CN102091117B - 一种提高轮叶党参抗癌活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高轮叶党参抗癌活性的方法，将鲜轮叶党参切片或匀浆，或者将干轮叶党参粉碎，或者将干燥的轮叶党参粉末，然后用水浸泡，高压灭菌，在温度降至30℃以下时在无菌条件下加入活性酵母0.5%~5.0%，葡萄糖1%~8%，在20~37℃条件下发酵1~10天，发酵结束后，加入极性溶剂，在0℃~100℃下提取5分钟~24小时，过滤，回收溶剂，减压浓缩或冷冻干燥。用本发明可以提高轮叶党参对肿瘤生长抑制作用。

Description

一种提高轮叶党参抗癌活性的方法

技术领域

本发明涉及一种提高轮叶党参中抗癌活性成分的方法，具体地说，本发明涉及一种利用酵母菌发酵技术，提高轮叶党参中抗癌活性成分含量的方法。

背景技术

轮叶党参（Codonopsis Lanceolata Benth.et Hook.F.）又名羊乳、四叶参、山胡萝卜、山海螺及白蟒肉等，是桔梗科党参属植物羊乳的根，多分布于中国东北、华南、西南地区及朝鲜、日本、俄罗斯等国家，在民间常将它作为山野菜食用。传统上其根入药，味甘、性平，是常用的补中益气药，有排脓消肿、清热解毒、补虚通乳、养阴润肺及祛痰之功效。主要用于病后体虚、乳少、肺阴虚、肿痈、乳痈、疮疡肿毒等症。现代药理研究表明轮叶党参具有镇静镇痛、提高学习记忆、抗氧化和增强免役等作用。文献报道轮叶党参中含有多糖、齐墩果酸、皂苷类、黄酮类、挥发油类等成分。而有研究表明多糖，齐墩果酸有较好的预防肿瘤的作用。然而，用一定浓度的乙醇水溶液浸泡轮叶党参生药材24小时后，得到的提取物对小鼠肿瘤生长没有明显的抑制作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高轮叶党参抗癌活性的方法，具体是提供一种生物发酵方法，以显著提高轮叶党参抗癌有效成分含量。

本发明的技术方案为：

一种提高轮叶党参抗癌活性的方法，首先

将鲜轮叶党参切片或匀浆，

或者将干轮叶党参粉碎，

或者将干燥的轮叶党参粉末，

然后用水浸泡，高压灭菌，在温度降至30℃以下时在无菌条件下加入活性酵母0.5 %~5.0 %，葡萄糖1%~8%，在20~37℃条件下发酵1~10天，发酵结束后，加入极性溶剂，在0℃~100℃优选70℃~100℃下提取5分钟~24小时，过滤，回收溶剂，减压浓缩或冷冻干燥。

所述的极性溶剂为乙醇或水。

所述经减压浓缩或冷冻干燥后所得到的轮叶党参提取物，用液液分配技术和色谱技术进行精制，得到轮叶党参皂苷，用于制备抗癌药物或食品，也可在肿瘤化学预防制剂中的应用。

将发酵的轮叶党参分别用蒸馏水、30%乙醇、50%乙醇及70%乙醇加热回流提取5分钟~24小时，过滤或离心，除去不溶性物质后，减压浓缩，用65%~80%乙醇醇沉，去掉蛋白质和多糖，回收乙醇，真空干燥或冷冻干燥，得到轮叶党参提取物，通过柱层析方法进行精制，得到轮叶党参皂苷，用于肝癌抑制实验和二乙基亚硝胺（DEN）诱发肝癌的预防实验。

本发明人用轮叶党参乙醇提取物进行动物酒精性肝损伤保护作用研究，证明其具有明显抑制乙醇对肝脏的损伤作用，还证明了轮叶党参总皂苷具有明显的抗突变作用。本发明人对轮叶党参乙醇提取物的抗突变成分进行过系统分离鉴定，发现其中的齐墩果酸、蒲公英赛醇、α- 菠甾醇等成分具有较强的抗突变作用，其中齐墩果酸的抗突变作用最强。

本发明人发现，轮叶党参用活性酵母发酵后得到的乙醇水溶液提取物，抑制小鼠体内H22肝癌生长作用明显优于未发酵的轮叶党参乙醇水溶液，其抑制率达到51%；明显抑制致癌物二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌癌前病变及肝毒性。用体外细胞培养方法证明发酵轮叶党参抗癌有效成分主要为轮叶党参皂苷。因此，采用适宜生物发酵技术，提高轮叶党参中的抗癌活性成分有利于将轮叶党参利用于肿瘤的预防和治疗。研究发现，在干燥的轮叶党参中加入一定浓度的活性酵母、葡萄糖，在适宜的温度下进行发酵，然后用乙醇水溶液提取，所得到的提取物，明显抑制小鼠体内H22肿瘤的生长。经有机溶剂萃取后，在体外明显抑制H22和HepG2癌细胞的增殖，且正丁醇萃取部位的活性最强。用活性酵母发酵轮叶党参之后，皂苷含量明显增高。本发明得到的发酵轮叶党参乙醇提取物还可以显著预防二乙基亚硝胺的肝脏毒性，可以预防肝癌的癌前病变。有效成分以轮叶党参苷、丁香苷为代表。 

本发明得到的提取物发酵轮叶党参总皂苷对小鼠H₂₂肿瘤的抑制作用及对DEN肝脏毒性的预防作用实验如下：

1材料与方法

1.1  试验药物 

轮叶党参为本地区野生轮叶党参，洗净，切片，晒干。

二乙基亚硝胺(DEN)为日本半井化学药品株式会社产品，注射用环磷酰胺为江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号01102521。MDA、GSTs、TNF-α试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。SUNRISE酶标仪为瑞士Tecan公司产品。

未发酵轮叶党参总皂苷制备：取干燥的轮叶党参生药材2kg，粉碎，用50%的乙醇回流提取，回收乙醇，用60%~80%乙醇醇沉，除去蛋白质和多糖后，回收乙醇，减压干燥，用D101大孔吸附树脂分离其中的轮叶党参粗皂苷。

发酵轮叶党参总皂苷制备：取干燥的轮叶党参生药材2kg，粉碎，用水浸泡，高压灭菌，在无菌条件下加入活性酵母0.5 %~5.0 %，葡萄糖1%~8%，在20~37℃发酵时间为1~10天，发酵结束后用50%的乙醇回流提取，在70℃~100℃下提取5分钟~24小时，回收乙醇，用60%~80%乙醇醇沉，除去蛋白质和多糖后，回收乙醇，减压干燥，用D101大孔吸附树脂分离其中的轮叶党参皂苷。

1.2  实验动物  

昆明种小鼠，雌雄各半，体重20～22g，每组10只，由延边大学医学部实验动物科提供。

1.5 肿瘤抑制试验  

在无菌条件下取生长7天的小鼠移植性H₂₂肿瘤腹水，用8倍体积生理盐水稀释，于小鼠前肢腋窝皮下接种0.2ml/只。以上瘤株接种前，均用0.2%台盼蓝染色，计活细胞数为95%～98%。动物于接种次日随机分组，每组l0只，同样条件正常饲养。抑瘤实验设阴性对照组（每日灌胃蒸馏水10ml/kg）、环磷酰胺对照组（每日腹腔注射环磷酰胺25mg/kg）、发酵轮叶党参总皂苷高剂量组（每日灌胃220mg/kg）、中剂量组（每日灌胃110mg/kg）、低剂量组（每日灌胃55mg/kg）。接种次日起每天给药一次，连用10天。10天后采用脱颈椎法处死，剥取瘤块后称量肿瘤的重量。

1.6 预防二乙基亚硝胺肝脏毒性试验

昆明种小鼠50只，雌、雄各半，体重20～22g，由延边大学医学部实验动物科提供，试验前先在本实验室内适应性喂养3天。实验动物随机分为阴性对照组、单纯DEN组、轮叶党参总皂苷低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只动物。阴性对照组每日灌胃蒸馏水10 ml ∕ kg bw；单纯DEN组和轮叶党参总皂苷三个剂量组隔日腹腔注射DEN 20 mg/kg bw，连续5周；同时，轮叶党参总皂苷低、中、高三个剂量组分别灌胃轮叶党参总皂苷55mg/kg、110mg/kg、220mg/kg。每天记录各组小鼠的体重变化情况。

停药后禁食12h，称量各组小鼠体重，采用脱颈椎法处死小鼠，每只小鼠在同一个部位取一块肝组织，通过HE染色法观察肝脏组织学变化，每只小鼠肝组织标本观察50个高倍视野，计数每组核分裂相及枯否细胞（HE染色×40）。每只小鼠取100 mg肝组织，加0.9 ml生理盐水用冰浴匀浆，1 500×g离心30 min后取上清液，采用酶动力学法测定上清液中GSTs、MDA含量；采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测肝组织匀浆上清液中TNF-α含量；采用考马斯亮蓝法测定匀浆液中的蛋白含量。

结果

2.1 轮叶党参总皂苷抑制小鼠H22肝癌生长作用

由表1可知，与阴性对照组比较，环磷酰胺组有明显抑制小鼠H22肿瘤生长的作用（P<0.01）。轮叶党参高、中、低三个剂量组的肿瘤重量明显低于阴性对照组（P<0.05或P<0.01）。在三个剂量组中，中剂量组的肿瘤抑制率最高，超过50%，表明轮叶党参总皂苷抑制肿瘤的剂量并非越高越高。

表1 发酵轮叶党参乙醇提取物对小鼠H₂₂移植肿瘤的抑制作用

与阴性对照组比较，*p<0.05，**p＜0.01

2.2 发酵前后轮叶党参主要有效成分变化

轮叶党参在发酵前后齐墩果酸和皂苷含量的变化如表2所示。发酵之后，齐墩果酸的含量和皂苷的含量明显增高。

表2  轮叶党参发酵前后齐墩果酸的含量

*与未发酵组比较，P<0.05

2.3 肝脏组织学改变  

阴性对照组小鼠肝组织形态大致正常，细胞核居中，核膜完整，清晰可见，个别可见细胞水肿。DEN组小鼠肝组织出现明显病变，细胞核形态不规则，染色质固缩，核膜不清晰，可见核膜边缘呈锯齿状，可见典型核分裂像，同时可见大量枯否细胞及炎症细胞浸润，细胞水肿明显。轮叶党参总皂苷高剂量组肝组织中仍可见少量核分裂像、枯否细胞、炎症细胞及细胞水肿，但病变程度与DEN组比较明显减轻。轮叶党参总皂苷中、低剂量组肝组织病变与DEN组比较没有显著性差异，可见不典型的核分裂像及大量枯否细胞、炎症细胞浸润，细胞水肿明显。

2.4 肝脏中核分裂像及枯否细胞个数  

由表3可见，DEN组肝组织中核分裂像和枯否细胞数明显高于阴性对照组，差异具有统计学意义（P<0.01）；轮叶党参总皂苷高剂量和中剂量组肝组织中核分裂像和枯否细胞数显著低于DEN组，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。

表3  各组肝组织中核分裂像及枯否细胞个数( 

±s) 

注：与阴性对照组比较^**P<0.01；与DEN组比较，^#P<0.05，^**P<0.05。

2.3  肝脏中GSTs活性、MDA及TNF-α含量  

由表4可见，DEN组肝组织匀浆中GSTs含量明显低于阴性对照组（P<0.01）；轮叶党参总皂苷高、中剂量组肝组织GSTs含量明显高于DEN组，差异具有统计学意义（P<0.01）。DEN组肝组织MDA和TNF-α含量明显高于阴性对照组（P<0.01）；轮叶党参总皂苷高、中、低三个不同剂量组肝组织匀浆中MDA含量明显低于DEN组，差异具有统计学意义（P<0.01），并呈现剂量依存关系。轮叶党参总皂苷高、中剂量组肝组织TNF-α含量低于DEN组，差异具有统计学意义（P<0.01）。

表4 各组肝组织中GSTs、MDA、TNF-α含量比较(

±s)

Table2 The GSTs content and MDA content and TNF-α content liver tissue (

±s)

 

 注：与阴性对照组比较， ^**P<0.01；与DEN组比较，，^## P<0.01。

讨论

轮叶党参是一种药食两用的山野菜，具有抗氧化、抗突变、调血脂、预防酒精性肝损伤等多种功能。本发明人证明轮叶党参水提取液具有抗突变作用，并认为该作用与轮叶党参的抗自由基作用有关。本发明人报道，每天灌胃轮叶党参多糖1.0和2.0g/kg的小鼠瘤重明显低于对照组(P<0.05)，抑瘤率超过30％。因此，轮叶党参多糖对小鼠肉瘤S₁₈₀有抑制作用。本发明人的研究表明轮叶党参能明显有效地清除乙醇在肝脏产生的自由基，保护了肝细胞线粒体膜，使线粒体对脂肪酸的氧化分解能力正常进行，使肝脏中的TG含量明显低于乙醇组，减轻乙醇对肝脏的损伤。而且轮叶党参水提液可以降低高脂饲料喂养大鼠血清胆固醇（TC），甘油三酯（TG），低密度脂蛋白固醇（LDL-C）的含量，具有明显的调理血脂的功能。

轮叶党参中含有大量的挥发油、齐墩果酸、皂苷、黄酮类等成分，而齐墩果酸具有抗癌、抗突变等作用，发酵过的轮叶党参中齐墩果酸和总皂苷含量的含量明显提高。

DEN是一种具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性的化学物质，小剂量长期给药可引发肝肿瘤，大剂量可致使肝细胞发生炎症、坏死和纤维化，DEN进入机体后，可经肝脏细胞内的I相代谢酶（细胞色素P450系统）活化为亲电性的终致癌物，后者可攻击细胞和生物体内大分子，引起细胞恶变。

研究证明，核分裂像的多少常用于肿瘤的分级，若核分裂相增多，特别是出现不对称性、多极性及顿挫性等病理性核分裂相时，对诊断恶性肿瘤具有重要的意义。枯否细胞的无活性或缺失可以减少肝细胞发生脂肪变性、炎症和坏死的可能。抑制枯否细胞活性的干预试验可减轻肝损害。在本试验中轮叶党参总皂苷高、中剂量组肝组织中核分裂相及枯否细胞数明显低于DEN组（P<0.05），表明轮叶党参皂苷可减少肝组织中核分裂像个数及枯否细胞个数，可有效阻止DEN所致细胞恶变的进展并减轻DEN所致炎症损伤。

具体实施方式：

 实施例1

取干燥轮叶党参片，粉碎，过20目筛，称取500g，加入蒸馏水浸泡，高压灭菌，在温度降至30℃以下时加入1%的酵母菌，1%的葡萄糖，30℃发酵2天，用50%乙醇加热回流提取，在0℃~100℃下提取5分钟~24小时，滤液用65%乙醇进行醇沉，对上清液回收乙醇后进行减压浓缩，冷冻干燥，得到轮叶党参提取物，即轮叶党参粗皂苷。

实施例2

取轮叶党参粉500g，加入蒸馏水浸泡，高压灭菌，在温度降至30℃以下时加入2%酵母菌，3%的蔗糖，28℃下发酵7天，在70℃~100℃下用水提取5分钟~24小时，滤液用80%乙醇进行醇沉，对上清液回收乙醇后进行冷冻干燥，用大孔吸附树脂分离得到轮叶党参苷、丁香苷、党参苷等皂苷混合物。用液液分配技术和色谱技术进行精制，得到轮叶党参皂苷，用于制备抗癌药物、食品或肿瘤化学预防制剂。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1.一种提高轮叶党参抗癌活性的方法，其特征在于：

将鲜轮叶党参切片或匀浆，

或者将干轮叶党参粉碎，

或者将干燥的轮叶党参粉末，

然后用水浸泡，高压灭菌，在温度降至30℃以下时在无菌条件下加入活性酵母0.5 %~5.0 %，葡萄糖1%~8%，在20~37℃条件下发酵1~10天，发酵结束后，加入极性溶剂，所述的极性溶剂为乙醇或水，在0℃~100℃下提取5分钟~24小时，过滤，回收溶剂，减压浓缩或冷冻干燥。

2.如权利要求1所述的一种提高轮叶党参抗癌活性的方法，其特征在于所述的发酵结束后，加入极性溶剂，在70℃~100℃下提取。