CN109876088A - 一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂 - Google Patents
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Abstract
一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,属于中药研究技术领域。由重量百分含量的以下物质组成:大黄总蒽醌苷提取纯化物30%‑50%,蜜茱萸总黄酮提取纯化物10%‑20%,鬼灯檠多酚提取纯化物15%‑25%,姜栀子提取物20%‑30%。上述一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,其产品配方合理、绿色环保、安全性好、适合长期服用;通过各组分成分相互作用的协同增进,能够起到很好的保护肠道菌群与治疗II型糖尿病的作用;该特殊组成使得产品降糖降脂的功效显著,服用方便。
Description
技术领域
本发明属于中药研究技术领域,具体为一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus)是一种以慢性血糖水平增高为特征,由于胰岛素缺陷所引起的慢性代谢性疾病。糖尿病可引发诸多并发症,严重影响患者的生活质量和寿命,由于病因的复杂性,目前现代医学手段无法将其完全攻克,仍是一种终身性疾病。在当前中国糖尿病的临床治疗中,传统医学手段特别是利用天然产物治疗糖尿病发挥了重要作用。近年来,随着社会经济的发展,生活方式的转变,糖尿病的发病率显著增加,且发病患者中90%以上为II型糖尿病。糖尿病是由胰岛素抵分泌相对不足或绝对不足导致的,以血糖水平持续增高为主要特征的慢性代谢性疾病,继发脂质和蛋白质代谢紊乱。糖尿病的发病受包括遗传及环境等因素综合作用,迄今病因及发病机制尚未完全阐明。目前,临床治疗糖尿病的口服降糖药包括双胍类、-葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂、磺酰脲类、苯甲酸类衍生物等,另有胰岛素、免疫抑制剂等。西药虽控制血糖效果明显,但通常缺乏整体疗效,不利于长期使用,且具有明显的毒副作用。近年来,天然产物用于糖尿病的治疗具有多途径、多环节、多靶点的治疗特点,逐渐趋于研究热点。
肠道菌群是人体肠道的正常微生物,如双歧杆菌,乳酸杆菌等能合成多种人体生长发育必须的维生素等,还能利用蛋白质残渣合成必需氨基酸,并参与糖类和蛋白质的代谢,同时还能促进矿物元素的吸收。这些营养物质对人类的健康有着重要作用,一旦缺少会引起多种疾病。人体肠道内寄生着10万亿个细菌,它们能影响体重和消化能力、抵御感染和自体免疫疾病的患病风险。
人体的健康与肠道内的益生菌群结构息息相关。肠道菌群在长期的进化过程中,通过个体的适应和自然选择,菌群中不同种类之间,菌群与宿主之间,菌群、宿主与环境之间,始终处于动态平衡状态中,形成一个互相依存,相互制约的系统,因此,人体在正常情况下,菌群结构相对稳定,对宿主表现为不致病。如果肠内有益菌菌群占优,肠内黏膜呈现粉红色,表示肠内环境相当良好,且表现为容易吸收水分,粪便较易排泄,能迅速排出有害物质,避免病原菌的侵害。如果肠道内有害菌占优势,表现为肠内黏膜粗糙,血液不流通而呈暗红色。肠道蠕动太慢,排泄不顺畅,肠内囤积粪便,产生有害物质,再次地吸收对身体有害的物质,因坏菌所产生的有害物质使肠壁所具有的免疫功能下降,导致肠内杀菌作用变弱,细菌或病原菌更容易侵入。人类与微生物之间的动态平衡称为微生态平衡,影响其微生态平衡的因素有外环境因素,也有宿主因素。外环境主要是通过改变宿主的生理功能产生的,如有益菌菌群,通过产生细菌素,抗生素和其代谢产物,以及争夺营养,空间争夺以阻止过路菌群入侵,保持自身的稳定性。生态平衡时,可以保持宿主的正常生理功能,如营养、免疫、消化等。生态失调可因慢性病,癌症,手术,辐射感染,抗生素不合理应用等引起。
大黄为蓼科大黄属多年生植物,记载于《神农本草经》:“下淤血,血闭寒热,破癥瘕积聚,留饮宿食,荡涤肠胃,推陈致新,通利水谷,调中化食,安和五脏。”另《本草纲目》有载:“下痢赤白,里急腹痛,小便淋沥,实热燥结,潮热谵语,黄疸,诸火疮。”是胃肠积滞症候的常用药。大黄的药用部位为干燥根及根茎,主产于四川、陕西以及甘肃东南部等地,其药性苦、寒;归脾、胃、大肠、心包经。具有泻下攻积,清热泻火,凉血解毒,逐瘀通经等功效;常用于积滞便秘,血热目赤,热毒疮疡,湿热痢疾等症。大黄的主要化学成分包括蒽醌类、吡喃酮类、萘苷类、有机酸、多糖、鞣质等。其中蒽醌类成分是大黄中的主要有效成分,包括游离蒽醌和蒽醌苷。研究发现蒽醌类具有抗炎、抗肿瘤、保护心脑血管等广泛药理作用。大黄中的羟基蒽醌衍生物多与葡萄糖、鼠李糖结合成苷类,一般有单糖苷和双糖苷两类。
蜜茱萸为芸香科蜜茱萸属灌木或乔木,是海南岛特有的珍惜濒危植物。据文献报道,蜜茱萸中的化学成分主要含多酚类和黄酮类化合物,这类化合物具有抗诱变、抗肿瘤、抗病毒抗微生物、抗衰老、抗氧化等多方面显著的生物活性。目前对蜜茱萸属的黄酮类化合物的活性研究表明,该属黄酮有M胆碱受体阻断作用,抑制血小板聚集作用,抗病毒作用以及杀虫作用等。有研究报道,蜜茱萸中的两个黄酮化合物是4’,5-二羟基-3,3’,7,8-四甲氧基黄酮和3,5-二甲氧基-6,7;3’,4’-双亚甲二氧基黄酮所做的抗DNA和RNA病毒实验(选择的病毒包括脊髓灰质炎病毒、腺病毒、疙疹病毒HSVI和II型、VSV病毒)表明:这两个黄酮在相同的实验条件下,4’,5-二羟基-3,3’,7,8-四甲氧基黄酮对实验病毒所引起的细胞病理效应有抑制作用,但是3,5-二甲氧基-6,7;3’,4’-双亚甲二氧基黄酮却没有此作用。另有报道从蜜茱萸中分离出的三个黄酮和两个苯乙酮衍生物进行抗炎活性测试,表明5,4’-二羟基-3,7,3’-三甲氧基黄酮,5,4’-二羟基-3,7-二甲氧基黄酮和5-羟基-3,7,3’,4’-四甲氧基黄酮对人的弹性蛋白酶的释放以及嗜中性粒细胞所产生的超氧化物阴离子有较强的抑制作用。目前已报道的蜜茱萸中生物碱的活性主要是抗血小板聚集,细胞毒和抗真菌方面的活性。
鬼灯檠为虎耳草科鬼灯檠属植物,主要分布在我国陕西、甘肃、宁夏、河南、湖北、四川、云南及西藏等省区,为我国传统的民间中药,其根茎具有清热解毒、止血、止泻等功用,对菌痢、子宫脱垂、老年慢性支气管炎等常见病有较好的疗效,是一种优良的经济植物和观赏植物。鬼灯檠植物的根茎中含有岩白菜素、儿茶素类及多酚类成分,这类成分具有很好的抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗炎等作用。
栀子,别名黄栀子、山栀、白蟾,是茜草科植物栀子的果实。目前,栀子的果实是传统中药,属卫生部颁布的第l批药食两用资源,具有护肝、利胆、降压、镇静、止血、消肿等作用,临床常用于治疗黄疸型肝炎、扭挫伤、高血压、糖尿病等症。栀子中主要含黄酮类栀子素、果胶、鞣质、藏红花素、藏红花酸、D-甘露醇、廿九烷、β-谷甾醇等成分具有很好的抗炎、提高免疫力、抗疲劳和抗衰老的作用。另外栀子中含有的微量元素也具有很好的降压作用。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题,本发明的目的在于设计提供一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂的技术方案,其产品配方合理、绿色环保、安全性好、适合长期服用;通过各组分成分相互作用的协同增进,能够起到很好的保护肠道菌群与治疗II型糖尿病的作用;该特殊组成使得产品降糖降脂的功效显著,服用方便。
所述的一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,其特征在于由重量百分含量的以下物质组成:大黄总蒽醌苷提取纯化物30%-50%,蜜茱萸总黄酮提取纯化物10%-20%,鬼灯檠多酚提取纯化物15%-25%,姜栀子提取物20%-30%;
所述的大黄总蒽醌苷提取纯化物采用以下方法制备:取干燥粉碎后的大黄粗粉,采用料液比1:5-1:8的65%-80%的乙醇做溶剂回流提取2-3次,每次20-40分钟;抽滤,合并提取液,在50-60℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/8-1/12;将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别在50-60℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位;将正丁醇萃取部位通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱,合并40%乙醇和60%乙醇部位,在50-60℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到大黄总蒽醌苷提取纯化物;
所述的蜜茱萸总黄酮提取纯化物采用以下方法制备:取干燥粉碎后的蜜茱萸粗粉,采用料液比1:6-1:8的65%-75%的乙醇做溶剂进行超声提取2-3次,每次30-40分钟;合并提取液,在50-60℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/8-1/15;将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,在50-60℃条件下分别真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位;合并乙酸乙酯部位和正丁醇部位,通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、65%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱;合并50%乙醇和65%乙醇部位,在50-60℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到蜜茱萸总黄酮提取纯化物;
所述的鬼灯檠多酚提取纯化物采用以下方法制备:取干燥的鬼灯檠根茎,粉碎成粗粉,采用料液比1:8-1:10的70%丙酮做溶剂进行组织破碎提取1-3分钟,抽滤;滤液在40-50℃条件下闪蒸浓缩至原体积的1/10-1/14,采用Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱富集纯化,分别用去离子水、10%甲醇、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、70%丙酮进行梯度洗脱;合并20%甲醇和40%甲醇洗脱部位,在40-50℃条件下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩,结合旋蒸浓缩干燥,得到鬼灯檠多酚类提取纯化物;
所述的姜栀子提取物采用以下方法制备:取采用姜炙法得到的栀子饮片,采用65%-75%乙醇做溶剂进行超声提取2-3次,每次20-40分钟;合并提取液,在40-50℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/8-1/10;将提取浓缩液分别采用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,取乙酸乙酯部位,在40-50℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到姜栀子提取物。
所述的一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,其特征在于大黄总蒽醌苷提取纯化物35%-45%,蜜茱萸总黄酮提取纯化物12%-18%,鬼灯檠多酚提取纯化物18%-22%,姜栀子提取物22%-28%。
所述的一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,其特征在于所述的大黄总蒽醌苷提取纯化物采用以下方法制备:取干燥粉碎后的大黄粗粉,采用料液比1:6-1:7的70%-75%的乙醇做溶剂回流提取2-3次,每次25-35分钟;抽滤,合并提取液,在55-58℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/9-1/11;将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别在55-58℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位;将正丁醇萃取部位通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱,合并40%乙醇和60%乙醇部位,在55-58℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到大黄总蒽醌苷提取纯化物。
所述的一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,其特征在于所述的蜜茱萸总黄酮提取纯化物采用以下方法制备:取干燥粉碎后的蜜茱萸粗粉,采用料液比1:7的70%-72%的乙醇做溶剂进行超声提取2-3次,每次35-38分钟;合并提取液,在55-58℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/10-1/12;将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,在55-58℃条件下分别真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位。合并乙酸乙酯部位和正丁醇部位,通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、65%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱;合并50%乙醇和65%乙醇部位,在50-60℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到蜜茱萸总黄酮提取纯化物。
所述的一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,其特征在于所述的鬼灯檠多酚提取纯化物采用以下方法制备:取干燥的鬼灯檠根茎,粉碎成粗粉,采用料液比1:9的70%丙酮做溶剂进行组织破碎提取2分钟,抽滤;滤液在40-50℃条件下闪蒸浓缩至原体积的1/12-1/13,采用Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱富集纯化,分别用去离子水、10%甲醇、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、70%丙酮进行梯度洗脱;合并20%甲醇和40%甲醇洗脱部位,在45-48℃条件下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩,结合旋蒸浓缩干燥,得到鬼灯檠多酚类提取纯化物。
所述的一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,其特征在于所述的姜栀子提取物采用以下方法制备:取采用姜炙法得到的栀子饮片,采用70%-72%乙醇做溶剂进行超声提取3次,每次25-35分钟;合并提取液,在45-48℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/9;将提取浓缩液分别采用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,取乙酸乙酯部位,在45-48℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到姜栀子提取物。
上述一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,功效成分纯度高、品质好,降糖降脂功效显著。与现有技术相比,本发明具有如下特点:
1.本发明中对鬼灯檠根茎采用70%丙酮进行组织破碎提取。该溶剂对植物组织具有很强的穿透力和溶解能力,能在短时间内快速将植物组织中的多酚类成分转溶于溶剂中。破碎提取是利用高速旋转的特殊刀具将原料打碎成匀浆状,通过粉碎、搅拌、混合、均质化等,将粉碎和提取过程同时完成,特别适合对丹宁及多酚类极其不耐热成分的提取。具有提取速度快、完全,一次提取只需几分钟;不加热,保护不耐热成分不受破坏,节省时间、溶剂和能源等突出的优势。该提取方法能最大限度的将多酚类功效成分提取完全,并能将多酚类成分稳定的转溶在溶剂中,保证了丹宁及多酚类成分的高提取率、高转移率和高保留率。
2.本发明对蜜茱萸和姜栀子采用室温超声提取,既能保证蜜茱萸黄酮及姜栀子有效部位高效提取率,又能确保在室温下提取,蜜茱萸中的黄酮及姜栀子中的色素类热敏性成分不受破坏。该提取方法能避免热回流提取可能带来的对功效成分的影响,对功效成分具有高提取率、高转移率和高保留率和高收得率的特点。
3.本发明中各种浓缩过程均采用闪蒸浓缩。该浓缩方法使药液的受热温度低、受热时间短,浓缩效率高。且能避免其他浓缩方法可能带来的对功效成分的破坏。
4.本发明的大黄蒽醌苷提取纯化物的制备是采用含水乙醇回流提取、闪蒸浓缩,用极性大小不同的溶剂梯度萃取、闪蒸浓缩,取某一萃取部位通过大孔吸附树脂富集纯化、用一定比例的含水乙醇进行梯度洗脱,合并一定的洗脱部位、闪蒸浓缩等特殊的提取纯化工艺制成的有效部位。本发明的蜜茱萸总黄酮提取纯化物的制备是采用一定比例的含水乙醇超声提取、闪蒸浓缩,用极性大小不同的溶剂梯度萃取、闪蒸浓缩,取某一萃取部位通过大孔吸附树脂富集纯化、用含水乙醇进行梯度洗脱,合并一定的洗脱部位、闪蒸浓缩等特殊的提取纯化工艺制成的有效部位。鬼灯檠多酚提取纯化物的制备是采用一定比例的含水丙酮组织破碎提取、闪蒸浓缩,通过大孔吸附树脂富集纯化、采用含水甲醇进行梯度洗脱,合并一定的洗脱部位、闪蒸浓缩等更为特殊的提取纯化工艺制成的有效部位。姜栀子提取物是采用含水乙醇超声提取、闪蒸浓缩,用极性大小不同的溶剂梯度萃取、闪蒸浓缩,对某一萃取部位进行闪蒸浓缩等特殊的提取纯化工艺制成的有效部位。本发明在特点条件下使用的特有的提取、浓缩、富集纯化工艺及参数,才能获得高含量且具有特殊功效成分的各制备物。
5.本发明采用大黄总蒽醌苷提取纯化物,蜜茱萸总黄酮提取纯化物,鬼灯檠多酚提取纯化物,姜栀子提取物按照特殊比例配伍制成的降糖制剂,具有特殊的功效。
6.本发明提供的产品配方合理、绿色环保,性味缓和,安全性好,适合长期服用。通过各组分成分相互作用的协同增进,整体治疗功效显著。通过明显改善肠道菌群的多样性和丰富度,提升肠道有益菌群的丰度,起到很好的保护肠道菌群和治疗二型糖尿病的作用,对二型糖尿病大鼠具有显著的降糖降脂作用。
附图说明
图1为本发明实施例1对T2DM大鼠血清中TC的影响图;
图2为本发明实施例1对T2DM大鼠血清中TG的影响图;
图3为本发明实施例1对T2DM大鼠血清中T-SOD的影响图;
图4为本发明实施例1对T2DM大鼠血清中GSH-PX的影响图;
图5为本发明实施例1对T2DM大鼠肝脏组织病变的影响图;
图6为本发明实施例1对T2DM大鼠肾脏组织病变的影响图;
图7为本发明实施例1对T2DM大鼠胰腺组织病变的影响图;
图8为本发明实施例1对T2DM大鼠胰腺中相关蛋白的表达图;
图9为本发明实施例1对T2DM大鼠回肠组织中相关蛋白的表达图;
图10为本发明实施例1对T2DM大鼠回肠组织病理学的影响图;
图11为本发明实施例1对大鼠回肠内容物属水平菌种Prevotella,Escherichia(普雷沃菌和埃希菌)相对丰度的影响;
图12为本发明实施例1对大鼠回肠内容物属水平菌种Ruminococcus,Lachnospira(瘤胃球菌和毛螺菌)相对丰度的影响;
图13为本发明实施例1对大鼠回肠内容物属水平菌种Phascolarctobacterium,Blautia(考拉杆菌和布劳特氏菌)相对丰度的影响;
图14为本发明实施例1对大鼠回肠内容物属水平菌种Faecalibacterium,Oscillospira(粪杆菌和颤螺旋菌)相对丰度的影响;
图15为本发明实施例1对大鼠回肠内容物属水平菌种Lactobacillus,Bacterioides(乳酸杆菌和拟杆菌)相对丰度的影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1.所述的大黄总蒽醌苷提取纯化物的制备方法如下:取干燥粉碎后的大黄粗粉,采用料液比1:5的65%的乙醇做溶剂回流提取2次,每次20分钟。抽滤,合并提取液,在60℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/8。将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别在60℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位。将正丁醇萃取部位通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱。合并40%乙醇和60%乙醇部位,在60℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到大黄总蒽醌苷提取纯化物。大黄总蒽醌苷提取纯化物的收率为16.1%,提取纯化物中总蒽醌苷的含量达到37.3%。
2.所述的蜜茱萸总黄酮提取纯化物的制备方法如下:取干燥粉碎后的蜜茱萸粗粉,采用料液比1:6的65%的乙醇做溶剂进行超声提取2次,每次30分钟。合并提取液,在60℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/10。将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,在60℃条件下分别真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位。合并乙酸乙酯部位和正丁醇部位,通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、65%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱。合并50%乙醇和65%乙醇部位,在60℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到蜜茱萸总黄酮提取纯化物。蜜茱萸总黄酮提取纯化物的收率为12.9%,提取纯化物中总黄酮的含量达到33.2%。
3.所述的鬼灯檠多酚提取纯化物的制备方法如下:取干燥的鬼灯檠根茎,粉碎成粗粉,采用料液比1:8的70%丙酮做溶剂进行组织破碎提取1分钟,抽滤。滤液在50℃条件下闪蒸浓缩至原体积的1/10,采用Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱富集纯化,分别用去离子水、10%甲醇、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、70%丙酮进行梯度洗脱。合并20%甲醇和40%甲醇洗脱部位,在50℃条件下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩,结合旋蒸浓缩干燥,得到鬼灯檠多酚类提取纯化物。得到的鬼灯檠多酚提取纯化物的收率为21.9%,提取纯化物中多酚类成分的含量达到25.4%。
4.所述的姜栀子提取物的制备方法如下:取采用姜炙法得到的栀子饮片,采用65%乙醇做溶剂进行超声提取2次,每次25分钟。合并提取液,在50℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/8。将提取浓缩液分别采用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。取乙酸乙酯部位,在50℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到姜栀子提取物。姜栀子提取物的收率为13.2%。
5.将大黄总蒽醌苷提取纯化物,蜜茱萸总黄酮提取纯化物,鬼灯檠多酚提取纯化物,姜栀子提取物按照重量百分比为大黄总蒽醌苷提取纯化物30%-50%,蜜茱萸总黄酮提取纯化物10%-20%,鬼灯檠多酚类提取纯化物15%-25%,姜栀子提取物20%-30%均匀混合,装入胶囊中,或定量包装成袋得到降糖制剂。
实施例2
1.所述的大黄总蒽醌苷提取纯化物的制备方法如下:取干燥粉碎后的大黄粗粉,采用料液比1:8的75%的乙醇做溶剂回流提取3次,每次40分钟。抽滤,合并提取液,在50℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/12。将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别在50℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位。将正丁醇萃取部位通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱。合并40%乙醇和60%乙醇部位,在50℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到大黄总蒽醌苷提取纯化物。大黄总蒽醌苷提取纯化物的收率为18.1%,提取纯化物中总蒽醌苷的含量达到42.2%。
2.所述的蜜茱萸总黄酮提取纯化物的制备方法如下:取干燥粉碎后的蜜茱萸粗粉,采用料液比1:8的75%的乙醇做溶剂进行超声提取3次,每次40分钟。合并提取液,在50℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/12。将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,在50℃条件下分别真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位。合并乙酸乙酯部位和正丁醇部位,通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、65%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱。合并50%乙醇和65%乙醇部位,在50℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到蜜茱萸总黄酮提取纯化物。蜜茱萸总黄酮提取纯化物的收率为15.6%,提取纯化物中总黄酮的含量达到36.8%。
3.所述的鬼灯檠多酚提取纯化物的制备方法如下:取干燥的鬼灯檠根茎,粉碎成粗粉,采用料液比1:10的70%丙酮做溶剂进行组织破碎提取3分钟,抽滤。滤液在40℃条件下闪蒸浓缩至原体积的1/12,采用Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱富集纯化,分别用去离子水、10%甲醇、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、70%丙酮进行梯度洗脱。合并20%甲醇和40%甲醇洗脱部位,在40℃条件下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩,结合旋蒸浓缩干燥,得到鬼灯檠多酚类提取纯化物。得到的鬼灯檠多酚提取纯化物的收率为25.3%,提取纯化物中多酚类成分的含量达到28.1%。
4.所述的姜栀子提取物的制备方法如下:取采用姜炙法得到的栀子饮片,采用65%乙醇做溶剂进行超声提取3次,每次40分钟。合并提取液,在40℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/10。将提取浓缩液分别采用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。取乙酸乙酯部位,在40℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到姜栀子提取物。姜栀子提取物的收率为17.6%。
5.将大黄总蒽醌苷提取纯化物,蜜茱萸总黄酮提取纯化物,鬼灯檠多酚提取纯化物,姜栀子提取物按照重量百分比为大黄总蒽醌苷提取纯化物30%-50%,蜜茱萸总黄酮提取纯化物10%-20%,鬼灯檠多酚类提取纯化物15%-25%,姜栀子提取物20%-30%均匀混合,装入胶囊中,或定量包装成袋得到降糖制剂。
实施例3
1.所述的大黄总蒽醌苷提取纯化物的制备方法如下:取干燥粉碎后的大黄粗粉,采用料液比1:6的75%%的乙醇做溶剂回流提取2次,每次30分钟。抽滤,合并提取液,在55℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/10。将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别在55℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位。将正丁醇萃取部位通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱。合并40%乙醇和60%乙醇部位,在55℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到大黄总蒽醌苷提取纯化物。大黄总蒽醌苷提取纯化物的收率为16.7%,提取纯化物中总蒽醌苷的含量达到39.1%。
2.所述的蜜茱萸总黄酮提取纯化物的制备方法如下:取干燥粉碎后的蜜茱萸粗粉,采用料液比1:7的70%的乙醇做溶剂进行超声提取3次,每次30分钟。合并提取液,在55℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/10。将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,在55℃条件下分别真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位。合并乙酸乙酯部位和正丁醇部位,通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、65%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱。合并50%乙醇和65%乙醇部位,在55℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到蜜茱萸总黄酮提取纯化物。蜜茱萸总黄酮提取纯化物的收率为14.6%,提取纯化物中总黄酮的含量达到35.3%。
3.所述的鬼灯檠多酚提取纯化物的制备方法如下:取干燥的鬼灯檠根茎,粉碎成粗粉,采用料液比1:9的70%丙酮做溶剂进行组织破碎提取2分钟,抽滤。滤液在45℃条件下闪蒸浓缩至原体积的1/12,采用Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱富集纯化,分别用去离子水、10%甲醇、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、70%丙酮进行梯度洗脱。合并20%甲醇和40%甲醇洗脱部位,在45℃条件下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩,结合旋蒸浓缩干燥,得到鬼灯檠多酚类提取纯化物。得到的鬼灯檠多酚提取纯化物的收率为23.5%,提取纯化物中多酚类成分的含量达到26.1%。
4.所述的姜栀子提取物的制备方法如下:取采用姜炙法得到的栀子饮片,采用70%乙醇做溶剂进行超声提取2次,每次30分钟。合并提取液,在45℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/9。将提取浓缩液分别采用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。取乙酸乙酯部位,在45℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到姜栀子提取物。姜栀子提取物的收率为15.8%。
5.将大黄总蒽醌苷提取纯化物,蜜茱萸总黄酮提取纯化物,鬼灯檠多酚提取纯化物,姜栀子提取物按照重量百分比为大黄总蒽醌苷提取纯化物30%-50%,蜜茱萸总黄酮提取纯化物10%-20%,鬼灯檠多酚类提取纯化物15%-25%,姜栀子提取物20%-30%均匀混合,装入胶囊中,或定量包装成袋得到降糖制剂。
以下再结合相应的试验进一步说明本发明的有益效果。
1.大黄总蒽醌苷提取纯化物中总蒽醌苷的含量测定
(1)标准曲线的绘制:将一定量的大黄素对照品用1%Mg(CH3COO)2·4H2O-甲醇溶液溶解并定容至25mL。分别取0.05,0.10,0.20,0.40,0.80,1.60,2.40mL大黄素标准品溶液置于25mL容量瓶中,加适量1%Mg(CH3COO)2·4H2O-甲醇溶液定容至刻度。以1%Mg(CH3COO)2·4H2O-甲醇溶液为空白对照,在513nm处测定吸收度。以大黄素吸收值(Y)对样品浓度(X)进行线性回归,得大黄素的标准曲线方程:y=0.589x+1.329,R2=0.999,表明浓度在0.903-43.054μg/mL范围内呈现良好的线性关系。
(2)样品中总蒽醌苷的含量测定:称取待测样品,按照1:9的比例加入蒸馏水超声15分钟,配制成供试品母液。准确量取供试品母液10mL与CHCl310mL一同置于具塞锥形瓶中,超声处理15分钟,置分液漏斗中,分取出水层;再用20mLCHCl3分两次萃取,留取水层。合并水层并加10mL 8%HCl溶液和10mLCHCl3超声处理15分钟,置分液漏斗中,用少量CHCl3洗涤容器,并入分液漏斗中,分取CHCl3层,酸液再用CHCl3提取3次,每次10mL,合并CHCl3液,减压回收溶剂至干,残渣加10mL 1%Mg(CH3COO)2·4H2O-甲醇溶液溶解并定容,作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液1mL,以1%Mg(CH3COO)2·4H2O-甲醇溶液为空白,采用UV-Vis法在波长513nm处测定吸收值(A),重复测量3次。通过大黄素标准品回归方程,计算样品中总蒽醌苷的含量。结果大黄蒽醌苷提取纯化物中总蒽醌苷的含量为41.3%。
2.大黄蒽醌苷提取纯化物中3个蒽醌苷成分的含量测定
(1)试验材料与对照品:试验材料为大黄蒽醌苷提取纯化物。对照品:大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷均为HPLC色谱纯,含量≥98%。
(2)对照品溶液及供试品溶液的制备:取适量DMSO和甲醇配成含DMSO 20%的溶剂,超声15min后过0.22μm微孔膜得溶剂A。分别精密称取一定量的大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷,分别用甲醇溶解并定容于2mL容量瓶中,超声15min后过0.22μm微孔膜分别得到大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷的储备液。精密称取大黄蒽醌苷提取纯化物,用甲醇溶解并定容于2mL容量瓶中,超声15min后过0.22μm微孔膜分别得到各供试品溶液。
(3)色谱条件及线性关系:色谱柱为Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm,5μm)。柱温:30℃。流速:1.0mL/min。检测波长:280nm,VWD。流动相:0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)。进样量5μL。取3种标准品溶液200μL于1mL容量瓶中,精密吸取400μL溶剂A于容量瓶中,超声5min,得混合标准品液。按照色谱条件,对混标液进行分析。以标准品浓度(mg/ml)为横坐标,对应峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线。大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的回归方程y=14932x+1.496,R2=0.999,芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的回归方程y=96120x+1.555,R2=0.999、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷的回归方程y=26804x-1.231,R2=0.999,表明3个蒽醌苷浓度在0.0020-0.5200mg/mL之间线性关系良好。
(4)精密度和稳定性试验:取一定浓度的混标液,按照色谱条件连续进样6次,分别记录3种化合物的峰面积值,计算大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷对应色谱峰峰面积的RSD值,结果分别为1.18%、1.52%、2.06%,表明仪器精密度良好。取供试品溶液,室温放置,分别于0,1,2,4,8,12h,按照色谱条件进行进样分析。样品中大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷对应色谱峰峰面积的RSD值分别为2.30%、1.26%、1.20%,结果表明样品在12小时内稳定。
(5)含量测定:平行取样品3份,按色谱条件进样分析,每份样品进样测量3次,取平均值。计算3种成分的含量。测定结果大黄蒽醌苷提取纯化物中大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量分别为2.34%、1.93%和2.31%,对应的RSD值分别为1.89%、1.74%和2.03%。
3.实施例1降血糖动物实验
(1)动物、药品与试剂盒及饲料:SPF级SD雄性大鼠,体重(150±10)g。环境温度23-24℃,湿度50%-60%,12/12h昼夜规律饲养。四氧嘧啶,盐酸二甲双胍片,葡萄糖,猪油,胆固醇,蛋黄粉,胆酸盐,丙硫氧嘧啶,吐温-80。葡萄糖,葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法,超氧化物气化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),糖化血清蛋白(GSP),甘油三酯(TG),总胆固醇(T-CHO)试剂盒。
(2)实验仪器:RV8旋转蒸发仪;Infinite M200酶标仪;UV-2102PCS紫外可见分光光度计;KQ-250B超声波清洗器;HH-2数显恒温水浴锅;LG10-2.4A高速离心机;AP280-2包埋机;HM335E半自动石蜡切片机;KD-P组织摊片机;DGX-9003B烤箱;10212432C载玻片及盖玻片;ST5010莱卡染色机;NIKON ECLIPSE TI-SR导致荧光显微镜;NIKON DS-U3成像系统;DYY-6C电泳仪。
(3)动物模型建立与给药:将实施例1配制成低、中、高剂量的浓度分别为100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg。采用高脂乳剂灌胃和四氧嘧啶注射联合法建立II型糖尿病模型。动物适应性饲养一周后,按2ml/(kg·d)的剂量灌胃高脂乳剂,连续灌胃2周。高脂乳剂灌胃期间,造模大鼠禁食12h后,按50mg/kg的剂量腹腔注射新配制的四氧嘧啶生理盐水溶液(10mg/mL),每3天注射一次,共注射3次。并在每次注射四氧嘧啶6h后,补充5%的葡萄糖溶液12h,其后更换为普通水。2周后,对造模大鼠禁食8h(不禁水),眼眶取血,使用试剂盒检测其空腹血糖。若血糖值≥11.1mmol/L,即认为II型糖尿病模型建立成功,留作后续降糖实验。根据空腹血糖和体重对成模大鼠随机分组,分为正常空白组(NC),II型糖尿病模型组(T2DM)、二甲双胍对照组(MET)、药物治疗组(实施例1)低(LOW)、中(MID)、高(HIG)剂量组。用等体积生理盐水对正常组(NC)和T2DM组大鼠灌胃。MET组二甲双胍100mg/kg,LOW、MID和HIG药物组的剂量分别为100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg,连续6周灌胃给药。
(4)动物处理及样本留取:连续给药四周。每周眼眶取血测定空腹血糖一次。末次给药后空腹12小时,10%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,离心取血清后,按照试剂盒说明书测定血清中葡萄糖(Glu)水平、糖化血清蛋白(GSP)水平、超氧化物歧化酶(SOD)水平、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平、甘油三酯(TG)水平和总胆固醇(T-CHO)水平。并迅速取出肝脏、肾脏、胰腺、回肠组织,生理盐水分别洗净,固定于10%甲醛溶液中。用苏木精和伊红染色法(H&E)染色,并在光学显微镜下(BX20,Olympus,Tokyo,Japan)观察组织的病理变化。
(5)实施例1(药物治疗组)对血糖及相关血清指标的影响:多饮,多尿,多食,体重减轻和血糖升高是糖尿病最典型的症状。经过诱导后的大鼠体重明显减少,而血糖升高。经过6周的药物治疗组后其体重和血糖得到恢复。给药6周后二甲双胍组和药物治疗组的大鼠体重显著高于模型组,且具有显著性差异,而空腹血糖值显著低于模型组,并且呈剂量依赖性。
(6)实施例1(药物治疗组)对II型糖尿病大鼠血清指标的影响:糖代谢和脂代谢之间密有不可分的联系,同时机体高血糖也会导致血脂异常。另一方面,血脂代谢异常被认为是糖尿病及其各种并发症发生的主要危险因素。TG和TC已被证明可直接拮抗胰岛素信号,被认为是胰岛素抵抗的主要原因。TG持续高水平时导致胰岛素抵抗和损害β-cell功能。TC是血液中所有的脂蛋白含有的胆固醇之和,与糖尿病、心脑血管疾病、神经病变、心脑血管疾病等多种并发症密切相关。因此改善机体的血脂代谢,能够在一定程度上改善糖尿病。如图1所示,相比于空白组,模型组的TC和TG显著(P<0.01)增高,而相比于模型组,经过二甲双胍组和药物治疗组治疗6周后的各组大鼠的TC和TG明显降低,并且呈一定的剂量依赖性。高血糖可以诱导氧化应激水平的增加和脂质过氧化的产生,而氧化应激可以从不同的途径调节胰岛素的分泌,加快糖尿病的发展,因此降低机体的氧化应激状态对糖尿病的治疗有一定的作用。血清SOD和GSH-PX是机体抗氧化系统中两种重要的酶,可以反映机体的抗氧化能力。通过测定大鼠血清中的SOD和GSH-PX发现,T2DM组大鼠SOD和GSH-PX均明显低于空白组,且具有显著性差异(P<0.01)),而二甲双胍组和药物治疗组与T2DM相比均明显升高,其中中剂量组和高剂量均达到显著性差异(见图1-4)。
(7)实施例1(药物治疗组)对大鼠肝、肾、胰腺组织病变的影响:高血糖不仅会影响胰岛细胞凋亡信号的转导,也会损害组织和器官。肝脏作为主要代谢器官的靶点之一,是糖尿病损伤的主要器官。肝脏损伤主要表现为脂肪变性、炎性细胞浸润、细胞坏死等。如图5-7中的大鼠肝组织显微观察结果可以看出,空白组大鼠的肝组织结构完整,肝细胞以中央静脉为中心向四周呈放射状排列,与空白组相比,模型组大鼠肝肝细胞减少,肝细胞有明显的坏死,变性,并且有炎症细胞的浸润。与T2DM组相比,二甲双胍组和药物治疗组的病理改变均得到不同程度的改善。
体内SOD,GSH-PX减少,脂质过氧化物和自由基增多等均会促进细胞内的肾组织转化生长因子(TGF-β1)的表达增加。而TGF-β1可以抑制细胞增殖,促使肾脏细胞肥大,导致肾小球硬化及肾间质纤维化。从图5-7中大鼠的肾组织显微观察结果可以看出,空白组的肾组织结构清晰,肾小球结构正常,与空白组相比,T2DM组官腔扩张,肾小球体积增大,基膜增厚,而二甲双胍组和药物治疗组与模型组相比,肾小球体积减小,系膜基质轻度增生,病理组织有明显的改善。
2型糖尿病患者除了持续的高血糖之外,还伴有高血脂。长期接触高浓度的糖或者脂质后,胰岛细胞会发生功能障碍且胰岛结构会发生病变。从图5-7中大鼠的胰腺组织显微观察结果可以看出,空白组大鼠胰岛形态完整,胰岛内细胞数目较多且排列均一,与空白组相比,模型组大鼠胰岛发生明显的变形且胰岛内细胞数目减少,边界模糊,结构不清。与模型组相比,各药物治疗组的胰岛组织病理改变都有不同程度的改善。
4、实施例1对大鼠胰腺Fasl、Cyto-C、caspase-3蛋白表达的影响
在正常的生理状态下,胰腺中胰岛β-cell的数量受细胞凋亡、胰岛增生和分泌管形成的新的胰岛素的调节作用而处在动态平衡状态,但是当β-cell过度凋亡时就会发展成为糖尿病。在细胞凋亡中主要包括两种途径,内源性(线粒体驱动)和外源性(受体介导)细胞凋亡途径。细胞凋亡过程伴随着线粒体功能和结构的改变,而线粒体功能紊乱会使得胰腺β细胞的功能异常。此外,线粒体结构改变会导致Cyto-C的泄露,作为线粒体损伤的标志物,Cyto-C可以反映线粒体结构破坏的程度。如图8所示,用药物治疗组物介入给药后的大鼠胰腺组织中的Cyto-C和caspase-3的表达相比于模型组均明显减少,这与血清中SOD和GSH-PX的测定结果相对应,说明药物治疗组能够提高机体的抗氧化能力,降低机体的氧化应激水平,从而调节线粒体诱导的细胞死亡途径,保护胰腺β-cell,抑制β-cell凋亡并改善胰岛素抵抗。高浓度的糖会促进胰腺组织中Fas和FasL的表达。而Fas是诱导死亡的重要配体,它是一种外源性死亡途径的信号因子,当它与死亡受体FasL结合时,就会在数秒内诱导一系列诱导死亡信号复合物(DISC)的蛋白质的组装,这些蛋白质随后激活caspase级联反应顶端的procaspase-8而形成caspase-8,导致caspase的级联反应从而诱导caspase-3的激活。caspase级联反应激活后会以非常快速的方式诱导细胞凋亡。蛋白免疫印迹的测定结果中显示,四氧嘧啶联合高脂乳剂建立糖尿病模型后,T2DM组Fasl、Cyto-C和caspase-3蛋白表达明显增加,而予以不同浓度的药物治疗组干预6周后,FasL、Cyto-C和caspase-3的蛋白表达相比模型组明显减少,这说明胰腺组织中的死亡受体减少,由此提示实施例1(药物治疗组)可能是通过调节Fas/FasL介导的细胞凋亡通路,抑制细胞的凋亡而发挥降糖作用。
5.实施例1通过肠道菌群调节发挥降糖降脂作用的作用机制
在人体肠道中有高达39万亿个微生物,其中以细菌为主,大部分细菌在肠道内与人体营养共生生活,不仅可以帮助人体消化吸收、给人体提供能量与营养物质,而且还可以促进短链脂肪酸、胆汁酸分泌、构建免疫体系以防御病原体入侵。但也有一些致病菌的生长处于抑制状态,一旦肠道微生态失调,它们就会快速繁殖从而引起各种慢性疾病,如肠炎、肥胖、II型糖尿病、心血管疾病、老年痴呆症等多种疾病。
(1)降糖动物实验及测序分析:构建II型糖尿病模型,分组,喂药,处死,取血清和盲肠组织方法同前。同时留取回肠内容物。回肠内容物处理:回肠内容物总基因组提取采用基因组DNA快速抽提试剂盒,按照操作方法进行提取。对提取的大鼠回肠内容物总基因组进行16s测序及生物信息学分析,包括对总基因组样本进行质量检测,对通过质检的样品进行文库构建和文库质量检测,使用IlluminaMiSeq平台进行测序,针对高通量测序所得数据进行数据处理,针对高通量测序所得数据进行生物信息学分析。
(2)实施例1(药物治疗组)对肠道紧密连接蛋白的影响:长期的高脂饮食会使得脂质在肠上皮间隙过度堆积,改变包括肠道菌群在内的肠道微环境,进而破坏肠道紧密连接蛋白结构,使肠道屏障功能受损,肠道通透性增加。紧密连接蛋白是维持肠道黏膜屏障正常功能的重要因素,不仅是肠上皮机械屏障的最重要的结构基础,也是调节细胞胖物质转运的限速步骤。TJ的主要功能是维持肠上皮细胞的极性和调节肠道屏障的通透性,减少大分子和微生物透过肠壁进入内环境。在II型糖尿病、肥胖等代谢性疾病中,脂多糖的增多与肠粘膜屏障功能的损伤和肠道通透性的增加直接相关,与紧密连接蛋白的表达减少呈相关性。紧密连接蛋白受损与随高脂饮食摄入的大量脂肪有关,其乳糜微粒堆积在肠道细胞间,导致肠上皮细胞间压力增大,致使基膜断裂。另一方面,过量脂肪乳糜堆积触发肠道局部炎症,激活肠上皮细胞间肌球蛋白轻链磷酸化通路,打开肠道紧密连接。同时炎症使得肠上皮细胞坏死,直接导致紧密连接蛋白的表达减少,使得脂多糖通过肠道进入体循环。因此,减缓肠道炎症、减少肠道紧密连接的损伤,可有效改善肠道黏膜功能,降低肠道通透性,缓解糖尿病、肥胖等代谢性疾病。
从图9中可以看出,T2DM组大鼠中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达极少,表明经过四氧嘧啶联合高脂乳剂造模后,大鼠肠道紧密连接结构严重受损。经过6周药物组治疗干预后,大鼠ZO-1蛋白表达有所增加,尤其是中、高剂量组增加明显;Occludin蛋白表达亦有增加。表明实施例1对糖尿病大鼠受损的肠道紧密连接结构有一定的修复作用,也表明药物治疗组可通过调节II型糖尿病大鼠的肠道菌群而减少脂多糖的释放,减轻肠道炎症,减缓肠道紧密连接的损伤,从而参与到改善II型糖尿病的代谢紊乱中。
(3)实施例1(药物治疗组)对糖尿病大鼠回肠病理学的影响:正常大鼠回肠肠道上皮绒毛排列整齐致密,黏膜上皮完整厚实,杯状细胞、炎性细胞较少。经高脂乳剂和四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠回肠绒毛断裂稀疏,间隙宽松,有大量杯状细胞及空泡,炎症细胞浸润明显,黏膜肌层受损严重。二甲双胍对照组绒毛形态已有很好恢复,长度增加,排列间隙变小。经实施例1的药物治疗组干预6周治疗后,相对于正常空白组,药物治疗组(特别是中,高剂量组)绒毛排列趋于紧密,长度也有很好恢复,肠粘膜基层损伤较小,上皮完整(见图10)。
(4)实施例1(药物治疗组)对模型组大鼠肠道菌群的多样性分析:通过留取经过不同饲喂处理的大鼠回肠内容物,提取菌群总DNA后,利用MiSeq平台对16s rDNA的高变区进行测序,对Reads拼接过滤,再进行OUTs聚类,以及物种注释和丰度分析,揭示样品物种构成。根据α多样性(Alpha diversity)指数分析,ACE指数和Chao1指数表示肠道菌群丰度变化,Shannon指数表示肠道菌群多样性变化,Simpson指数定量表示某个区域生物多样性变化。肠道菌群多样性越高,抵抗外界干扰的能力越强。当环境损害致某些菌种失活后,生态系统中功能相似的微生物可以补偿缺失物种的功能。ACE指数、Chao1指数和Shannon指数越大,Simpson指数越小,反映样品中物种越丰富。各组间ACE指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数如表1所示。由表1可知,模型组大鼠的肠道菌群相对丰度和多样性与空白对照组相比都显著下降,表明高脂乳剂联合四氧嘧啶造模对大鼠回肠内容物菌群有较大影响,使得肠道菌群的相对丰度和多样性大大降低。经二甲双胍和实施例1药物治疗后,模型组大鼠的肠道菌群丰度和多样性都升高了,但与模型组相比无统计学差异;而实施例1药物组的肠道菌群丰度和多样性都明显上升了,且药物剂量越高,Chao1和Shannon值与模型组相比差异性越显著(P<0.05),表明经过6周实施例1的药物干预后,糖尿病大鼠肠道菌群的相对丰度和多样性得到了很好的恢复。
表1样品中体现肠道菌群相对丰度和多样性变化的各指数
(5)实施例1(药物治疗组)对T2DM大鼠肠道菌群门类及种属的物种丰富度(相对丰度)比较:细菌门类是硬壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Baceroidetes),这4种细菌的比例占到了所有肠道菌群的90%以上。其中硬壁菌门和放线菌门为革兰氏阳性菌,变形菌门和拟杆菌门为革兰氏阴性菌。因此,可以以变形菌门和拟杆菌门相对丰度之和与硬壁菌门和放线菌门相对丰度之和作为评价肠道菌群中革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌比值的指标,来观察各组间革兰氏阴性菌的比例是否发生变化。
属水平的菌群丰度变化:在属水平上选取丰度排前十的细菌,进行不同组别大鼠回肠内容物菌群种属差异的比较。丰度排名前十的菌群为Prevotella,Escherichia,Ruminococcus,Lachnospira,Phascolarctobacterium,Blautia,Faecalibacterium,Oscillospira,Lactobacillus,Bacterioides。各组间差异比较如下:Prevotella是革兰氏阴性菌,属拟杆菌门,T2DM模型组较NC空白组相对丰度增加,MET阳性组和各剂量给药组依剂量增加相对丰度降低,组间具有显著差异性。Escherichia是革兰氏阴性菌,属于变形菌门,T2DM模型组、MET阳性组及各剂量给药组较NC空白组的相对丰度均增加明显,组间具有显著差异性。Ruminococcus是革兰氏阳性菌,属于硬壁菌门,T2DM模型组、MET阳性组及各剂量给药组较NC空白组的相对丰度均降低明显,MET阳性组及各给药组较T2DM模型组无明显差异。Lachnospira是革兰氏阳性菌,属于硬壁菌门,T2DM模型组、MET阳性组及各剂量给药组较NC空白组的相对丰度均降低明显,组间具有显著性差异。Phascolarctobacterium是革兰氏阳性菌,属于硬壁菌门,T2DM模型组、MET阳性组及各剂量给药组较NC空白组的相对丰度均增加明显,具有统计学差异,但T2DM模型组、MET阳性组及各剂量给药组间无明显差异。
Blautia是革兰氏阳性菌,属于硬壁菌门,T2DM模型组相对丰度较NC空白组有一定增加,各给药组依剂量较T2DM模型组呈下降趋势,但差异不明显。Faecalibacterium是革兰氏阳性菌,属于硬壁菌门,T2DM模型组、MET阳性组及各剂量给药组较NC空白组的相对丰度均增加明显,组间具有极显著差异性。
scillospira是革兰氏阳性菌,属于硬壁菌门,各组间相对丰度具有统计学差异,T2DM模型组较N空白组降低明显;各给药组较T2DM模型组有一定的增加趋势,各组间相对丰度具有统计学差异。Lactobacillus是革兰氏阳性菌,属于硬壁菌门,在各组间统计学差异不明显。Bacterioides是革兰氏阴性菌,属于拟杆菌门,T2DM模型组的相对丰度较NC空白组增加明显,各给药组较T2DM模型组有一定的下降趋势,各组间具有统计学差异。见图11-15。
肠道菌群作为一个庞大的微生物群落,菌群丰度和菌种多样性维持一个相对稳定的状态才有利于其发挥积极作用,确保肠道功能正常。当四氧嘧啶联合高脂乳剂建立II型糖尿病模型后,ACE指数、Chao指数、Shannon指数和Simpson指数均出现不同程度的下降,表明糖尿病大鼠的菌群丰度和菌种多样性均有降低,肠道菌群发生紊乱。对糖尿病大鼠施以6周的药物治疗组干预后,ACE指数、Chao指数、Shannon指数和Simpson指数均有明显回升,各组间指数均有统计学差异(P<0.01),表明实施例1的药物能帮助糖尿病大鼠恢复肠道菌群的丰度和菌种多样性,使得肠道菌群恢复正常,达到平衡。
在门水平上,硬壁菌门、放线菌门、变形菌门和拟杆菌门4种细菌的比例占到了所有肠道菌群的90%以上,构成了肠道菌群的基础。肠道菌群能影响肠道功能的一个重要方式就是其中的革兰氏阴性菌代谢产生内毒素脂多糖,构成肠道局部炎症,并导致病变。正常稳态的肠道菌群维持着一定的革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的比值,当比值发生较大波动时,提示菌群的功能可能无法正常发挥。试验通过变形菌门和拟杆菌门相对丰度之和,与硬壁菌门和放线菌门相对丰度之和之比值作为G-和G+的比值,来评估肠道菌群的G-和G+的变化情况。试验结果表明,当II型糖尿病大鼠模型建立后,大鼠回肠内容物G-的比例有较大提升,提示此时大鼠肠道内的优势菌种已发生一定的改变。经过实施例1的药物治疗组的干预后,各剂量组比值有一定程度的下降,提示实施例1的药物通过调节肠道优势菌种比例发挥降糖作用。
在属水平上,在II型糖尿病大鼠模型建立后,Escherichia、Ruminococcus、Lachnospira、Faecalibacterium、Oscillospira、Bacterioides的相对丰度发生显著变化,表明其与糖尿病的发生具有一定的相关性。即在门水平以硬壁菌门和拟杆菌门为代表的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的差异主要来源于Lachnospira和Bacterioides。经过实施例1的药物治疗组干预后,以上各菌种均发生一定的变化,结果显示具有组间差异性,表明实施例1的药物对糖尿病大鼠的降糖作用与对这几种优势菌的干预有关。
II型糖尿病模型建立后,大鼠回肠组织病理切片发现,回肠绒毛稀疏断裂,间隙宽松,伴有大量杯状细胞及空泡,炎症细胞浸润明显,黏膜肌层受损严重;同时蛋白印迹试验显示大鼠回肠中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达极少,表明紧密连接结构受损。同期肠道菌群的检测结果中革兰氏阴性菌的比例上升。提示肠道功能受损与革兰氏阴性菌的增加有关。可能是G-的大量繁殖代谢产生脂多糖,在回肠形成局部炎症,炎性因子侵蚀回肠组织,致使肠道屏障功能受损。在实施例1的药物治疗组干预后,回肠组织病变有所好转,紧密连接蛋白表达增多,表明肠道的屏障功能得到恢复。由于肠道菌群紊乱会引起肠道屏障功能发生障碍,通透性增加,同时不同种类的细菌直接作用于肠道黏膜上的相关受体会引发能量物质代谢紊乱,而实施例1的药物治疗能通过对肠道菌群的调节而发挥降糖作用,其主要作用机制是通过调节肠道总群落的多样性以及优势菌种的相对丰度,尤其是革兰氏阴性菌,恢复肠道屏障功能,从而改善碳水化合物的代谢,达到降糖作用的。
以本发明实施例2-3进行上述试验,也能达到本发明所述的有益效果。最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,其特征在于由重量百分含量的以下物质组成:大黄总蒽醌苷提取纯化物30%-50%,蜜茱萸总黄酮提取纯化物10%-20%,鬼灯檠多酚提取纯化物15%-25%,姜栀子提取物20%-30%;
所述的大黄总蒽醌苷提取纯化物采用以下方法制备:取干燥粉碎后的大黄粗粉,采用料液比1:5-1:8的 65%-80%的乙醇做溶剂回流提取2-3次,每次20-40分钟;抽滤,合并提取液,在50-60℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/8-1/12;将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别在50-60℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位;将正丁醇萃取部位通过Diaion HP-20 大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱,合并40%乙醇和60%乙醇部位,在50-60℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到大黄总蒽醌苷提取纯化物;
所述的蜜茱萸总黄酮提取纯化物采用以下方法制备:取干燥粉碎后的蜜茱萸粗粉,采用料液比1:6-1:8的65%-75%的乙醇做溶剂进行超声提取2-3次,每次30-40分钟;合并提取液,在50-60℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/8-1/15;将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,在50-60℃条件下分别真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位;合并乙酸乙酯部位和正丁醇部位,通过Diaion HP-20 大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、65%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱;合并50%乙醇和65%乙醇部位,在50-60℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到蜜茱萸总黄酮提取纯化物;
所述的鬼灯檠多酚提取纯化物采用以下方法制备:取干燥的鬼灯檠根茎,粉碎成粗粉,采用料液比1:8-1:10的70%丙酮做溶剂进行组织破碎提取1-3分钟,抽滤;滤液在40-50℃条件下闪蒸浓缩至原体积的1/10-1/14,采用Diaion HP-20 大孔吸附树脂柱色谱富集纯化,分别用去离子水、10%甲醇、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、70%丙酮进行梯度洗脱;合并20%甲醇和40%甲醇洗脱部位,在40-50℃条件下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩,结合旋蒸浓缩干燥,得到鬼灯檠多酚类提取纯化物;
所述的姜栀子提取物采用以下方法制备:取采用姜炙法得到的栀子饮片,采用65%-75%乙醇做溶剂进行超声提取2-3次,每次20-40分钟;合并提取液,在40-50℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/8-1/10;将提取浓缩液分别采用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,取乙酸乙酯部位,在40-50℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到姜栀子提取物。
2.如权利要求1所述的一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,其特征在于大黄总蒽醌苷提取纯化物35%-45%,蜜茱萸总黄酮提取纯化物12%-18%,鬼灯檠多酚提取纯化物18%-22%,姜栀子提取物22%-28%。
3. 如权利要求1所述的一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,其特征在于所述的大黄总蒽醌苷提取纯化物采用以下方法制备:取干燥粉碎后的大黄粗粉,采用料液比1:6-1:7的 70%-75%的乙醇做溶剂回流提取2-3次,每次25-35分钟;抽滤,合并提取液,在55-58℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/9-1/11;将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别在55-58℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位;将正丁醇萃取部位通过Diaion HP-20 大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱,合并40%乙醇和60%乙醇部位,在55-58℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到大黄总蒽醌苷提取纯化物。
4.如权利要求1所述的一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,其特征在于所述的蜜茱萸总黄酮提取纯化物采用以下方法制备:取干燥粉碎后的蜜茱萸粗粉,采用料液比1:7的70%-72%的乙醇做溶剂进行超声提取2-3次,每次35-38分钟;合并提取液,在55-58℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/10-1/12;将提取浓缩液分别采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,在55-58℃条件下分别真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到各部位。
5.合并乙酸乙酯部位和正丁醇部位,通过Diaion HP-20 大孔吸附树脂柱色谱进行富集纯化,分别用去离子水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、65%乙醇、70%丙酮进行梯度洗脱;合并50%乙醇和65%乙醇部位,在50-60℃条件下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩干燥,得到蜜茱萸总黄酮提取纯化物。
6. 如权利要求1所述的一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,其特征在于所述的鬼灯檠多酚提取纯化物采用以下方法制备:取干燥的鬼灯檠根茎,粉碎成粗粉,采用料液比1:9的70%丙酮做溶剂进行组织破碎提取2分钟,抽滤;滤液在40-50℃条件下闪蒸浓缩至原体积的1/12-1/13,采用Diaion HP-20 大孔吸附树脂柱色谱富集纯化,分别用去离子水、10%甲醇、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、70%丙酮进行梯度洗脱;合并20%甲醇和40%甲醇洗脱部位,在45-48℃条件下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩,结合旋蒸浓缩干燥,得到鬼灯檠多酚类提取纯化物。
7.如权利要求1所述的一种通过调节肠道菌群平衡发挥降糖作用的天然降糖制剂,其特征在于所述的姜栀子提取物采用以下方法制备:取采用姜炙法得到的栀子饮片,采用70%-72%乙醇做溶剂进行超声提取3次,每次25-35分钟;合并提取液,在45-48℃条件下真空闪蒸浓缩至原体积的1/9;将提取浓缩液分别采用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,取乙酸乙酯部位,在45-48℃条件下真空闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到姜栀子提取物。
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