CN113209115A

CN113209115A - 一种用于治疗肝内胆汁淤积型肝损伤的药物

Info

Publication number: CN113209115A
Application number: CN202010068930.6A
Authority: CN
Inventors: 张勇慧; 黄建耿; 张鑫
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2021-08-06

Abstract

本应用发明属于医药技术领域，具体涉及治疗肝内胆汁淤积型肝损伤的药物，本发明通过构建α‑异硫氰酸萘酯(alpha‑naphthylisothiocyanate,ANIT)致大鼠胆汁淤积型肝损伤模型，考察金线莲苷对胆汁淤积型肝损伤的作用，发现金线莲苷能够有效缓解肝内胆汁淤积型肝损伤，在体内可调控胆汁酸相关转运体和代谢酶基因的表达、从而改善胆汁酸淤积对肝脏造成的损伤，能作为治疗胆汁淤积型肝损伤的药物。

Description

一种用于治疗肝内胆汁淤积型肝损伤的药物

技术领域

本应用发明属于医药技术领域，涉及治疗肝损伤的药物，具体涉及治疗肝内胆汁淤积型肝损伤的药物。

背景技术

胆汁淤积型肝损伤是由于胆汁酸在肝脏过度堆积所导致的肝脏病理生理过程，分为由胆汁分泌、排泄障碍引起的肝内胆汁淤积型肝损伤和胆管梗阻引起的肝外胆汁淤积型肝损伤(参考文献：O'Leary,J.G.,Pratt,D.S.Cholestasis and cholestaticsyndromes.Curr Opin Gastroenterol, May,2007,23(3):232-6.)。胆汁淤积可诱发肝细胞坏死和肝纤维化，并导致原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cholangitis,PBC)和原发性硬化性胆管炎(Primary Sclerosing Cholangitis, PSC)，进而导致肝衰竭。目前，临床上缺乏对胆汁淤积型肝损伤的有效治疗手段，仅有熊去氧胆酸(UrsodeoxycholicAcid,UDCA)和奥贝胆酸(Obeticholic Acid,OCA)可用于原发性胆汁性肝硬化(Primarybiliary cholangitis,PBC)的治疗，且UDCA存在对晚期PBC治疗效果不佳或对部分PBC患者存在耐受的现象，而OCA又是刚获得批准上市的药物，临床上的治疗效果及不良反应尚有待进一步观察(参考文献：Floreani,A.,Mangini,C.Primary biliary cholangitis:Old andnovel therapy.Eur J Intern Med,Jan,2018,47 1-5.Ghonem,N.S.,Assis,D. N.,Boyer,J.L.Fibrates and cholestasis.Hepatology,Aug,2015,62(2):635-43.)。因此，开发新的胆汁淤积型肝损伤治疗药物十分必要。

我国天然植物资源丰富，植物次生代谢产物的化学结构多种多样。目前，每年上市的药物中，有30-40％直接或间接依赖于天然产物，天然产物已经成为开发新型药物的重要来源。本发明旨在从天然产物中寻找肝内胆汁淤积肝损伤的有效治疗药物。

发明内容

本发明的任务是提供一种用于治疗肝内胆汁淤积型肝损伤的药物。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的治疗肝内胆汁淤积型肝损伤的药物是金线莲苷(Kinsenoside(3-(R)-3-β -D-Glucopyranosyloxybutanolide))。

本专利申请发明人对金线莲苷治疗肝内胆汁淤积型肝损伤的作用进行了研究，并取得了较显著的治疗效果。

金线莲苷属于糖苷类化合物，金线莲苷的化学结构式如下所示：

本发明研究使用的金线莲苷购买自上海同田生物技术股份有限公司，纯度>98.0％。HPLC 测定金线莲苷(Kinesenoside,KD)纯度色谱图见图6。

以下为核磁共振谱图鉴定KD数据。

金线莲(Anoectochilus roxburghii)为兰科开唇兰属多年生草本植物。金线莲是一种珍稀中药材，具有祛风利湿、解毒止痛和清热凉血的功效(参考文献：Ye,S.,Shao,Q.,Zhang,A. Anoectochilus roxburghii:A review of its phytochemistry,pharmacology,and clinical applications. J Ethnopharmacol,Sep 14,2017,209 184-202.)。在民间常用于疗糖尿病、乙型肝炎、高血压和肿瘤等疾病的治疗。金线莲苷(Kinesenoside,KD)是金线莲的主要活性成分，因具有降糖、减脂、护肝等多种药理活性而被广泛关注(参考文献：Du,X.M.,Irino,N.,Furusho,N.,et al. Pharmacologicallyactive compounds in the Anoectochilus and Goodyera species.J Nat Med,Apr,2008,62(2):132-48.)。研究表明，金线莲苷具有治疗糖尿病和抗氧化应激的作用(参考文献： Zhang,Y.,Cai,J.,Ruan,H.,et al.Antihyperglycemic activity of kinsenoside,ahigh yielding constituent from Anoectochilus roxburghii in streptozotocindiabetic rats.J Ethnopharmacol,Nov 1, 2007,114(2):141-5.Hsiao,H.B.,Wu,J.B.,Lin,H.,et al.Kinsenoside isolated from Anoectochilus formosanus suppressesLPS-stimulated inflammatory reactions in macrophages and endotoxin shock inmice.Shock,Feb,2011,35(2):184-90.)。此外，金线莲苷可以通过维持血管内皮结构发挥血管保护作用(参考文献：Liu,Z.L.,Liu,Q.,Xiao,B.,et al.The vascular protectiveproperties of kinsenoside isolated from Anoectochilus roxburghii under highglucose condition.Fitoterapia, Apr,2013,86 163-70.)。值得注意的是，金线莲苷对不同类型的肝损伤均具有保护作用。金线莲苷可以通过降低乳酸脱氢酶(LDH)、谷氨酸转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)等胞浆酶对硫代乙酰胺、四氯化碳等诱发的肝纤维化和肝坏死发挥保护作用，其与抑制Kuffer 细胞激活、降低肿瘤坏死因子(TNF)表达以及抑制ERK和JNK等信号通路有关(参考文献：Hsieh,W.T.,Tsai,C.T.,Wu,J.B.,et al.Kinsenoside,a highyielding constituent from Anoectochilus formosanus,inhibits carbontetrachloride induced Kupffer cells mediated liver damage.J Ethnopharmacol,May 17,2011,135(2):440-9.Wu,J.B.,Lin,W.L.,Hsieh,C.C.,et al. Thehepatoprotective activity of kinsenoside from Anoectochilusformosanus.Phytother Res,Jan, 2007,21(1):58-61.

Wu,J.B.,Chuang,H.R.,Yang,L.C.,et al.A standardized aqueous extract ofAnoectochilus formosanus ameliorated thioacetamide-induced liver fibrosis inmice:the role of Kupffer cells. Biosci Biotechnol Biochem,2010,74(4):781-7.)；此外，金线莲苷还可以通过抑制树突状细胞诱导的CD8⁺T细胞应答，而在自身免疫性肝炎中发挥抗炎作用(参考文献：Xiang,M.,Liu, T.,Tan,W.,et al.Effects of kinsenoside,apotential immunosuppressive drug for autoimmune hepatitis,on dendritic cells/CD8(+)T cells communication in mice.Hepatology,Dec,2016,64(6): 2135-2150.)。但是，金线莲苷对胆汁淤积型肝损伤是否具有保护作用尚未见报道。

本专利申请发明人通过构建α-异硫氰酸萘酯(alpha-naphthylisothiocyanate,ANIT)致大鼠胆汁淤积型肝损伤模型，考察金线莲苷对胆汁淤积型肝损伤的作用，发现金线莲苷能够有效缓解肝内胆汁淤积型肝损伤，在体内可调控胆汁酸相关转运体和代谢酶基因的表达、从而改善胆汁酸淤积对肝脏造成的损伤，能作为治疗胆汁淤积型肝损伤的药物，实验资料见实施例1：金线莲苷(kinsenosid；KD)治疗肝内胆汁淤积型肝损伤的作用。

附图说明

图1：通过构建α-异硫氰酸萘酯(alpha-naphthylisothiocyanate,ANIT)致大鼠胆汁淤积型肝损伤模型，考察金线莲苷对大鼠胆汁淤积型肝损伤模型体征指数的影响。图1中：

A.血浆颜色变化，ANIT组大鼠血浆颜色呈明显的深黄色，给予KD或UDCA后，血浆颜色呈接近于正常对照组的浅黄色，KD可改善胆汁淤积型大鼠的血浆颜色；

B.体重变化，ANIT组大鼠体重显著下降，UDCA治疗组体重增长情况接近正常组，KD组较正常组体重有一定的降低，但不如ANIT模型组明显，KD可缓解ANIT诱导的大鼠体重下降；

C.肝体比变化，给予KD或UDCA治疗后大鼠肝脏重量与其体重的比值较ANIT模型组相比呈现下降的趋势，KD可使胆汁淤积型大鼠的肝脏重量趋于正常；

D.胆汁酸流速变化，ANIT组大鼠胆汁流速较正常对照组相比显著下降，而给予KD或 UDCA治疗后大鼠胆汁流速较模型组显著增加，KD可改善胆汁淤积型大鼠的胆汁流速。

图2：通过生物化学检测的方法，考察金线莲苷对大鼠胆汁淤积型肝损伤模型血浆生化指标的影响。图2中：

A.血浆谷丙转氨酶(ALT)的变化，ANIT模型组较正常对照组ALT显著升高，给予KD或UDCA治疗后，大鼠血浆ALT出现显著性降低，KD可降低胆汁淤积型大鼠的血浆ALT 水平；

B.血浆谷草转氨酶(AST)的变化，ANIT模型组较正常对照组AST显著升高，给予 KD或UDCA治疗后，大鼠血浆AST出现显著性降低，KD可降低胆汁淤积型大鼠的血浆AST 水平；

C.血浆总胆汁酸(TBA)的变化，ANIT模型组较正常对照组TBA显著升高，给予KD 或UDCA治疗后，大鼠血浆TBA浓度出现显著性降低，KD可降低胆汁淤积型大鼠的血浆 TBA水平；

D.血浆碱性磷酸酶(AKP)的变化，ANIT模型组较正常对照组AKP显著升高，给予 KD或UDCA治疗后，大鼠血浆AKP浓度出现显著性降低，KD可降低胆汁淤积型大鼠的血浆AKP水平；

E.血浆总胆红素(TBIL)的变化，ANIT模型组较正常对照组TBIL显著升高，给予KD或UDCA治疗后，大鼠血浆TBIL浓度出现显著性降低，KD可降低胆汁淤积型大鼠的血浆 TBIL水平；

F.血浆直接胆红素(DBIL)的变化，ANIT模型组较正常对照组DBIL显著升高，给予KD或UDCA治疗后，大鼠血浆DBIL浓度出现显著性降低，KD可降低胆汁淤积型大鼠的血浆DBIL水平。

图3：通过HE染色，对大鼠肝脏样本进行病理切片观察，考察金线莲苷对ANIT致胆汁淤积大鼠肝脏病理生理的影响。图3中：

A.正常组大鼠肝细胞结构清晰、肝窦和肝索结构规则、且无淤血或炎症细胞浸润等异常情况；

B.ANIT模型组大鼠肝窦扩张且出现明显的炎症细胞浸润(图中箭头标记处)，ANIT造成了大鼠的肝脏损伤；

C.低剂量KD组肝脏可见一定程度的肝细胞炎症损伤；较ANIT模型组损伤程度低；

D.中剂量KD组肝脏可见轻微的肝细胞炎症损伤，中剂量KD缓解大鼠ANIT诱导的肝细胞损伤；

E.高剂量KD组肝脏结构接近正常对照组，高剂量KD显著改善大鼠ANIT诱导的肝细胞损伤；

F.UDCA治疗组大鼠肝窦结构正常、肝细胞间隙明显、炎症细胞浸润情况恢复明显；

G.正常大鼠给予KD不影响肝细胞形态。

图4：采用RT-qPCR的方法，考察金线莲苷对ANIT致肝内胆汁淤积大鼠Fxr及胆汁酸相关转运体、代谢酶基因mRNA的影响。图4中：

A.Fxr mRNA的相对表达，大鼠给予ANIT后，肝脏中Fxr的mRNA水平较正常大鼠相比显著性下降，给予低、中、高剂量KD后，Fxr的mRNA水平上调；

B.Ntcp mRNA的相对表达，大鼠给予ANIT后，肝脏中Ntcp的mRNA水平较正常大鼠相比显著性下降，给予低、中、高剂量KD后，Ntcp的mRNA水平显著上调；

C.Bsep mRNA的相对表达，ANIT可引起Bsep mRNA上调，给予低、中、高剂量KD后，Bsep mRNA 上调较ANIT组更为显著；

D.Mrp2 mRNA的相对表达，大鼠给予ANIT后，肝脏中Mrp2的mRNA水平较正常大鼠相比显著性下降，给予低、中、高剂量KD后，Mrp2的mRNA水平显著上调；

E.Mrp3 mRNA的相对表达，大鼠给予ANIT后，肝脏中Mrp3的mRNA水平较正常大鼠相比无明显变化，给予低、中、高剂量KD后，Mrp3的mRNA水平显著上调；

F.Mrp4 mRNA的相对表达，大鼠给予ANIT及KD后,各组Mrp4 mRNA水平无显著性变化；

G.Cyp7a1 mRNA的相对表达，大鼠给予ANIT及KD后各组Cyp7a1 mRNA水平较正常大鼠相比均出现显著上升；

H.Cyp8b1 mRNA的相对表达，大鼠给予ANIT后，肝脏中Cyp8b1的mRNA水平较正常大鼠相比显著上调，给予低、中、高剂量KD后，Cyp8b1的mRNA水平显著性下降。

图5：采用Western blotting的方法，考察金线莲苷对ANIT致肝内胆汁淤积大鼠Fxr及胆汁酸相关转运体、代谢酶基因蛋白表达的影响。图5中：

A.大鼠肝脏Fxr及胆汁酸相关转运体、代谢酶基因蛋白表达的变化；

B.Fxr蛋白的相对表达，大鼠给予ANIT后，肝脏中Fxr的蛋白水平较正常大鼠相比显著性下降，给予低、中、高剂量KD后，Fxr的蛋白水平显著性上调；

C.Ntcp蛋白的相对表达，大鼠给予ANIT后，肝脏中Ntcp的蛋白水平较正常大鼠相比显著性上调，给予低、中、高剂量KD后，Ntcp的蛋白水平较ANIT组无显著变化；

D.Bsep蛋白的相对表达，ANIT可引起Bsep蛋白上调，给予低、中、高剂量KD后，Bsep蛋白上调较ANIT组更为显著；

E.Mrp2蛋白的相对表达，，大鼠给予ANIT后，肝脏中Mrp2的蛋白水平较正常大鼠相比显著性下降，给予低、中、高剂量KD后，Mrp2的蛋白水平上调；

F.Mrp3蛋白的相对表达，大鼠给予ANIT后，肝脏中Mrp3的蛋白水平较正常大鼠相比明显上调，给予低、中、高剂量KD后，Mrp3蛋白上调较ANIT组更为显著；

G.Mrp4蛋白的相对表达，大鼠给予ANIT及KD后，各组Mrp4蛋白水平无显著性变化；

H.Cyp7a1蛋白的相对表达，大鼠给予ANIT及KD后，各组Cyp7a1蛋白水平较正常对照组均出现上调；

I.Cyp8b1蛋白的相对表达，大鼠给予ANIT及KD后,各组Cyp8b1蛋白的相对表达较正常对照组均无显著性变化。

图6.HPLC测定金线莲苷(Kinesenoside,KD)纯度色谱图。

具体实施方式

实施例1

金线莲苷(kinsenosid；KD)治疗肝内胆汁淤积型肝损伤的作用

购入SPF级SD大鼠42只，饲养于华中科技大学同济医学院SPF级实验动物中心，给予标准饮食和饮水，房间温度控制在23±2℃，适应喂养3天后开始灌胃给药。实验中涉及大鼠的实验方案经华中科技大学同济医学院动物实验伦理委员会批准。将42只SD大鼠随机分为7组(正常对照组、ANIT模型组、KD低剂量组、KD中剂量组、KD高剂量组、UDCA 阳性对照组、KD阴性对照组)，每组6只，每天称重并记录体重。在适应环境3天后，模型组、KD给药组和UDCA阳性对照组灌胃分别给予75mg/kg ANIT以诱导胆汁淤积型肝损伤，正常对照组和KD阴性对照组则灌胃给予2mL生理盐水。造模12h后开始给药，低剂量组灌胃给予50mg/kg KD；中剂量组灌胃给予100mg/kg KD；高剂量组灌胃给予200mg/kg KD；阳性对照组灌胃给予80mg/kg UDCA，KD阴性对照组灌胃给予100mg/kg KD，正常对照组和模型组灌胃给予2mL生理盐水。此后，每24h重复给药一次，共给药3次，并于第3次给药后对各组动物禁食(不禁水)。造模72h后处死动物并采集样本。探究KD的治疗作用。

KD对ANIT诱导的胆汁淤积型大鼠血浆颜色、体重增长、肝脏器质系数和胆汁酸流速的影响如图1所示。由图1(A)血浆颜色变化图可以观察到，ANIT诱导的胆汁淤积型大鼠血浆颜色呈明显的深黄色，这可能是ANIT引起血浆中总胆红素和直接胆红素升高的结果，而给予KD或UDCA后，血浆颜色呈接近于正常对照组的浅黄色。由图1(B)大鼠体重变化曲线可以发现，灌胃给予75mg/kg ANIT后，大鼠体重较正常对照组和KD阴性对照组相比显著下降，UDCA治疗组胆汁淤积大鼠的体重增长情况与正常对照组接近。虽然给予不同剂量 KD的胆汁淤积大鼠体重均出现下降情况，但给予中、高剂量KD的胆汁淤积大鼠的体重下降情况均不如ANIT模型组明显。由图1(C)肝脏器质系数可知，给予KD或UDCA治疗后大鼠肝脏重量与其体重的比值较ANIT模型组相比呈现下降的趋势。同时，由图1(D)胆汁酸流速变化图可知，ANIT诱导的胆汁淤积大鼠胆汁流速较正常对照组大鼠相比显著下降，而给予KD或UDCA治疗后大鼠胆汁流速较模型组显著增加。上述结果说明KD可缓解ANIT致大鼠肝内胆汁淤积型肝损伤。

KD对ANIT致胆汁淤积大鼠血浆生化指标的影响如图2所示。正常大鼠单次灌胃给予 75mg/kg ANIT后，血浆中ALT和AST显著升高，且升高倍数超过5倍，说明ANIT导致了肝细胞损伤，肝细胞内的ALT和AST释放进入血液。同时，血浆中AKP显著性升高，说明 ANIT引起了胆管阻梗，AKP无法通过胆管外排而进入血液。此外，ANIT导致了血浆中TBA、 TBIL和DBIL的升高。这些结果表明，ANIT致大鼠肝内胆汁淤积型肝损伤模型建立成功。另一方面，灌胃给予不同剂量KD或UDCA后，胆汁淤积大鼠血浆中上述升高的生化指标均出现显著性降低，且正常大鼠给予100mg/kg KD不会引起上述生化指标改变。其中，灌胃给予低、中、高剂量的KD和80mg/kg UDCA可使胆汁淤积大鼠血浆中ALT、AST、AKP、TBIL 和DBIL显著性降低，灌胃给予中、高剂量的KD和80mg/kg UDCA可使胆汁淤积大鼠血浆中TBA显著性降低。上述结果表明，KD可以缓解ANIT致大鼠肝内胆汁淤积肝损伤，呈现良好的肝保护作用。

为直观地考察KD对ANIT致胆汁淤积大鼠肝脏病理生理的影响，我们对动物实验采集的肝脏样本进行了HE染色，HE染色结果如图3所示。正常大鼠肝细胞结构清晰、肝窦和肝索结构规则、且无淤血或炎症细胞浸润等异常情况；ANIT模型大鼠肝窦扩张且出现明显的炎症细胞浸润(图中箭头标记处)；ANIT模型大鼠给予不同剂量KD后，肝窦扩张情况得到改善且炎症细胞浸润情况减轻，保护作用呈现剂量依赖性；UDCA治疗组大鼠肝窦结构正常、肝细胞间隙明显、炎症细胞浸润情况恢复明显；正常大鼠给予100mg/kg KD不影响肝细胞形态。上述结果表明，ANIT可引起正常大鼠肝脏发生病理生理改变，其中以肝窦形状改变和炎症细胞浸润最为明显；KD可以改善胆汁淤积大鼠肝脏病理生理情况。

我们在整体动物水平评价KD对胆汁淤积型肝损伤的保护作用，并通过实时荧光定量 PCR和免疫印迹的方法测定实验肝脏样本中核受体、胆汁酸转运体、代谢酶的基因和蛋白表达水平，以研究KD对胆汁淤积型肝损伤发挥保护作用的潜在机制。

KD对ANIT致肝内胆汁淤积大鼠Fxr及胆汁酸相关转运体、代谢酶基因表达的影响如图4和5所示。大鼠灌胃给予75mg/kg ANIT 72h后，肝脏中Fxr、Ntcp、Mrp2的基因表达较正常大鼠相比显著性下降；Bsep、Cyp7a1、Cyp8b1的基因表达较正常大鼠相比显著性上升；而Mrp3、Mrp4的基因表达较正常大鼠相比无显著性变化。正常大鼠灌胃给予100mg/kg KD后，Fxr、Ntcp、Bsep、Mrp2、Mrp4的基因表达较正常大鼠相比无显著性变化，但Mrp3、Cyp7a1、Cyp8b1较正常大鼠相比出现显著性升高。胆汁淤积大鼠在连续灌胃给予低、中、高剂量KD后，Fxr、Ntcp、Bsep、Mrp2、Mrp3、Cyp7a1基因表达上调，Cyp8b1基因表达下调。其中，高剂量的KD可以引起Fxr、Cyp7a1基因表达的显著上调，中、高剂量的金线莲苷可引起Bsep、 Mrp2、Mrp3基因表达的显著上调。

实验结论：金线莲苷对ANIT诱导的肝内胆汁淤积型肝损伤具有较好的治疗作用，能够有效改善肝脏损伤，其机制在于该化合物可调控胆汁酸相关转运体和代谢酶基因的表达、从而改善胆汁酸淤积对肝脏造成的损伤。

Claims

1.金线莲苷(Kinsenoside(3-(R)-3-β-D-Glucopyranosyloxybutanolide)在制备用于治疗肝内胆汁淤积型肝损伤药物中的应用。

2.一种用于治疗肝内胆汁淤积型肝损伤的药物制剂，其特征在于，含有有效量的金线莲苷和制药学上可接受的载体、添加剂或/和赋形剂。

3.权利要求1或2中所述的金线莲苷具有以下所示结构：