CN109925445A - 金线莲提取物在制备预防和/或治疗d-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明金线莲提取物在制备预防和/或治疗D‑氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤药物中的应用,属于医药技术领域。本发明首次通过试验证明金线莲提取物可显著改善D‑氨基半乳糖诱导的急性肝损伤症状,具体表现为能够促使小鼠肝细胞坏死区明显缩小,炎细胞浸润、肝细胞气球样变及脂肪样变减轻,肝小叶结构趋于规则,肝索排列较规律、整齐。从生化指标来看,金线莲提取物能够明显降低因D‑氨基半乳糖诱导的急性肝损伤造成的丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶及丙二醛活性升高现象,本发明为金线莲作为天然药物原料特别是作为肝病预防和/或治疗药物的进一步开发利用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及金线莲提取物在制备预防和/或治疗D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤药物中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
D-氨基半乳糖(D-Galactosamine,D-Gal)是肝细胞磷酸尿嘧啶核苷的干扰剂,该模型的肝组织病理形态学特征与人类病毒性肝炎极为相似,能较好的模型人类病毒性肝炎的发病表现。常用的造成动物肝损伤的化学物有四氯化碳,酒精等,但发明人发现,四氯化碳对人体危害大,而D-Gal对人体危害小,且相比于四氯化碳造模与酒精造模,D-Gal只需给药一次,操作方便。因此D-Gal诱发的急性肝损伤是目前公认的较好的研究肝损伤的模型。肝脏疾病是威胁我国人民健康的重大疾病之一,其患病率和致死率均很高。目前尚无更多的特效药可以明显地减轻肝脏的损伤和促进肝细胞的再生,中医药则更为稀少,且国内外对其肝损伤保护作用研究较少。因此开发具有预防和治疗急性肝损伤的高效、低毒的中药具有重要意。
金线莲为兰科开唇兰属植物花叶,开唇兰的全草,研究表明,金线莲中主要含有多糖、黄酮、生物碱等,这些成分具有较强的抗氧化活性。金线莲在民间素有“药王”、“神草”、“乌人参”等美称,大量文献也已报道金线莲及其提取物具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、调节免疫、降低血糖血脂等功效,常被应用于肾炎、肺炎等疾病,是一味名贵珍惜中草药。
发明内容
本发明提供了金线莲提取物在制备预防和/或治疗急性肝损伤的药物中的应用,本发明针对D-氨基半乳糖诱导的急性肝损伤,评价了体重、肝重及肝脏系数的变化,同时检测了血清中丙氨酸氨基转移酶(Alanine transaminase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、以及抑制羟自由基的能力,并对肝脏进行病理组织学检查。结果表明,金线莲提取物可使得小鼠肝细胞坏死区明显缩小,炎细胞浸润、肝细胞气球样变及脂肪样变得到明显改善,肝索排列较规律。结果表明,金线莲提取物的干预显著缓解改善D-氨基半乳糖诱导的急性肝损伤症状,可作为有效成分用于制备预防和/或治疗急性肝损伤的药物,因此具有良好的实际应用之价值。
在本发明的第一个方面,本发明提供了金线莲提取物作为有效成分在制备用于预防和/或治疗急性肝损伤的药物中的应用。
所述急性肝损伤为化学诱发型急性肝损伤,更进一步的为D-氨基半乳糖诱发的急性肝损伤。
在本发明的第二个方面,本发明还提供了金线莲提取物作为有效成分在制备缓解改善肝脏炎性细胞浸润、肝细胞气球样变、肝细胞脂肪样变和/或肝细胞坏死的药物中的应用。
在本发明的第三个方面,本发明还提供了金线莲提取物作为有效成分在制备改善肝小叶结构的药物中的应用。
在本发明的第四个方面,本发明提供了一种用于预防和/或治疗急性肝损伤的药物组合物,其以金线莲提取物为有效成分。
与现有技术相比,本发明方法具有如下优点和进步性:
本发明首次通过试验证明金线莲提取物可显著改善D-氨基半乳糖诱导的急性肝损伤症状,具体表现为能够促使小鼠肝细胞坏死区明显缩小,炎细胞浸润、肝细胞气球样变及脂肪样变减轻,肝小叶结构趋于规则,肝索排列较规律、整齐。从生化指标来看,金线莲提取物能够明显降低因D-氨基半乳糖诱导的急性肝损伤造成的丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶及丙二醛活性升高现象,同时促使肝组织中抑制羟自由基的能力显著升高,且呈现出一定的剂量依赖关系。
本发明为金线莲作为天然药物原料特别是作为肝病预防和/或治疗药物原料的进一步开发利用奠定了基础。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1是本发明实施例1中正常对照组、模型组、金线莲低剂量组、金线莲中剂量组和金线莲高剂量组的小鼠肝脏图片;
图2是本发明实施例1中正常对照组、模型组、金线莲低剂量组、金线莲中剂量组和金线莲高剂量组的小鼠肝组织病理切片H&E染色结果图(×20)。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个典型实施方式中,提供金线莲提取物作为有效成分在制备用于预防和/或治疗急性肝损伤的药物中的应用。
本发明的又一具体实施方式中,所述应用为金线莲提取物作为唯一有效成分或有效成分之一在制备用于预防/或治疗急性肝损伤的药物中的应用。
本发明的又一具体实施方式中,所述急性肝损伤为化学诱发型急性肝损伤,优选为D-氨基半乳糖诱发的急性肝损伤;优选地,所述D-氨基半乳糖的单次剂量为800mg/kg.bw。
本发明的又一具体实施方式中,在上述应用中,所述金线莲提取物单次有效剂量为0.1~3g/kg.bw;更进一步所述的金线莲提取物单次有效剂量包括0.1g/kg.bw,1g/kg.bw,3g/kg.bw。通过试验证明,金线莲提取物的可显著改善D-氨基半乳糖诱导的急性肝损伤表现出一定的剂量依赖关系。金线莲提取物单次有效剂量为3g/kg.bw时,对缓解改善D-氨基半乳糖诱导的急性肝损伤症状疗效最为显著。
本发明的又一具体实施方式中,所述金线莲提取物用水作为提取溶剂来获得;更具体的,所述金线莲提取物,其制备方法为:取金线莲鲜草全草,破碎后加4~8倍量(优选为6倍量)水,煮沸0.4~0.8h(优选0.5h),过滤,取滤液,残渣加等量水,煮沸0.4~0.8h(优选0.5h),重复2次,合并滤液浓缩至膏状即得。通过热水浸提的方式,能够有效提取金线莲药物活性成分,针对急性肝损伤特别是D-氨基半乳糖诱导的急性肝损伤疗效显著。
本发明的又一具体实施方式中,还提供了金线莲提取物作为有效成分在制备缓解改善肝脏炎性细胞浸润、肝细胞气球样变、肝细胞脂肪样变和/或肝细胞坏死的药物中的应用。
本发明的又一具体实施方式中,所述应用为金线莲提取物作为唯一有效成分或有效成分之一在制备缓解改善肝脏炎性细胞浸润、肝细胞气球样变、肝细胞脂肪样变和/或肝细胞坏死的药物中的应用。
本发明的又一具体实施方式中,还提供了金线莲提取物作为有效成分在制备改善肝小叶结构的药物中的应用。
本发明的又一具体实施方式中,所述应用为金线莲提取物作为唯一有效成分或有效成分之一在制备改善肝小叶结构的药物中的应用。
所述改善肝小叶结构的表现包括肝小叶结构趋于规则,肝索排列趋于整齐。
本发明的又一具体实施方式中,在上述任一应用中,金线莲提取物作为药物活性成分,可制成药学上可接受的药物制剂。
本发明的又一具体实施方式中,所述药物制剂选自由用于口服施用的制剂、适用于粘膜的制剂、注射制剂、吸入制剂、和外用制剂组成的组。
本发明的又一具体实施方式中,所述用于口服施用的制剂选自由片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊组成的组。
本发明的又一具体实施方式中,本发明提供了一种用于预防和/或治疗急性肝损伤的药物组合物,其以金线莲提取物为有效成分(可以是唯一有效成分或者有效成分之一)。
本发明的又一具体实施方式中,所述急性肝损伤为化学诱发型急性肝损伤,优选为D-氨基半乳糖诱发的急性肝损伤。
本发明的又一具体实施方式中,所述D-氨基半乳糖的单次剂量为800mg/kg.bw。
在上述用于预防和/或治疗急性肝损伤的药物组合物中,还可以包含药学上可接受的辅料,所述辅料为稀释剂、赋形剂、崩解剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、表面活化剂、稳定剂中的至少一种。
以及,上述组合物也可以制备成药学上可接受的药学上可接受的药物制剂。
本发明的又一具体实施方式中,所述药物制剂选自由用于口服施用的制剂、适用于粘膜的制剂、注射制剂、吸入制剂、和外用制剂组成的组。
本发明的又一具体实施方式中,所述用于口服施用的制剂选自由片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊组成的组。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明,但不构成对本发明的限制。应理解下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1材料
1.1药品与试剂
金线莲,购自福州佳乐达生物工程有限公司(样品编号:(180628)Y2895);D-Gal,购自上海阿拉丁生化科技有限公司;丙氨酸氨基转移酶(Alanine transaminase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)及乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)检测试剂盒购自宁波美康生物科技有限公司。丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、抑制羟自由基的能力试剂盒,购自南京建成生物工程研究所。
1.2动物
昆明小鼠,购自山东大学动物实验中心,实验动物生产许可证号为SCXK(鲁)20130009。实验动物使用合格证号SYXK(鲁)20150015号,实验动物饲料生产许可证SCXK(京)2014-0008。雄性,体重(20±2)g,分笼饲养,动物自由进食、饮水。实验环境温度22℃±2℃,相对湿度50%±10%。
2方法
2.1金线莲提取液的制备
取金线莲鲜草全草180g,洗净,切碎,加六倍量蒸馏水,煮沸0.5h,过滤,取滤液,残渣加等量蒸馏水,煮沸0.5h,重复2次,合并滤液,浓缩成膏状最好加上最终的浓缩体积,至冰箱冷藏备用,临用前用蒸馏水分别稀释至0.1g/kg(相当于成人用药量)、1.0g/kg(相当于成人用药量10倍)、3.0g/kg(相当于成人用药量的30倍)。
2.2动物分组、给药与模型制备
75只雄性昆明小鼠,适应性喂养7天后,随机分为5组:对照组、模型组、金线莲低、中、高剂量组,每组15只。金线莲高、中、低剂量组灌胃给于金线莲提取物20ml/kg,0.005g/ml、0.05g/ml、0.15g/ml,每天一次,连续28天。正常对照组及模型对照组灌胃等体积蒸馏水。末次给药后2h,给三组实验组及模型对照组的小鼠腹腔均注射D-Gal800mg/kg,正常对照组腹腔注射等体积的生理盐水。各组小鼠造模后禁食不禁水,造模20h后,小鼠麻醉后取血,1000g离心15min,取血清采用全自动生化分析仪进行ALT、AST、LDH活性的检测;迅速取出肝脏,称重,计算肝脏系数,肝脏系数=(肝脏质量/小鼠质量)×100%;
肝右叶福尔马林固定,用于病理组织学检测;肝左叶留作MDA、抑制羟自由基的能力的测定,其余肝脏-80℃冻存备用。
2.3抗氧化指标检测
将肝左叶用超声粉碎机粉碎,5秒/次间隙10秒反复4次,制成10%肝匀浆,按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行MDA含量的测定、抑制羟自由基的能力的测定。
2.4组织病理学检查
取部分肝组织福尔马林固定48h,自来水冲洗6h,改用70%酒精浸泡备用。使用自动脱水机脱水,石蜡包埋机包埋,制成组织蜡块,制备4微米厚的石蜡切片,55℃烤2小时。切片经二甲苯、梯度酒精脱蜡至水,苏木素染色3-5min,盐酸乙醇分化。再于碱水中返蓝20s,伊红染色10-20s。脱水,透明,中性树胶封固,制成染色切片,置于光镜下观察肝组织结构、细胞形态。
2.5统计学方法
实验数据用或表示,用SPSS20.0软件进行One-way ANOVA分析,并进行最小显著差法(LSD)两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。
3结果
3.1各组小鼠的体重、肝重和肝脏系数比较
与对照组相比,D-Gal模型组小鼠体重无明显异常(P>0.05),肝重和肝脏系数均显著增加(P<0.05)。与D-Gal模型组相比,金线莲低、中、高剂量组小鼠各指标均无明显差异(P>0.05)。具体结果见表1。
表1各组小鼠空腹体重、肝重和肝脏系数比较
注:与正常对照组比较,*P<0.05;与D-Gal模型组比较,#P<0.05。
3.2各组小鼠血清生化指标的比较
与对照组相比,模型组小鼠血清中ALT、AST及LDH活性均显著升高(P<0.05)。与模型组相比,金线莲中、高剂量组小鼠血清中LDH显著降低(P<0.05);金线莲高剂量组小鼠血清中ALT、AST显著降低(P<0.05)。具体结果见表2。
表2各组小鼠血清ALT、AST的比较
注:与正常对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与D-Gal模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。
3.3各组小鼠肝组织中抗氧化指标的比较
与正常对照组相比,模型组小鼠肝组织中MDA含量显著升高(P<0.01),抑制羟自由基的能力显著降低(P<0.01)。与模型组相比,金线莲中、高剂量组小鼠肝组织中MDA含量明显降低(P<0.05);金线莲低、中、高剂量组小鼠肝组织中抑制羟自由基的能力显著升高(P<0.01)。
表3各组小鼠肝组织中MDA、抑制羟自由基能力的比较
注:与正常对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与D-Gal模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。
3.4肝脏病理学改变
对照组小鼠肝脏色泽鲜红、表面光滑、边缘锐利、质地柔软;D-Gal模型组小鼠肝脏肿大,色泽晦暗,表面有均匀分布的斑点;与D-Gal模型组相比,金线莲高剂量组小鼠肝脏色泽更鲜红、体积缩小,肝脏表面无肉眼可见的斑点。具体结果见图1。
显微镜下显示,对照组小鼠肝细胞大小形态正常,排列成条索状,细胞质排列均匀,细胞核大而圆,核仁清晰,肝小叶结构完整规则,肝索成放射状排列整齐。D-Gal模型组小鼠肝细胞有明显气球样变,可见大面积肝细胞坏死,并伴有炎细胞浸润,肝索排列紊乱,肝小叶结构不规则。金线莲低剂量组小鼠肝细胞较D-Gal模型组无明显差异;金线莲中剂量组小鼠肝细胞较D-Gal模型组肝细胞坏死减少,炎细胞浸润减轻,肝索排列较整齐;金线莲高剂量组小鼠肝细胞较D-Gal模型组肝细胞坏死明显减少,炎细胞浸润减轻,肝索排列整齐,形态接近对照组。具体结果见图2。
应注意的是,以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明,但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.金线莲提取物作为有效成分在制备用于预防和/或治疗急性肝损伤的药物中的应用;
所述急性肝损伤为化学诱发型急性肝损伤,优选为D-氨基半乳糖诱发的急性肝损伤。
2.如权利要求1所述应用,其特征在于,所述应用为金线莲提取物作为唯一有效成分或有效成分之一在制备用于预防/或治疗急性肝损伤的药物中的应用。
3.如权利要求1所述应用,其特征在于,所述的金线莲提取物单次有效剂量为0.1~3g/kg.bw;
优选的,所述的金线莲提取物单次有效剂量包括0.1g/kg.bw,1g/kg.bw,3g/kg.bw。
4.权利要求1所述应用,其特征在于,所述金线莲提取物用水作为提取溶剂来获得。
5.权利要求4所述应用,其特征在于,所述金线莲提取物,其制备方法为:取金线莲鲜草全草,破碎后加4~8倍量(优选为6倍量)水,煮沸0.4~0.8h(优选0.5h),过滤,取滤液,残渣加等量水,煮沸0.4~0.8h(优选0.5h),重复2次,合并滤液浓缩至膏状即得。
6.金线莲提取物作为有效成分在制备缓解改善肝脏炎性细胞浸润、肝细胞气球样变、肝细胞脂肪样变和/或肝细胞坏死的药物中的应用。
7.金线莲提取物作为有效成分在制备改善肝小叶结构的药物中的应用;优选的,所述改善肝小叶结构的表现包括肝小叶结构趋于规则,肝索排列趋于整齐。
8.权利要求1-7任一项所述应用,其特征在于,金线莲提取物作为药物活性成分,制成药学上可接受的药物制剂;
优选地,所述药物制剂选自由用于口服施用的制剂、适用于粘膜的制剂、注射制剂、吸入制剂、和外用制剂组成的组;
优选的,所述用于口服施用的制剂选自由片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊组成的组。
9.一种用于预防和/或治疗急性肝损伤的药物组合物,其特征在于,以金线莲提取物作为有效成分。
10.如权利要求9所述药物组合物,其特征在于,所述药物组合物中,还包含药学上可接受的辅料,所述辅料为稀释剂、赋形剂、崩解剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、表面活化剂、稳定剂中的至少一种;
以及,所述药物组合物制备成药学上可接受的药物制剂;
优选地,所述药物制剂选自由用于口服施用的制剂、适用于粘膜的制剂、注射制剂、吸入制剂、和外用制剂组成的组;
优选的,所述用于口服施用的制剂选自由片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊组成的组。
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