Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg
20 25 30
Leu Lys Phe
35
<210> 70
<211> 34
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<213> Panax quinquefolius
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1 5 10 15
Thr Arg Phe Val Asp Cys Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg
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<210> 71
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<213> Panax quinquefolius
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Thr Arg Phe Val Asp Cys Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg
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<210> 72
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<213> Panax quinquefolius
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1 5 10 15
Thr Arg Phe Val Asp Cys Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg
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<210> 73
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<213> Panax quinquefolius
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<210> 74
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<213> Panax quinquefolius
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Asp Ile Asn Val Cys Val Asn Gln Gln Ala Thr Arg Phe Val Asp Cys
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Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg Leu Lys
20 25
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<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 75
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Thr Arg Phe Val Asp Cys Pro Thr Asp Asp
20 25
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<213> Panax quinquefolius
<400> 76
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Thr Arg Phe Val Asp Cys Pro Thr Asp
20 25
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<213> Panax quinquefolius
<400> 77
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1 5 10 15
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20 25
<210> 78
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<213> Panax quinquefolius
<400> 78
Thr Asp Ile Asn Val Cys Val Asn Gln Gln Ala Thr Arg Phe Val Asp
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Cys Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp
20
<210> 79
<211> 24
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<213> Panax quinquefolius
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1 5 10 15
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20
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<213> PANAX QUINQUEFOLIUS
<400> 80
Thr Asp Ile Asn Leu Cys Val Asn Gln Gln Ala Thr Arg Phe Val Asp
1 5 10 15
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20
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<213> Panax quinquefolius
<400> 81
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<213> Panax quinquefolius
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20
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<213> Panax quinquefolius
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Thr Asp Ile Asn Val Cys Val Asn Gln Gln Ala Thr Arg Phe Val Asp
1 5 10 15
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20
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<213> Panax quinquefolius
<400> 84
Asp Ile Asn Val Cys Val Asn Gln Gln Ala Thr Arg Phe Val Asp Cys
1 5 10 15
Pro Thr Asp Asp Ala Thr Asp
20
<210> 85
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<213> Panax quinquefolius
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Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg Leu Lys Phe Val Arg Leu Pro Ser Lys
1 5 10 15
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<210> 86
<211> 18
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<213> Panax quinquefolius
<400> 86
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1 5 10 15
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<210> 87
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<213> Panax quinquefolius
<400> 87
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1 5 10 15
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20
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<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 88
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 89
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1 5 10 15
Lys
<210> 90
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<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 90
Ala Thr Asp Asp Tyr Arg Leu Lys Phe Val Arg Leu Pro Ser Lys Met
1 5 10 15
Lys
<210> 91
<211> 16
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 91
Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg Leu Lys Phe Val Arg Leu Pro Ser Lys
1 5 10 15
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 92
Asp Tyr Arg Leu Lys Phe Val Arg Leu Pro Ser Lys Met Lys
1 5 10
<210> 93
<211> 14
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 93
Asp Tyr Arg Leu Lys Phe Val Arg Leu Pro Ser Lys Met Lys
1 5 10
<210> 94
<211> 13
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 94
Tyr Arg Leu Lys Phe Val Arg Leu Pro Ser Lys Met Lys
1 5 10
<210> 95
<211> 12
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 95
Lys Met Ile Lys Glu Ala Ile Lys Lys His Leu Asn
1 5 10
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 96
Asp Tyr Arg Leu Lys Phe Val Arg Leu Pro Ser
1 5 10
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 97
Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg Leu Lys Phe
1 5 10
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<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 98
Phe Val Arg Leu Pro Ser Lys Met Lys
1 5
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<211> 9
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<213> Panax quinquefolius
<400> 99
Phe Val Arg Leu Pro Ser Lys Met Lys
1 5
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> Panax quinquefolius
<400> 100
Val Arg Leu Pro Ser Lys Met Lys
1 5

Claims (1)

1.一种西洋参多肽的富集方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：
a）制备西洋参提取液；
b）向所述西洋参提取液中加入乙酸乙酯，得到含有乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；
c）向所述不含乙酸乙酯的萃取液中加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的含水层萃取液；
d）将所述含水层萃取液超滤后离心，收集上清液；所述超滤使用的离心过滤装置截止分子量为1-3kDa；
e）将步骤d）中的上清液进行HPLC梯度洗脱，洗脱液即含富集的西洋参多肽；
步骤e）使用C18色谱柱，进行如下梯度洗脱分析、分离：
二元洗脱体系含有0.2~0.5％甲酸水溶液作为流动相A和乙腈B相，在梯度条件下实现分离，在梯度为>30%乙腈，<35%乙腈内，富集到目标多肽；
所述目标多肽选自由以下氨基酸序列所代表的来自P83618蛋白的多肽中的至少一种：
（1） SEYVLTDINVC’VNQQATR’FVDC’PTDDATDDYRLKFVRLPS’KM’K； （2） SEYVLTDINVC’VNQQAT’R’FVDC’PTDDATDDYRLKFVRLPSKM’K； （3） SEYVLTDINVC’VNQQATR’FVDC’PTDDAT’DDYRLKFVRLPSKM’K； （4） SEYVLTDINVC’VNQQATR’FVDC’PT’DDATDDYRLKFVRLPSKM’K； （5） SEYVLTDINVC’VNQQATRFVDC’PTDDATDDYRLKFVRLPS’KM’K； （6） SEYVLTDINVC’VNQQAT’RFVDC’PTDDATDDYRLKFVRLPSKM’K； （7） SEYVLTDINVC’VNQQATRFVDC’PTDDAT’DDYRLKFVRLPSKM’K； （8） SEYVLTDINVC’VNQQATRFVDC’PT’DDATDDYRLKFVRLPSKM’K； （9） SEYVLT’DINVC’VNQQATRFVDC’PTDDATDDYRLKFVRLPSKM’K； （10） SEYVLTDINVC’VNQQATRFVDC’PTDDAT’DDYRLKFVRLPSKMK； （11） SEYVLTDIN’VC’VNQQATRFVDC’PTDDATDDYRLKFVRLPSKMK； （12） SEYVLTDINVC’VN’QQATRFVDC’PTDDATDDYRLKFVRLPSKMK； （13） SEYVLTDINVC’VNQQAT’RFVDC’PTDDATDDYRLKFVRLPSKMK； （14） SEYVLTDINVC’VNQQATR’FVDC’PTDDATDDYRLKFVRLPSKM’K； （15） SEYVLTDINVC’VNQQATRFVDC’PTDDATDDYRLKFVRLPSKM’K； （16） SEYVLTDINVC’VNQQATRFVDC’PTDDATDDYRLKFVRLPSKMK；
其中，C’表示经过二硫键修饰的半胱氨酸；
R’表示经过甲基化修饰的精氨酸；
S’表示经过己糖化修饰的丝氨酸；
M’表示经过脱氧修饰的甲硫氨酸；
T’表示经过己糖化修饰的苏氨酸；
N’表示经过己糖化修饰的天冬酰胺；
其中所述步骤a）包括：
1）将西洋参样品中加入体积比为10%-70%乙醇水溶液为提取溶剂，西洋参粉末与溶剂的质量体积比为0.1g/ml-0.3g/ml；
2）将步骤1）中的混合物超声分离，收集溶剂；
3）重复步骤1）中提取溶剂的提取步骤和步骤2）中的超声分离，重复提取n次，n为大于等于1的整数，合并各次提取液；
4）将步骤3）所得溶液在氮气氛下干燥，然后将所得干燥物用水重新溶解，并将所得溶液加入到高浓度乙醇中进行醇沉，所得沉淀物用水再次溶解；
所述高浓度乙醇为纯度大于70%的乙醇。
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