CN114213516B - 一种轮叶党参来源的催乳及抗乳腺肿瘤的活性肽及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物小分子活性肽领域，具体涉及一种轮叶党参来源的小分子催乳及抗乳腺肿瘤的活性肽及其制备方法和用途，所述活性肽其氨基酸序列为Phe‑Gly‑Arg‑Trp‑Arg。本发明先采用高效液相色谱‑串联质谱对轮叶党参低聚肽产品进行分析鉴定及高效率的活性筛选，获得具有潜在抗癌作用的高活性小分子肽，通过SephadexLH‑20葡聚糖凝胶柱色谱及高效液相色谱分离纯化获得小分子肽并进行活性验证。结果表明该小分子活性肽具有很强的催乳及抗乳腺肿瘤活性，属于食源性活性肽，可用于产后缺乳及乳腺肿瘤相关疾病的治疗，可用于食品、保健品及生物医药制品的开发，具有广阔的应用前景。

Description

一种轮叶党参来源的催乳及抗乳腺肿瘤的活性肽及其制备方 法和用途

技术领域

本发明属于植物小分子活性肽领域，具体涉及一种轮叶党参来源的小分子催乳及抗乳腺肿瘤的活性肽。

背景技术

催乳素(Prolactin,简称PRL)是一种多肽类蛋白激素，由垂体前叶腺嗜酸细胞、妊娠子宫蜕膜和免疫细胞等分泌，人类的PRL分子就是一个含198个氨基酸残基的多肽。催乳素在人体中发挥着重要的生理作用，除了促进乳腺发育生长，刺激并维持泌乳外，还在调节卵巢功能、维持妊娠方面有重要影响。例如催乳素可直接作用乳腺泌乳细胞膜上的受体，激活膜上结合酶及腺苷环化酶的活性而起泌乳作用，还能够刺激卵泡LH受体生成等。

轮叶党参是桔梗科党参属的多年生草本，有白色乳汁，又名“羊乳、四叶参、山胡萝卜”等。《植物名实图考》对其记载“发乳汁，壮阳道”；《浙江民间草药》记载“发乳”。轮叶党参含有三萜皂苷、甾醇、生物碱、木脂素等物质，以及蛋白质、膳食纤维、矿物质、维生素等营养成分，是食药两用植物。轮叶党参既作为山野菜广为食用，又作为传统中药材，具有滋补、益气、通乳、排脓、祛痰、消炎等功效。现代研究表明，轮叶党参具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保肝、降血脂、降血糖、抗血栓、神经保护等生物活性。近些年，中国东北地区的轮叶党参人工种植面积不断增加，具备极大地开发价值和广阔的市场前景。

轮叶党参干品中蛋白质含量约11％-15％，目前对轮叶党参成分的研究集中在多糖、皂苷、黄酮等成分，对轮叶党参的蛋白质成分研究极少。对于轮叶党参的催乳、抗肿瘤作用，已有相关研究，但未涉及具体功效成分。关于轮叶党参的相关专利主要是栽培种植技术和含有轮叶党参的组合物的应用，如ZL201810473358.4发明了一种提高轮叶党参种子发芽率的方法，ZL201810748981.6发明了一种含有轮叶党参成分的治疗呼吸系统疾病的中药组合物制剂，ZL201310334283.9发明了一种含有轮叶党参的保健面包，目前没有相关专利和文献对轮叶党参低聚肽的制备工艺及其活性肽的功能进行研究。

发明内容

本发明针对上述存在问题、现状及发展前景，提供一种轮叶党参来源的催乳及抗乳腺肿瘤的活性肽，该活性肽具有催乳及抗乳腺肿瘤活性，分子量小，活性高，易于分离纯化，制备工艺简单，可用于产后缺乳及乳腺肿瘤等相关疾病的保健及治疗，在医药生物领域有广阔的应用前景。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种轮叶党参来源的催乳及抗乳腺肿瘤的活性肽，所述活性肽的氨基酸序列为Phe-Gly-Arg-Trp-Arg。

作为一种优选方案，活性肽分子量为720.38Da。

一种所述的活性肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备轮叶党参低聚肽；

S2、将步骤S1所得轮叶党参低聚肽分离纯化为小分子活性肽。

作为一种优选方案，，步骤S1制备轮叶党参低聚肽的方法：将轮叶党参样品粗粉碎处理后，加入10～15倍质量体积的水制成匀浆液并置于酶解罐中；向酶解罐中加入轮叶党参质量0.5～1.0％的纤维素酶，在45～50℃下酶解1～2小时，酶反应pH值控制在5.0～6.0；向酶解罐中加入轮叶党参蛋白质质量3～5％的复合蛋白酶，在50～60℃下酶解3～4小时，酶反应pH值控制在8.5～9.5，所述复合蛋白酶的质量配比为：木瓜蛋白酶:中性蛋白酶:碱性蛋白酶＝(2～4):(1～2):(4～6)；酶解结束后升温至80～90℃灭酶10～15分钟，得到轮叶党参酶解液；将轮叶党参酶解液以6000～8000转/分钟离心8～10分钟，去除颗粒状物质，清液采用截留分子量为3000Da的超滤膜进行分离，过膜液喷雾干燥得轮叶党参低聚肽粉。

作为一种优选方案，步骤S2将轮叶党参低聚肽分离纯化为小分子活性肽的方法：将轮叶党参低聚肽粉加水溶解，配制成浓度为100mg/mL的溶液，采用葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱色谱法进行分离纯化，流动相为40％甲醇，流速为0.3～0.6mL/min，洗脱液280nm测定吸光度，根据吸光度值收集所需峰；采用高效液相色谱再纯化，收集保留时间在15分钟左右的色谱峰，浓缩后冷冻干燥得小分子活性肽，其中色谱条件如下：C18色谱柱，流动相A为含体积百分数0.07％～0.1％三氟乙酸水，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件为：0～10min，5％B；10～20min，5％～15％B；20～30min，15％B～30％B；30～45min，30％B～45％B；流速为0.8～1.0mL/min，检测波长为280nm。

作为一种优选方案，所述的活性肽的制备方法还包括活性肽纯度及氨基酸序列测定：收集的小分子肽经液相色谱检测为单一峰，利用高效液相色谱-质谱测定结构，其氨基酸序列为：Phe-Gly-Arg-Trp-Arg，其分子量为720.38Da。

作为一种优选方案，所述轮叶党参原料为长白山地区的轮叶党参。

作为一种优选方案，所述步骤S2中的葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱内径为3.0cm，柱长100cm；所述C18色谱柱内径为4.6mm，柱长250mm，粒度5μm。

一种所述的活性肽在催乳及抗乳腺肿瘤细胞增殖中的应用。

一种所述的活性肽在催乳及抗乳腺肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明填补了轮叶党参的蛋白质成分制备小分子活性肽的研究空白，开发了新的轮叶党参低聚肽的制备、分离纯化工艺及功效研究。

(2)在前期对轮叶党参低聚肽进行高效液相色谱-质谱分析鉴定和利用在线数据库进行活性筛选，获得高活性小分子肽，在此基础上利用Sephadex LH-20凝胶柱层析及高效液相色谱等分离技术对此活性肽进行分离纯化，验证其活性，最终获得一个高抗癌活性肽，其氨基酸序列为：Phe-Gly-Arg-Trp-Arg，经在线数据库BIOPEP及EROP-Moscow检索，所述序列为新的小分子活性肽。

(3)该活性肽的分子量小，活性高，分离纯化步骤简单，易于获得，属食源性的活性肽，长期食用达到催乳的作用，可用于开发治疗产后缺乳，该小分子肽还具有抗乳腺肿瘤活性，可应用于乳腺癌症相关疾病的保健、治疗及相关产品的开发，在医药领域等有广阔的应用前景。

(4)在此基础上，对此抗乳腺肿瘤活性肽进行计算机辅助药物设计，发现众多具有潜在抗癌活性的小分子肽，后续可进一步进行活性的验证及相关的产品的研究开发。

附图说明

图1为本发明小分子活性肽对血清PRL的影响图。

图2为本发明小分子活性肽对人乳腺癌细胞增值的抑制活性图。

图3为实施例3的小分子活性肽对人乳腺癌细胞增值的抑制活性图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明进一步说明，但本发明不局限于具体实施例。

实施例1

一种轮叶党参来源的催乳及抗乳腺肿瘤的活性肽，所述活性肽其氨基酸序列为Phe-Gly-Arg-Trp-Arg。

实施例2

实施例1中所述轮叶党参(Codonopsis lanceolata)来源的催乳及抗乳腺肿瘤的活性肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、轮叶党参低聚肽的制备：

选取来自长白山地区的轮叶党参样品1000g，粗粉碎处理后，加水匀浆制成匀浆液置于酶解罐中，轮叶党参与水的质量体积比为1:15，加入轮叶党参质量(以干重计)0.5％的纤维素酶，在45℃下酶解2小时，酶反应pH值控制在5.0，然后加入轮叶党参蛋白质质量3％的复合蛋白酶，该蛋白酶配比为：木瓜蛋白酶：中性蛋白酶：碱性蛋白酶＝3:1:4，在55℃下酶解4小时，酶反应pH值控制在9.0，酶解结束后升温至85℃灭酶10分钟，得到轮叶党参酶解液，将酶解液8000转/分钟离心8分钟，去除颗粒状物质，然后采用膜分离技术进行分离，截留分子量为3000Da，过膜液喷雾干燥得轮叶党参低聚肽粉。

S2、小分子活性肽的分离纯化：

将S1中的轮叶党参低聚肽粉加水溶解，配制成100mg/mL，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱法(3.0×100cm)进行分离纯化，流动相为40％甲醇，流速为0.5mL/min，洗脱液280nm测定吸光度，根据吸光度值收集所需峰。

采用高效液相色谱进一步纯化，色谱条件如下：依利特C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A为0.1％三氟乙酸水(v/v)，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件为：0～10min，5％B；10～20min，5％～15％B；20～30min，15％B～30％B；30～45min，30％B～45％B；流速为0.9mL/min，检测波长为280nm，收集保留时间在15分钟的色谱峰，浓缩后冷冻干燥得小分子活性肽。

S3、纯度及结构测定：

收集的小分子肽经液相色谱检测为单一峰，利用高效液相色谱-质谱测定结构，其氨基酸序列为：Phe-Gly-Arg-Trp-Arg，其分子量为720.38Da。

催乳作用测定：

采用动物实验验证该小分子活性肽的催乳作用。

取适量健康的SD大鼠(雄：雌＝1：3，且雌鼠未经孕产)同笼饲养，15天后取出雄鼠，将确认怀孕的雌鼠移至单笼饲养，直至产仔。挑选产仔间隔不超过24h的雌鼠50只，随机分成5组(对照组、模型组、实验组1、2、3)，每组10只。

对照组：于产后第2天起，每日上午用生理盐水(10mL/kg)灌胃l次，持续7天。

模型组：于产后第2天起，每日上午用0.05mg/mL的甲磺酸溴隐亭(10mL/kg)灌胃造模，同时用生理盐水(10mL/kg)灌胃l次，持续7天。

实验组1(低剂量组)：于产后第2天起，每日上午用0.05mg/mL的甲磺酸溴隐亭(10mL/kg)灌胃造模，同时用0.2mg/mL的小分子活性肽(10mL/kg)灌胃l次，持续7天。

实验组2(中剂量组)：于产后第2天起，每日上午用0.05mg/mL的甲磺酸溴隐亭(10mL/kg)灌胃造模，同时用0.5mg/mL的小分子活性肽(10mL/kg)灌胃l次，持续7天。

实验组3(高剂量组)：于产后第2天起，每日上午用0.05mg/mL的甲磺酸溴隐亭(10mL/kg)灌胃造模，同时用1.0mg/mL的小分子活性肽(10mL/kg)灌胃l次，持续7天。

实验结束后，取所有雌鼠的腹主动脉血约2mL，4000r/min离心5min，分离血清，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定各组雌鼠血清中的PRL。

实验结果见图1，结果表明，该小分子活性肽能够提高血清催乳素水平，改善缺乳症状，起到催乳作用。

抗肿瘤活性测定：

采用人乳腺肿瘤MCF-7细胞株中进行MTT实验，筛选活性肽的抗癌效果。

具体实验过程如下：取对数生长期MCF-7细胞，以每孔1000-10000个接种于96孔培养板中,每孔100μL，在37℃、5％CO2条件下继续培养，至细胞单层铺满96孔平底板，然后加入不同浓度的小分子肽溶液作用于细胞，每孔100μL，每个浓度设5个复孔，对照组不加药物，5％CO2，37℃孵育24小时，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h,4h后终止培养，小心吸去上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪在570nm处测量各孔的吸光度值，计算不同浓度小分子肽对细胞的生长抑制率。

细胞抑制率＝(对照组A570－实验组A570)/对照组A570×100％

实验结果见图2，结果表明，该小分子活性肽具有明显的抑制人乳腺肿瘤细胞增殖的作用，IC50为0.40mg/mL。

实施例3

以所述活性肽序列为核心，任何对其进行的相应的调整或修饰。如对氨基酸序列进行相应的调整或修饰后的应用，包括对活性肽进行进一步的抗癌药物设计，如第五位的氨基酸Arg可被Cys、Glu、Ile、Pro、Gly中的任一氨基酸代替，替代后的小分子肽均仍具有潜在的抗癌活性。将实施例1中活性肽的第五位氨基酸Arg替换为Gly，得到新的活性肽段，氨基酸序列为Phe-Gly-Arg-Trp-Gly。

采用人乳腺肿瘤MCF-7细胞株中进行MTT实验，验证其抗癌效果。

具体实验过程如下：取对数生长期MCF-7细胞，以每孔1000-10000个接种于96孔培养板中,每孔100μL，在37℃、5％CO2条件下继续培养，至细胞单层铺满96孔平底板，然后加入不同浓度的小分子肽溶液作用于细胞，每孔100μL，每个浓度设5个复孔，对照组不加药物，5％CO2，37℃孵育24小时，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h,4h后终止培养，小心吸去上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪在570nm处测量各孔的吸光度值，计算不同浓度小分子肽对细胞的生长抑制率。

细胞抑制率＝(对照组A570－实验组A570)/对照组A570×100％

实验结果见图3，结果表明，替换后得到的小分子活性肽仍具有较好的抑制人乳腺肿瘤细胞增殖效果，IC50为0.45mg/mL。

实施例4

本实施例中所述的轮叶党参来源的催乳及抗乳腺肿瘤的活性肽的制备方法的各步骤均与实施例2中相同，不同点为:

(1)步骤S1中，取长白山地区的轮叶党参样品1000g粗粉碎处理后，加入12倍质量体积的水制成匀浆液置于酶解罐中，然后加入轮叶党参质量(以干重计)1.0％的纤维素酶，在50℃下酶解1小时，酶反应pH值控制在5.5；再加入轮叶党参蛋白质质量4％的复合蛋白酶，复合蛋白酶的质量配比为：木瓜蛋白酶:中性蛋白酶:碱性蛋白酶＝2:2:3，在50℃下酶解4小时，酶反应pH值控制在8.5，酶解结束后升温至90℃灭酶15分钟，得到轮叶党参酶解液，将酶解液6500转/分钟离心10分钟，去除颗粒状物质，清液采用截留分子量为3000Da的超滤膜进行分离，过膜液喷雾干燥得轮叶党参低聚肽粉。

(2)步骤S2中流动相为40％甲醇，流速为0.4mL/min；

(3)步骤S2中流动相A为含体积百分数0.09％三氟乙酸水，流速为1.0mL/min。

实施例5

本实施例中所述的轮叶党参来源的催乳及抗乳腺肿瘤的活性肽的制备方法的各步骤均与实施例2中相同，不同点为:

(1)步骤S1中，取长白山地区的轮叶党参样品1000g粗粉碎处理后，加入14倍质量体积的水制成匀浆液置于酶解罐中，然后加入轮叶党参质量(以干重计)0.8％的纤维素酶，在48℃下酶解1小时，酶反应pH值控制在6.0；再加入轮叶党参蛋白质质量5％的复合蛋白酶，复合蛋白酶的质量配比为：木瓜蛋白酶:中性蛋白酶:碱性蛋白酶＝2:1:5，在57℃下酶解3小时，酶反应pH值控制在9.3，酶解结束后升温至80℃灭酶13分钟，得到轮叶党参酶解液，将酶解液7000转/分钟离心10分钟，去除颗粒状物质，清液采用截留分子量为3000Da的超滤膜进行分离，过膜液喷雾干燥得轮叶党参低聚肽粉。

(2)步骤S2中流动相为40％甲醇，流速为0.6mL/min；

(3)步骤S2中流动相A为含体积百分数0.08％三氟乙酸水，流速为0.8mL/min。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 吉林国瑞医药有限公司

大连深蓝肽科技研发有限公司

<120> 一种轮叶党参来源的催乳及抗乳腺肿瘤的活性肽及其制备方法和用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 轮叶党参(Codonopsis lanceolata)

<400> 1

Phe Gly Arg Trp Arg

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 轮叶党参(Codonopsis lanceolata)

<400> 2

Phe Gly Arg Trp Gly

1 5

Claims (4)

1.一种轮叶党参来源的催乳及抗乳腺肿瘤的活性肽，其特征在于，所述活性肽的氨基酸序列为Phe-Gly-Arg-Trp-Arg。

2.一种权利要求1所述的活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备轮叶党参低聚肽：

将轮叶党参样品粗粉碎处理后，加入10～15倍质量体积的水制成匀浆液并置于酶解罐中；

向酶解罐中加入轮叶党参质量0.5～1.0%的纤维素酶，在45～50℃下酶解1～2小时，酶反应pH值控制在5.0～6.0；

向酶解罐中加入轮叶党参蛋白质质量3～5%的复合蛋白酶，在50～60℃下酶解3～4小时，酶反应pH值控制在8.5～9.5，所述复合蛋白酶的质量配比为：木瓜蛋白酶:中性蛋白酶:碱性蛋白酶=（2~4）:（1~2）:（4~6）；

酶解结束后升温至80～90℃灭酶10～15分钟，得到轮叶党参酶解液；

将轮叶党参酶解液以6000～8000转/分钟离心8～10分钟，去除颗粒状物质，清液采用截留分子量为3000Da的超滤膜进行分离，过膜液喷雾干燥得轮叶党参低聚肽粉；

S2、将轮叶党参低聚肽分离纯化为小分子活性肽：

将轮叶党参低聚肽粉加水溶解，配制成浓度为100mg/mL的溶液，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱法进行分离纯化，流动相为40%甲醇，流速为0.3～0.6 mL/min，洗脱液280nm测定吸光度，根据吸光度值收集所需峰，所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱内径为3.0cm，柱长100cm；C18色谱柱内径为4.6mm，柱长250mm，粒度5µm；

采用高效液相色谱再纯化，收集保留时间在15分钟左右的色谱峰，浓缩后冷冻干燥得小分子活性肽，其中色谱条件如下：C18色谱柱，流动相A为含体积百分数 0.07%～0.1%三氟乙酸水，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件为：0～10 min，5%B；10～20 min，5%～15%B；20～30min，15%B～30%B；30～45min，30%B～45%B；流速为0.8～1.0mL/min，检测波长为280nm；

S3、活性肽纯度及氨基酸序列测定：收集的小分子肽经液相色谱检测为单一峰，利用高效液相色谱-质谱测定结构，其氨基酸序列为：Phe-Gly-Arg-Trp-Arg，其分子量为720.38Da。

3.根据权利要求2所述的活性肽的制备方法，其特征在于，所述轮叶党参原料为长白山地区的轮叶党参。

4.一种权利要求1所述的活性肽在制备催乳或抗乳腺肿瘤药物中的应用。