CN113577239B - 一种西洋参糖肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种西洋参糖肽及其制备方法与应用。本发明首次在西洋参中发现一种新的西洋参糖肽，该西洋参糖肽中含有中性多糖(以葡萄糖计)52.8％，糖醛酸(以半乳糖醛酸计)41.3％，肽(以牛血清白蛋白计)2.3％，均为质量百分比，是从西洋参根中分离获得。本发明的西洋参糖肽是一类结构新颖的糖肽物质，是一种纯的化学成分，是天然存在的糖肽大分子，与经酶解加工处理得到的多糖和多肽混合物有本质的不同，且发明人发现该西洋参糖肽是西洋参中一类重要的药效物质，具有独特的生物活性，对于高血糖具有显著的调节作用，具有安全性高、适于长期服用的特点，具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种西洋参糖肽及其制备方法与应用，属于中药或天然中药的提取制备技术领域。
背景技术
西洋参(Panax quinquefolius)又名花旗参、美国参，五加科植物，原产美洲，主要分布在加拿大、美国等地，现在我国也有引进栽培。中医认为，西洋参性寒，可补气养阴、清火生津，常用于治疗气阴两虚、阴虚津伤。现代医学研究表明，西洋参具有提高免疫力、抗肿瘤、抗辐射、降血糖等多种功效，含有皂苷、挥发油、糖类和多肽等多种有效活性成分。尤其是对于血糖方面，西洋参在临床上已经广为应用。但是其药效物质基础尚不明确。
糖肽(Glycopeptides)是由糖链和肽段共价结合形成的一类非皂苷类大分子化合物，同时具备糖类和肽类的双重特性。现代药理学研究表明糖肽具有多种生物活性，如降血糖、降血脂、保护神经细胞、抗炎镇痛、改善认知障碍、增强记忆力、镇静、降胆固醇等。糖肽类物质的生物活性一方面受本身糖蛋白性质的影响，另一方面与其自身的复杂结构有关，其结构的复杂性主要是由糖肽的单糖组成及连接方式、氨基酸组成及连接方式、糖-肽结合位点的多样性决定的，而这些因素都与其分子质量息息相关，分子质量不同，结构组成就不同，其相应的生物学活性也不相同。但是现有技术中对于西洋参中糖肽类成分的研究依然较少。中国专利文献CN102805282A(申请号201110157090.1)公开了一种西洋参多糖肽的生产方法，但因为其工艺中加入了酶解处理，使得原本西洋参中天然存在状态的多糖、蛋白、以及可能含有的糖肽，结构发生断裂，进而形成了新的多糖和多肽混合物，并非学术界严格意义上的糖肽(Glycopeptides)。
糖尿病是一种高患病率的慢性终身性疾病。据WHO统计，2000年全球糖尿病患者已超过1.7亿，预计2030年将超过3.6亿。我国现有糖尿病患者约4 000余万人，约占全球糖尿病患者总数的20％。糖尿病中医又称其为消渴症，发病过程中多为多种症候相互夹杂，发病早期多以气阴两虚为主，日久迁延，机体精气日益虚衰，会累及多脏器导致多种并发病症的出现。发病中期以阴虚内热型为主，“热毒”在糖尿病进展过程中的重要地位受到医家的重视，清热解毒药的应用可缓解糖尿病及其并发症。西洋参在传统中药临床的使用中，对消渴症具有明确疗效，但是对西洋参中发挥药理学作用的物质尚不清楚。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种西洋参糖肽及其制备方法与应用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种西洋参糖肽，所述西洋参糖肽中含有中性多糖(以葡萄糖计)52.8％，糖醛酸(以半乳糖醛酸计)41.3％，肽(以牛血清白蛋白计)2.3％，均为质量百分比；
所述西洋参糖肽的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，其摩尔比为5.2:3.0:2.8:4.5:5.7；
所述西洋参糖肽的肽由14种氨基酸组成，以总肽质量计，各氨基酸的质量分数如下：天冬氨酸(Asp)8.18％、丝氨酸(Ser)7.76％、甘氨酸(Gly)9.48％、丙氨酸(Ala)4.09％、半胱氨酸(Cys)14.66％、缬氨酸(Val)6.90％、异亮氨酸(Ile)4.53％、亮氨酸(Leu)5.82％、苯丙氨酸(Phe)4.74％、赖氨酸(Lys)2.80％、组氨酸(His)2.59％、精氨酸(Arg)3.88％、酪氨酸(Tyr)17.67％及脯氨酸(Pro)6.90％。
本发明中，西洋参糖肽的中性多糖、糖醛酸和肽分别是以某一特定的成分为标准计算总量，因此各组分含量的加和有并非为100％的可能。
根据本发明优选的，所述西洋参糖肽的分子质量为8kDa。
根据本发明优选的，所述西洋参糖肽的糖和肽链是通过O-糖肽键连接的。
本发明提供了一种上述西洋参糖肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：取西洋参原料，粉碎成粗粉，用6-10倍质量的95wt％乙醇回流提取，收集醇提取液，料渣除去多余溶剂后加入5-8倍质量的10-30wt％乙醇回流提取，收集醇提取液；合并醇提取液，减压浓缩，浓缩液加入乙醇使乙醇终浓度为10wt％，控制温度10℃以下，静置10-15h，离心去除沉淀，上清液继续加入乙醇使乙醇终浓度为80wt％，控制温度10℃以下，静置20-24h，过滤，收集沉淀得到西洋参糖肽粗品；
(2)脱色：将步骤(1)的西洋参糖肽粗品用去离子水溶解得西洋参糖肽粗品溶液，加入活性炭脱色，得澄清液；
(3)柱层析分离：将步骤(2)的澄清液加到DEAE-53纤维层析柱，采用去离子水洗脱，弃去水洗脱液；再用0.1mol/L的NaCl水溶液洗脱，弃去洗脱液；然后用0.4mol/L的NaCl水溶液洗脱，收集该部分洗脱液；
(4)超滤处理：将步骤(3)收集的洗脱液用8kDa透析袋透析，收集透析袋内的透析液；
(5)精制：将步骤(4)的透析液缓慢加到SephadexG-150凝胶柱，用去离子水洗脱，利用280nm和490nm双波长实时监测洗脱液吸光度，出现信号时开始收集，信号结束停止收集，浓缩冻干即得精制的西洋参糖肽。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述西洋参原料为西洋参粒头，购买自威海道地参业公司，经鉴定为五加科植物西洋参Panax quinquefolium L.的干燥根。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述粗粉是能够过3号筛的粉末。
根据本发明优选的，步骤(1)中用6-10倍质量的95wt％乙醇回流提取2次，每次1-3h；进一步优选为用8倍质量的95wt％乙醇回流提取2次，每次2h。
根据本发明优选的，步骤(1)中料渣除去多余溶剂采用物理压榨法。
根据本发明优选的，步骤(1)中加入5-8倍质量的10-30wt％乙醇回流提取2次，每次1-3h；进一步优选为加入6倍质量的20wt％乙醇，回流提取2次，每次2h。
根据本发明优选的，步骤(1)中浓缩液加入95wt％乙醇使乙醇终浓度为10wt％，控制温度0～10℃，静置12h，3500rpm离心10-30min，去除沉淀。
根据本发明优选的，步骤(1)中上清液继续加入95wt％乙醇使乙醇终浓度为80wt％，控制温度0～10℃，静置24h。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述西洋参糖肽粗品用400-600倍质量的去离子水溶解；进一步优选为用500倍质量的去离子水溶解。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述活性炭的加量为1-5％；进一步优选为2％，单位g/100mL西洋参糖肽粗品溶液。
根据本发明优选的，步骤(2)中加入活性炭后搅拌，静置2-10h，过滤得澄清液。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述DEAE-53纤维层析柱的径高比为1:10，树脂填料量:样品量≥600:1。
根据本发明优选的，步骤(3)中澄清液加到DEAE-53纤维层析柱的上样速度为0.5-2BV/h，上柱体积为10-20BV，上柱后静置1-3h；进一步优选的上样速度为1BV/h，上柱体积为15BV，上柱后静置2h。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述去离子水洗脱时，洗脱速度为2-5BV/h，洗脱体积为4-8BV；进一步优选的洗脱速度为3BV/h，洗脱体积为5BV。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述0.1mol/L的NaCl水溶液洗脱时，洗脱速度为1-4BV/h，洗脱体积为5-8BV；进一步优选的洗脱速度为2BV/h，洗脱体积为6BV。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述0.4mol/L的NaCl水溶液洗脱时，洗脱速度为1-3BV/h，洗脱体积为6-10BV；进一步优选的洗脱速度为2BV/h，洗脱体积为8BV。
根据本发明优选的，步骤(3)中收集洗脱液后DEAE-53纤维层析柱用1mol/L的NaCl水溶液洗脱再生，实现循环利用。
根据本发明优选的，步骤(5)中所述SephadexG-150凝胶柱的径高比为1:10，树脂填料量:样品量≥450:1。
根据本发明优选的，步骤(5)中所述透析液缓慢加到SephadexG-150凝胶柱的上样速度为0.8-2.4BV/h，上柱体积为5-8BV；进一步优选的上样速度为1.2BV/h，上柱体积为6BV。
根据本发明优选的，步骤(5)中所述去离子水洗脱时，洗脱速度为1.5-3BV/h，洗脱体积为8-15BV；进一步优选的洗脱速度为2.2BV/h，洗脱体积为6BV。
根据本发明优选的，步骤(5)中所述开始收集的信号是280nm和490nm波长下的吸光度同时≥0.3。
根据本发明优选的，步骤(5)中所述西洋参糖肽的得率为3-5％。
本发明还提供了上述西洋参糖肽在制备调节血糖水平的药品或保健品中的应用。
本发明还提供了一种调节血糖水平的药品或保健品，以上述西洋参糖肽为有效成分，加入相应的药剂辅料，药剂辅料的加入量占有效成分和药剂辅料总重量的16-25％。
根据本发明优选的，所述药品或保健品的剂型为片剂、颗粒剂或胶囊剂。
本发明还提供了一种以上述西洋参糖肽为有效成分的片剂，是向西洋参糖肽中加入稀释剂、粘合剂、崩解剂和矫味剂，经造粒、压片制得，其中稀释剂、粘合剂和崩解剂的加入量占片剂总质量的15-22％，矫味剂的加入量占片剂总质量的0.5-2％，所述的稀释剂为马铃薯淀粉，粘合剂和崩解剂均为微晶纤维素，稀释剂、粘合剂、崩解剂的质量比为(3:1:1)～(1:3:3)，矫味剂为木糖醇、柠檬酸和甜橙香精的混合物，木糖醇与柠檬酸的质量比为(1:1)～(1:2)，甜橙香精的加入量占片剂总质量的0.5-1％。
根据本发明优选的，所述以西洋参糖肽为有效成分的片剂，还包括润滑剂，润滑剂的加入量占片剂总质量的1-3％，所述的润滑剂为硬脂酸镁。
上述以西洋参糖肽为有效成分的片剂的制备方法，包括如下步骤：
1)按比例向西洋参糖肽中加入稀释剂、粘合剂和崩解剂，混合20-30分钟，混合均匀，得到混合物料；
2)将步骤1)混合物料加入制粒机中加热造粒，先混合5-15分钟，当出风温度达到30-60℃时，喷乙醇溶液，于50～80℃下干燥，使物料含水量控制在5.0wt％以下，然后过14-20目筛进行整粒；
3)将步骤2)整粒后的颗粒加入矫味剂和润滑剂混合10-15分钟，压片制得以西洋参糖肽为有效成分的片剂。
根据本发明优选的，所述的片剂片重为0.5-0.7g，进一步优选为0.6g；片重差异限度为±5％；每日服用2次，每次2片，能满足调节轻度高血糖患者血糖水平的需求。
根据本发明优选的，步骤2)中所述乙醇溶液的浓度为50-70wt％，进一步优选的，乙醇溶液的浓度为75wt％。
本发明的有益效果：
1、本发明首次在西洋参中发现一种新的西洋参糖肽，是从西洋参根中分离获得，发明人意外发现，该西洋参糖肽是一类结构新颖的糖肽物质，是一种纯的化学成分，是天然存在的糖肽大分子，与经酶解加工处理得到的多糖和多肽混合物有本质的不同，且发明人发现该西洋参糖肽是西洋参中一类重要的药效物质，具有独特的生物活性，对于高血糖具有显著的调节作用，具有安全性高、适于长期服用的特点，具有重要的应用前景。
2、本发明对西洋参糖肽的制备工艺进行了系统研究，并通过优化，建立“五步法”创新生产工艺制备西洋参糖肽，利用绿色环保的试剂与材料，能耗低，方便实现规模化工业化生产。
3、西洋参本身具有“滋阴补气，清热毒”的作用，现代药理研究证实，本发明的发明人意外发现西洋参糖肽对于高血糖的调节作用达到了意料不到的效果，尤其对于轻度高血糖患者效果更佳。本发明的西洋参糖肽不仅可以纠正糖代谢紊乱、消除症状、促进胰岛功能的恢复、改善胰岛素抵抗，还可以防治各种并发症以维持较好的健康和体力，尤其对轻度高血糖降糖效果显著；与西药相比，无毒副作用，可长期服用。本发明的西洋参糖肽片剂，日服用2次，每次2片，即可显著改善轻度高血糖患者的血糖水平。
附图说明
图1为本发明西洋参糖肽的HPLC-ELSD色谱图。
图2为本发明西洋参糖肽的糖组成分析HPLC色谱图；
其中，色谱图中的特征峰依次表示，1：甘露糖，2：木糖，3：葡萄糖4：半乳糖，5：阿拉伯糖。
图3为本发明西洋参糖肽的肽组成分析HPLC色谱图；
其中：色谱图中的特征峰依次表示1：天冬氨酸(Asp)，2：丝氨酸(Ser)，3：甘氨酸(Gly)，4：组氨酸(His)，5：丙氨酸(Ala)，6：精氨酸(Arg)，7：脯氨酸(Pro)，8：半胱氨酸(Cys)，9：缬氨酸(Val)，10：异亮氨酸(Ile)，11：亮氨酸(Leu)，12：苯丙氨酸(Phe)，13：赖氨酸(Lys)，14：酪氨酸(Tyr)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的药品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的操作步骤及方法，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
原料来源：
西洋参粒头：购买自威海道地参业公司，经鉴定为五加科植物西洋参Panaxquinquefolium L.的干燥根。
DEAE-53纤维层析柱：径高比为1:10，树脂填料量:样品量≥600:1。
SephadexG-150凝胶柱：径高比为1:10，树脂填料量:样品量≥450:1。
实施例1：西洋参糖肽的制备
一种西洋参糖肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：取西洋参粒头，粉碎成粗粉，过3号筛，用6倍质量的95wt％乙醇回流提取2次，每次3h，收集醇提取液备用，收集料渣物理压榨除去多余溶剂，加入5倍质量的30wt％乙醇，回流提取2次，每次3h，收集醇提取液备用；合并以上4次的醇提取液，减压浓缩回收乙醇；浓缩液加入95wt％乙醇使乙醇终浓度为10wt％，控制温度10℃，静置10h，3500rpm离心30min，除去蛋白质等沉淀物；上清液继续加入95wt％乙醇使乙醇终浓度为80wt％，控制温度10℃，静置24h，过滤，收集沉淀得到西洋参糖肽粗品；
(2)脱色：将步骤(1)的西洋参糖肽粗品用400倍质量的去离子水溶解，按5％(g/100mL)加入活性碳，搅拌，静置10h，滤取澄清液；
(3)柱层析分离：将步骤(2)的澄清液加到DEAE-53纤维层析柱顶，上样速度为0.5BV/h，上柱体积为20BV，上柱后静置3h，然后用去离子水洗脱，洗脱速度为5BV/h，洗脱体积为8BV，弃去水洗脱液；然后用0.1mol/L的NaCl水溶液洗脱，洗脱速度为4BV/h，洗脱体积为8BV，弃去洗脱液；然后用0.4mol/L的NaCl水溶液洗脱，洗脱速度为3BV/h，洗脱体积为10BV，收集该部分洗脱液；然后层析柱用1mol/L的NaCl水溶液洗脱再生，实现循环利用；
(4)超滤处理：将步骤(3)收集的洗脱液用8kDa透析袋透析，收集透析袋内的透析液；
(5)精制：将步骤(4)的透析液缓慢加到SephadexG-150凝胶柱顶，上样速度为0.8BV/h，上柱体积为8BV，用去离子水洗脱，洗脱速度为3BV/h，洗脱体积为15BV，利用280nm和490nm双波长检测装置实时监测洗脱液吸光度，出现信号时，即280nm和490nm波长下的吸光度同时≥0.3，开始收集洗脱液，信号结束停止收集，浓缩冻干即得精制的西洋参糖肽。西洋参糖肽的得率为3％。
实施例2：西洋参糖肽的制备
一种西洋参糖肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：取西洋参粒头，粉碎成粗粉，过3号筛，用10倍质量的95wt％乙醇回流提取2次，每次1h，收集醇提取液备用，收集料渣物理压榨除去多余溶剂，加入5倍质量的10wt％乙醇，回流提取2次，每次1h，收集醇提取液备用；合并以上4次的醇提取液，减压浓缩回收乙醇；浓缩液加入95wt％乙醇使乙醇终浓度为10wt％，控制温度0℃，静置15h，3500rpm离心10min，除去蛋白质等沉淀物；上清液继续加入95wt％乙醇使乙醇终浓度为80wt％，控制温度0℃，静置24h，过滤，收集沉淀得到西洋参糖肽粗品；
(2)脱色：将步骤(1)的西洋参糖肽粗品用600倍质量的去离子水溶解，按1％(g/100mL)加入活性碳，搅拌，静置2h，滤取澄清液；
(3)柱层析分离：将步骤(2)的澄清液加到DEAE-53纤维层析柱顶，上样速度为2BV/h，上柱体积为10BV，上柱后静置1h，然后用去离子水洗脱，洗脱速度为2BV/h，洗脱体积为4BV，弃去水洗脱液；然后用0.1mol/L的NaCl水溶液洗脱，洗脱速度为1BV/h，洗脱体积为5BV，弃去洗脱液；然后用0.4mol/L的NaCl水溶液洗脱，洗脱速度为1BV/h，洗脱体积为6BV，收集该部分洗脱液；然后层析柱用1mol/L的NaCl水溶液洗脱再生，循环利用；
(4)超滤处理：将步骤(3)收集的洗脱液用8kDa透析袋透析，收集透析袋内的透析液；
(5)精制：将步骤(4)的透析液缓慢加到SephadexG-150凝胶柱顶，上样速度为0.8BV/h，上柱体积为5BV，用去离子水洗脱，洗脱速度为1.5BV/h，洗脱体积为8BV，利用280nm和490nm双波长检测装置实时监测洗脱液吸光度，出现信号时，即280nm和490nm波长下的吸光度同时≥0.3，开始收集洗脱液，信号结束停止收集，浓缩冻干即得精制的西洋参糖肽。西洋参糖肽的得率为4％。
实施例3：西洋参糖肽的纯度测定
(1)高效液相法测定：通过高效液相色谱凝胶过滤色谱法测定实施例1制备的西洋参糖肽(Radix Panacis Quinquefoliiglycopeptiole，RPGG)的纯度，采用PolySep-GFC-P4000柱(7.8mm×300mm)，以蒸馏水为流动相，进样量10μL，流速0.5mL/min，检测器为蒸发光散射器(ELSD)，色谱图如图1所示。结果显示色谱图上为单峰，说明本发明的西洋参糖肽是一种纯的化学成分，为单一组分，面积归一化显示纯度为98.68％。
(2)乙酸纤维薄膜色谱测定：将本发明制备的西洋参糖肽用1mL去离子水溶解，点于乙酸纤维薄膜中间，上样量为10μL，以0.05mol/L吡啶-0.04mol/L乙酸为缓冲液(pH为5.4)，电压420V，时间30min，取出晾干后用3wt％乙酸的甲苯胺兰显色5min，再用1wt％乙酸水溶液小心浸洗2次，西洋参糖肽显单一蓝色斑点，进一步说明本发明的西洋参糖肽为单一组分。
(3)游离蛋白测定：将本发明制备的西洋参糖肽通过Sevage法除游离蛋白后，测定蛋白质含量，结果显示蛋白质含量无变化，说明本发明的西洋参糖肽只含有结合型糖蛋白，不含有游离蛋白，是天然存在的糖肽大分子物质。
实施例4：西洋参糖肽的化学表征
(1)分别采用苯酚-硫酸法测定中性糖含量，采用间羟基联苯法测定总糖醛酸含量，采用Lowry法测定肽含量。以葡萄糖、半乳糖醛酸和牛血清白蛋白为对照品进行测定。结果显示，本发明制备的西洋参糖肽含中性多糖含量(以葡萄糖计)52.8％，糖醛酸含量(以半乳糖醛酸计)41.3％，肽含量(以牛血清白蛋白计)2.3％，均为质量百分比。
(2)采用Tricine-甘油SDS-PAGE测定分子质量：用低分子质量标准品来测定糖肽的分子质量，该标准品由3种多肽和2种低分子质量蛋白组成，分子质量分别为30300、20400、10823、5856、3313Da。电泳结果显示本发明制备的西洋参糖肽的电泳带呈带状分布，与多糖类成分明显不同。以溴酚蓝为指示剂，按照迁移率计算分子量与迁移率的回归方程，以蛋白和多肽的相对迁移率对分子质量对数做标准曲线为y＝-2.2451x+3.2567(R2＝0.9969)。根据西洋参糖肽的相对迁移率求得其分子质量约为8kDa。
(3)组成糖分析：精密称取本发明制备的西洋参糖肽适量，置于具塞试管中，加2mol/L的三氟乙酸1mL，置120℃鼓风干燥箱中水解1.5h，氮气吹干；残渣加甲醇1mL，吹干；残渣加1mol/L的氨水0.5mL，硼氢化钠20mg，室温反应1.5h，加冰乙酸两滴终止反应，吹干；残渣加10wt％乙酸甲醇溶液1mL，吹干；加吡啶0.5mL，乙酸酐1mL密封，置120℃鼓风干燥箱中3h，反应结束后用氮气吹干；残渣加去离子水3mL使溶解，加三氯甲烷3mL萃取，三氯甲烷层吹干；残渣加丙酮0.5mL溶解，进行HPLC分析，结果如图2所示。结果显示，西洋参糖肽单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，其摩尔比为5.2:3.0:2.8:4.5:5.7。
(4)肽组成分析：取本发明制备的西洋参糖肽溶解于6mol/L盐酸中，密封，置120℃条件下水解20h，抽干，采用液相色谱进行氨基酸分析。液相色谱分析条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18(4.6×150mm)，流动相为乙腈:水(55:45，体积比)溶液和KH2PO4缓冲液(pH7.2)，两者的体积比为30:70；流速为1mL/min；紫外检测器检测波长254nm；柱温为室温；结果如图3所示。实验结果显示，西洋参糖肽的肽部分由14种氨基酸组成，以总肽质量计，各氨基酸的质量分数为：天冬氨酸(Asp)8.18％、丝氨酸(Ser)7.76％、甘氨酸(Gly)9.48％、丙氨酸(Ala)4.09％、半胱氨酸(Cys)14.66％、缬氨酸(Val)6.90％、异亮氨酸(Ile)4.53％、亮氨酸(Leu)5.82％、苯丙氨酸(Phe)4.74％、赖氨酸(Lys)2.80％、组氨酸(His)2.59％、精氨酸(Arg)3.88％、酪氨酸(Tyr)17.67％及脯氨酸(Pro)6.90％。
(5)糖苷键组成分析：取本发明制备的西洋参糖肽500mg，加5mL 0.3mol/L NaOH溶液和5mL 1mol/L硼氢化钠溶液混合，35℃反应24h。比较反应前后样品在波长240nm处的紫外吸收是否有变化，以此确定糖肽中是否存在O-糖肽键。结果显示，经β-消除后，240nm波长处吸光度明显增加，说明西洋参糖肽中糖和肽链是通过O-糖肽键连接的。
对比例：
按照中国专利文献CN102805282A(申请号201110157090.1)公开的生产方法制备西洋参多糖肽，制备方法如下：
取西洋参粒头，以水提取，料液比为1:10，提取温度60℃，提取时间2h，提取2次，过滤合并滤液，真空浓缩成10:1，加入75wt％乙醇沉淀，离心去上清液回收乙醇，沉淀物按1:10加水溶解，加入1％风味蛋白酶，在55℃、pH5.6，水解处理4h，灭酶，过滤真空浓缩，喷雾干燥，得西洋参多糖肽。
实施例5：西洋参糖肽对大鼠体外胰岛β细胞的保护作用
按照现有方法分离大鼠胰岛β细胞，调整细胞浓度为2×105个/mL，置于6孔培养板中，用含10％FBS、青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL的RPMI-1640培养基，于5％CO2、37℃培养5d后备用。在含等量胰岛β细胞的培养液中加入高、中、低剂量的本发明制备的西洋参糖肽预处理，同时设对比样品组(对比样品组加入对比例制备的样品)；继续培养24h，之后所有组再加入链脲佐菌素(STZ)造模处理2h后，收集培养上清，按MTT法测定胰岛β细胞存活率，按放射免疫分析试剂盒说明书测定胰岛素和C肽分泌量。
结果显示，造模药STZ明显影响胰岛β细胞的存活以及胰岛素的分泌量，与正常组相比具有极其显著性差异(p<0.01)；在先加入本发明制备的西洋参糖肽处理后，再加入STZ，发现西洋参糖肽可显著提高STZ造成的细胞死亡，以及提高胰岛素的分泌量，与STZ造模组相比，均具有显著性差异，也显著优于对比样品组(见表1)。
表1.西洋参糖肽对大鼠体外胰岛β细胞的保护作用
注：*代表与STZ造模组相比，p<0.05；**代表与STZ造模组相比，p<0.01。##代表与对比样品组相比，p<0.01。
实施例6：西洋参糖肽对糖尿病大鼠糖耐量的影响
正常SD大鼠禁食不禁水12h后，以0.1M链脲佐菌素-0.1M枸橼酸缓冲液(pH4.5)按50mg/kg剂量腹腔注射建立糖尿病动物模型。3天后用血糖仪测定大鼠空腹血糖，血糖值大于10mmol/L的大鼠用于糖耐量实验。糖尿病大鼠禁食不禁水12h后，随机分为5组，每组6只，分别为模型组、二甲双胍组(100mg/kg)、西洋参糖肽低、中、高剂量组(50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg)，同时设对比样品组(对比例西洋参多糖肽200mg/kg)，另设正常对照组，灌药30min后一次性灌胃葡萄糖溶液(2g/kg)，给予葡萄糖后30、60和120min测定血糖值，考察不同剂量组分对糖尿病大鼠葡萄糖负荷后血糖升高的影响，结果见表2。
结果显示，西洋参糖肽中、高剂量组大鼠血糖曲线下面积均低于模型组，且高剂量组显示有统计学差异(P＜0.05)，表明本发明的西洋参糖肽具有降低糖尿病大鼠血糖曲线下面积的作用，可以改善糖尿病大鼠的糖耐量状态，也显著优于对比样品组。
表2.西洋参糖肽对糖尿病大鼠糖耐量的影响(n＝6，X±SD)
注：*与模型组比较，具有差异显著(P＜0.05)；**与模型组比较，差异极显著(P＜0.01)，#与对比样品组相比，具有差异性显著(P＜0.05)。
Claims (15)
1.一种西洋参糖肽，其特征在于，所述西洋参糖肽中含有中性多糖52.8%，以葡萄糖计；糖醛酸41.3%，以半乳糖醛酸计；肽2.3%，以牛血清白蛋白计；均为质量百分比；
所述西洋参糖肽的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，其摩尔比为5.2:3.0:2.8:4.5:5.7；
所述西洋参糖肽的肽由14种氨基酸组成，以总肽质量计，各氨基酸的质量分数如下：天冬氨酸（Asp）8.18 %、丝氨酸（Ser）7.76 %、甘氨酸（Gly）9.48 %、丙氨酸（Ala）4.09 %、半胱氨酸（Cys）14.66 %、缬氨酸（Val）6.90 %、异亮氨酸（Ile）4.53 %、亮氨酸（Leu）5.82 %、苯丙氨酸（Phe）4.74 %、赖氨酸（Lys）2.80 %、组氨酸（His）2.59 %、精氨酸（Arg）3.88 %、酪氨酸（Tyr）17.67 %及脯氨酸（Pro）6.90 %；
所述西洋参糖肽按照如下方法制备得到：
（1）提取：取西洋参原料，粉碎成粗粉，用6-10倍质量的95wt%乙醇回流提取，收集醇提取液，料渣除去多余溶剂后加入5-8倍质量的10-30wt%乙醇回流提取，收集醇提取液；合并醇提取液，减压浓缩，浓缩液加入乙醇使乙醇终浓度为10 wt%，控制温度10℃以下，静置10-15h，离心去除沉淀，上清液继续加入乙醇使乙醇终浓度为80 wt%，控制温度10℃以下，静置20-24 h，过滤，收集沉淀得到西洋参糖肽粗品；
（2）脱色：将步骤（1）的西洋参糖肽粗品用去离子水溶解得西洋参糖肽粗品溶液，加入活性炭脱色，得澄清液；
（3）柱层析分离：将步骤（2）的澄清液加到DEAE-53纤维层析柱，采用去离子水洗脱，弃去水洗脱液；再用0.1 mol/L的NaCl水溶液洗脱，弃去洗脱液；然后用0.4 mol/L的NaCl水溶液洗脱，收集该部分洗脱液；
（4）超滤处理：将步骤（3）收集的洗脱液用8kDa透析袋透析，收集透析袋内的透析液；
（5）精制：将步骤（4）的透析液缓慢加到SephadexG-150凝胶柱，用去离子水洗脱，利用280 nm和490 nm双波长实时监测洗脱液吸光度，出现信号时开始收集，信号结束停止收集，浓缩冻干即得精制的西洋参糖肽。
2.如权利要求1所述的西洋参糖肽，其特征在于，所述西洋参糖肽的分子质量为8kDa。
3.如权利要求1所述的西洋参糖肽，其特征在于，所述西洋参糖肽的糖和肽链是通过O-糖肽键连接的。
4.如权利要求1所述的西洋参糖肽，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：
a. 步骤（1）中所述西洋参原料为西洋参粒头，经鉴定为五加科植物西洋参Panaxquinquefolium L．的干燥根；
b. 步骤（1）中所述粗粉是能够过3号筛的粉末；
c. 步骤（1）中用6-10倍质量的95wt%乙醇回流提取2次，每次1-3h；
d. 步骤（1）中料渣除去多余溶剂采用物理压榨法；
e. 步骤（1）中加入5-8倍质量的10-30wt%乙醇回流提取2次，每次1-3h；
f. 步骤（1）中浓缩液加入95wt%乙醇使乙醇终浓度为10wt%，控制温度0~10℃，静置12h，3500rpm离心10-30min，去除沉淀；
g. 步骤（1）中上清液继续加入95wt%乙醇使乙醇终浓度为80 wt%，控制温度0~10℃，静置24 h；
h. 步骤（2）中所述西洋参糖肽粗品用400-600倍质量的去离子水溶解；
i. 步骤（2）中所述活性炭的加量为1-5%，单位g/100mL西洋参糖肽粗品溶液；
j. 步骤（2）中加入活性炭后搅拌，静置2-10h，过滤得澄清液；
k. 步骤（3）中所述DEAE-53纤维层析柱的径高比为1:10，树脂填料量:样品量≥600:1；
l. 步骤（3）中澄清液加到DEAE-53纤维层析柱的上样速度为0.5-2 BV/h，上柱体积为10-20BV，上柱后静置1-3h；
m. 步骤（3）中所述去离子水洗脱时，洗脱速度为2-5 BV/h，洗脱体积为4-8BV；
n. 步骤（3）中所述0.1 mol/L的NaCl水溶液洗脱时，洗脱速度为1-4 BV/h，洗脱体积为5-8BV；
o. 步骤（3）中所述0.4 mol/L的NaCl水溶液洗脱时，洗脱速度为1-3 BV/h，洗脱体积为6-10BV；
p. 步骤（3）中收集洗脱液后DEAE-53纤维层析柱用1 mol/L的NaCl水溶液洗脱再生，实现循环利用；
q. 步骤（5）中所述SephadexG-150凝胶柱的径高比为1:10，树脂填料量:样品量≥450:1；
r. 步骤（5）中所述透析液缓慢加到SephadexG-150凝胶柱的上样速度为0.8-2.4 BV/h，上柱体积为5-8BV；
s. 步骤（5）中所述去离子水洗脱时，洗脱速度为1.5-3 BV/h，洗脱体积为8-15 BV；
t. 步骤（5）中所述开始收集的信号是280 nm和490 nm波长下的吸光度同时≥0.3；
u. 步骤（5）中所述西洋参糖肽的得率为3-5%。
5.如权利要求4所述的西洋参糖肽，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：
i. 步骤（1）中用8倍质量的95wt%乙醇回流提取2次，每次2h；
ii. 步骤（1）加入6倍质量的20wt%乙醇，回流提取2次，每次2h；
iii. 步骤（2）所述西洋参糖肽粗品用500倍质量的去离子水溶解；
iv. 步骤（2）中所述活性炭的加量为2%；
v. 步骤（3）中澄清液加到DEAE-53纤维层析柱的上样速度为1 BV/h，上柱体积为15BV，上柱后静置2h；
vi. 步骤（3）中所述去离子水洗脱时，洗脱速度为3 BV/h，洗脱体积为5BV；
vii. 步骤（3）中所述0.1 mol/L的NaCl水溶液洗脱时，洗脱速度为2 BV/h，洗脱体积为6BV；
viii. 步骤（3）中所述0.4 mol/L的NaCl水溶液洗脱时，洗脱速度为2 BV/h，洗脱体积为8BV；
ix. 步骤（5）中所述透析液缓慢加到SephadexG-150凝胶柱的上样速度为1.2 BV/h，上柱体积为6 BV；
x. 步骤（5）中所述去离子水洗脱时，洗脱速度为2.2 BV/h，洗脱体积为6BV。
6.权利要求1-5任一项所述的西洋参糖肽在制备调节血糖水平的药品中的应用。
7.一种调节血糖水平的药品，其特征在于，以权利要求1-5任一项所述的西洋参糖肽为有效成分，加入相应的药剂辅料，药剂辅料的加入量占有效成分和药剂辅料总重量的16-25%。
8.如权利要求7所述的药品，其特征在于，所述药品的剂型为片剂、颗粒剂或胶囊剂。
9.一种以权利要求1-5任一项所述的西洋参糖肽为有效成分的片剂，是向西洋参糖肽中加入稀释剂、粘合剂、崩解剂和矫味剂，经造粒、压片制得，其中稀释剂、粘合剂和崩解剂的加入量占片剂总质量的15-22%，矫味剂的加入量占片剂总质量的0.5-2%，所述的稀释剂为马铃薯淀粉，粘合剂和崩解剂均为微晶纤维素，稀释剂、粘合剂、崩解剂的质量比为(3:1:1)~(1:3:3)，矫味剂为木糖醇、柠檬酸和甜橙香精的混合物，木糖醇与柠檬酸的质量比为(1:1)~(1:2)，甜橙香精的加入量占片剂总质量的0.5-1%。
10.如权利要求9所述的片剂，其特征在于，所述以西洋参糖肽为有效成分的片剂，还包括润滑剂，润滑剂的加入量占片剂总质量的1-3%，所述的润滑剂为硬脂酸镁。
11.权利要求9所述的以西洋参糖肽为有效成分的片剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）按比例向西洋参糖肽中加入稀释剂、粘合剂和崩解剂，混合20-30分钟，混合均匀，得到混合物料；
2）将步骤1）混合物料加入制粒机中加热造粒，先混合5-15分钟，当出风温度达到30-60℃时，喷乙醇溶液，于50-80℃下干燥，使物料含水量控制在5.0 wt%以下，然后过14-20目筛进行整粒；
3）将步骤2）整粒后的颗粒加入矫味剂和润滑剂混合10-15分钟，压片制得以西洋参糖肽为有效成分的片剂。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的片剂片重为0.5-0.7 g，片重差异限度为±5 %。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述片剂片重为0.6 g。
14.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述乙醇溶液的浓度为50-70wt%。
15.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述乙醇溶液的浓度为75wt%。
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