CN115226670A - 原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法。本发明的原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法，包括以下步骤：以150‑50mg/kg剂量的α‑异硫氰酸萘酯处理实验动物，处理周期为7‑30天。本发明通过经口灌胃α‑萘基异硫氰酸酯(ANIT)诱导实验动物SD大鼠(雌性)肝脏发生病变，建立符合临床发病特征的胆汁淤积性肝硬化/肝纤维化大鼠模型，在该模型上的初步药效筛选，结果表明供试品hPC‑MSC在本实验系统下未见明显的改善肝脏组织病理学病变的作用，但对肝脏细胞功能有一定的改善。

Description

原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法。

背景技术

原发性胆汁淤积性肝硬化(PBC)是自身免疫性的疾病，它是由于自身免疫反应介导的慢性进行性的胆汁淤滞性的肝病，主要的表现为肝肿大，并且肝脏颜色呈墨绿色的，随着疾病的进展可能会进展成结节状。患者以适当休息，食用高蛋白、高碳水化合物、高维生素低脂饮食，每日脂肪<40～50g为宜，补充脂溶性维生素A、D、E、K。该病的治疗手段为服用熊去氧胆酸，服药6个月以上可改善临床症状及实验室化验指标；口服皮质类固醇，如氢化泼尼松。注意晚期患者骨病加剧及并发细菌感染。除此之外，硫唑嘌呤、环孢毒素A等药物也对PBS有效，但因有肾毒性及骨髓抑制应慎用。实施对疾病过程的治疗，应注意药物的副作用。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是近年来发现的一类具有自我复制能力的细胞，具有多向分化潜能，并有效调节免疫效应细胞、调控炎症反应及促进损伤修复。其取材简单、容易扩增、免疫调节能力强，成为理想的干细胞来源，目前已用于多种疾病的治疗，包括糖尿病、新心功能衰竭、肝硬化、系统性红斑狼疮等，多项临床试验结果证实其疗效好、安全性高、副作用小、未发现严重不良事件。

本发明计划针对间充质干细胞治疗PBC的临床剂量、给药途径、给药方案进行动物实验研究，发现现在市场上并未有商品化的PBC小动物模型。

鉴于上述问题，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法。

根据本发明具体实施方式的原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法，所述方法包括以下步骤：以150-50mg/kg剂量的α-异硫氰酸萘酯处理实验动物，处理周期为7-30天。

其中，α-异硫氰酸萘酯的剂量为150mg/kg、140mg/kg、130mg/kg、120mg/kg、110mg/kg、100mg/kg、90mg/kg、80mg/kg、70mg/kg、60mg/kg、50mg/kg或者是150-50mg/kg范围内的任意数值。

本发明中可选用的实验动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬、猪、猴等。

根据本发明具体实施方式的原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法，优选的实验动物为大鼠。

常用的实验大鼠种类包括SD大鼠、Wistar大鼠、SHR大鼠、ACL大鼠、Fisher344大鼠，其中，本发明中有限选用的大鼠为SD大鼠。

根据本发明具体实施方式的原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法，为了达到更好的效果，所述实验动物为SD大鼠,SD大鼠的体重为180-220g。

具体的，上述所述实验动物为SD大鼠,SD大鼠的体重为180-220g，其年龄为4-6周。

根据本发明具体实施方式的原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法将150-50mg/kg剂量的α-异硫氰酸萘酯以经口灌胃的方式处理实验动物。

同时，处理实验的动物的频率为每间隔3-7天处理一次。

优选的，本发明的原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法为，SD大鼠采用经口灌胃给予100mg/kg剂量(5mL/kg)ANIT，每周两次，诱导两周后，继续经口灌胃给予100mg/kg剂量(5mL/kg)ANIT，每周一次。

本发明的有益效果：

本发明通过经口灌胃α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)诱导实验动物SD大鼠(雌性)肝脏发生病变，建立符合临床发病特征的胆汁淤积性肝硬化/肝纤维化大鼠模型，采用先构建模型再给予供试品hPC-MSC治疗的方式，在试验周期内，通过动物体重变化及一般临床观察指标、肝脏功能血液生化、肝脏组织病理学特征、肝脏胶原沉积水平及肝脏CK7表达水平及分布等指标的改变，评价供试品hPC-MSC对ANIT诱导大鼠胆汁淤积性肝硬化模型的治疗作用，结果发现：

1)供试品hPC-MSC在设定治疗方案(1×10⁶个细胞/只和5×10⁶个细胞/只，尾静脉注射，每周一次，连续两周)下对ANIT诱导动物体重增长抑制未见明显影响；

2)供试品hPC-MSC在治疗一周时对ANIT诱导动物机体胆红素代谢障碍和血液生化指标ALP、ALT和AST水平异常升高反应呈现较为明显的改善作用，在治疗终点时对肝脏细胞功能指标AST有较为明显的改善作用。

3)供试品hPC-MSC在设定治疗方案下对ANIT诱导模型动物肝脏组织病理学病变(包括肝细胞坏死、肝脏胆管增生，肝纤维化及肝细胞胆管化等进程)等未见明显改善作用；

4)供试品hPC-MSC在设定治疗方案下对ANIT诱导模型动物肝脏CK7表达活化及其分布未见明显改善作用。

因此，本发明成功建立符合临床发病特征的大鼠胆汁淤积性肝硬化模型，在该模型上的初步药效筛选结果表明供试品hPC-MSC在本实验系统下未见明显的改善肝脏组织病理学病变的作用，但对肝脏细胞功能有一定的改善。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示试验周期内各实验组动物体重变化情况，其中，试验周期(D0-D28)内各试验组动物体重变化曲线；B：试验终点(D28)各试验组动物体重；所有数据均采用平均值±标准差进行统计分析，^**P<0.01，^****P<0.0001表示不同试验组与正常对照组的统计分析结果；

图2显示各试验组动物肝脏病理学检测结果，分别于40×、100×及200×光学显微镜下对肝脏进行组织病理学诊断及分析，各试验组选取三只动物个体进行结果展示；

图3显示各试验组动物肝脏组织天狼星染色结果，于40×光学显微镜下对肝脏纤维化进程进行分析，各试验组选取三只动物个体进行结果展示；

图4显示各试验组动物肝脏组织CK7免疫组织化学染色检测结果，于100×光学显微镜下对肝脏免疫组织化学染色结果进行分析，各试验组选取三只动物个体进行结果展示。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

1、试验材料

1.1实验动物：品系：SD大鼠；等级：SPF级。体重：180-220g；年龄：4-6周。

1.2造模物质：名称：α-异硫氰酸萘酯(ANIT)，性状：白色粉末；

1.3试验耗材：检查手套、无菌棉签、脱脂棉球、医用口帽及不同规格注射器等。

实施例1建立动物模型

实验动物经适应期检验及观察合格后进行体重筛选，根据体重随机分为2个试验组，除正常对照组动物外，其余动物均采用经口灌胃给予100mg/kg剂量(5mL/kg)ANIT，每周两次。

诱导两周后根据动物血生化指标进行第二次分组，包括模型对照组和干细胞低剂量组和高剂量组，第二次分组后继续经口灌胃给予100mg/kg剂量(5mL/kg)ANIT，每周一次，正常对照组动物给予相应溶媒，试验周期内所有试验组动物均采用正常饮水及喂食。

实施例2

实验动物经适应期检验及观察合格后进行体重筛选，根据体重随机分为2个试验组，除正常对照组动物外，其余动物均采用经口灌胃给予90mg/kg剂量(5mL/kg)ANIT，每周两次。

诱导两周后根据动物血生化指标进行第二次分组，包括模型对照组和干细胞低剂量组和高剂量组，第二次分组后继续经口灌胃给予90mg/kg剂量ANIT，每周一次，正常对照组动物给予相应溶媒，试验周期内所有试验组动物均采用正常饮水及喂食。

上述实验中，α-异硫氰酸萘酯的剂量还可以选择为150mg/kg、140mg/kg、130mg/kg、120mg/kg、110mg/kg、80mg/kg、70mg/kg、60mg/kg或50mg/kg。

以下实验采用实施例1获得的动物模型。

实施例3考察供试品hPC-MSC对模型动物体重变化的影响

1.试验分组

组别设计：本试验共分4个组，按诱导两周后大鼠的血液生化指标随机分组，包括正常对照组、模型对照组和干细胞治疗低、高剂量治疗组(1×10^6、5×10^6细胞/只)。

动物数量：8只/组，共计32只；

性别比例：均为雌性。

分组方法：根据诱导两周后大鼠的血液生化指标ALP水平降序后，分配随机数字，随机数字再降序，按随机数字从低至高分别设为第1、2、3、4组，分别代表正常对照组、模型对照组和低、高两个不同剂量治疗组(1×10^6、5×10^6细胞/只)。

2.给药信息

供试品给药剂量：低、高剂量治疗组给药剂量分别为：1×10^6、5×10^6细胞/只；

供试品给药浓度：1×10^6、5×10^6细胞/2.0mL；

给药体积：2.0mL/只；

给药途径：尾静脉注射；

给药频率及周期：供试品治疗两次，周期2周；

给药日期：D15和D22各给药一次；

第一次分组当天定义为试验第一天(day1，D1)。

造模前称量所有动物体重用于试验分组，造模后每周称量2次大鼠体重，绘制试验周期内动物体重变化曲线，实验动物解剖前称量一次，用于计算实验动物肝/体重比值。结果见图1、表1：

表1各实验组动物于不同实验时间节点的体重及体重变化情况

本试验分为两个阶段，第一阶段为模型诱导阶段(D0-D14)，在该阶段将动物分为正常对照组和模型对照组，采用α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)经口灌胃方式构建SD大鼠胆汁淤积性肝硬化模型(诱导剂量为100mg/kg，口服灌胃给予，每周两次)，该阶段的动物体重监测结果显示，正常对照组动物体重由分组当天(D0)的224.21±7.55g增长至D14的260.52±12.70g，体重增长率为16.30±6.64％，而α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)在本试验设定诱导方案下对实验动物体重增长具有明显的抑制作用，模型对照组动物体重由分组当天(D0)的222.76±7.22g降低至D14的214.09±9.02g，体重增长率为-3.86±3.69％，与正常对照组动物体重增长程度相比具有显著的统计学差异(P<0.001)。

第二阶段(治疗阶段，D14-D28)根据血生化指标ALP对模型对照组动物进行第二次分组，并进行供试品hPC-MSC治疗(治疗剂量分别为1×10⁶细胞/只、5×10⁶细胞/只，尾静脉注射给药，每周一次)，治疗同时继续ANIT诱导(诱导剂量为100mg/kg，口服灌胃给予，每周一次)，治疗期内正常对照组、模型对照组、hPC-MSC低、高剂量组动物体重分别由第二次分组当天(D14)的260.52±12.70g、214.94±8.72g、212.02±9.57g和216.47±6.23增长至实验终点(D28)的281.25±22.95g、230.10±8.67g、232.69±9.19g和224.23±10.09g，体重增长率分别为7.85±4.52％、7.13±4.12％、9.88±5.23％和2.94±5.08，各组动物之间体重增长率没有明显差异。

实施例4考察供试品hPC-MSC对模型动物胆汁淤积诱导肝脏损伤进程的影响

于模型诱导阶段(D11)采集动物血样进行血液生物化学分析，根据血生化检测结果对动物进行随机分组，而后给予供试品hPC-MSC对动物进行治疗。

在供试品hPC-MSC治疗一周(D21)及实验终点(D29)再分别采集各试验组动物血样进行血液生化分析(主要包括两个维度，分别为肝脏胆红素代谢指标和肝脏功能指标)，同时结合临床动物黄疸一般观察结果，动态评估模型动物疾病进程及供试品的阶段性治疗效应。

4.1供试品hPC-MSC对模型动物胆红素代谢异常的影响

供试品治疗一周(D21)，大鼠颈静脉采血，采血前所有实验动物禁食12h，每次采集1.0mL，4℃离心机3,000rpm/min离心10min分离血清进行血液生物化学检测；

供试品治疗终点(D29)，动物经麻醉后经腹腔静脉采血，采血前所有实验动物禁食12h，每次采集1.0mL，4℃离心机3,000rpm/min离心10min分离血清进行血液生物化学检测。

检测指标包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷胺酰转肽酶(GGT)、总胆红素(T-BIL)、间接胆红素(D-BIL)、直接胆红素(I-BIL)。

表2供试品hPC-MSC对模型动物胆红素代谢异常的影响

模型诱导阶段(D11)血生化检测结果显示，正常对照组动物血清总胆红素(T-BIL)水平为2.81±1.53μmol/L，而模型对照组动物T-BIL水平较正常对照组显著升高，达44.94±19.51μmol/L，呈明显胆汁淤积特征。

表3供试品hPC-MSC对模型动物血清ALP水平的影响

碱性磷酸酶(ALP)作为胆汁淤积性肝硬化/肝纤维化疾病特征性血清生物化学指标，动物在实验周期中的不同时点血清ALP水平波动改变，因此可以通过各组动物整体血清ALP水平的变化情况评价供试品hPC-MSC对动物肝脏功能的改善作用。

正常对照组动物于模型诱导阶段(D11)血清ALP水平为125.38±43.14U/L，而同期模型对照组动物血清ALP水平为282.48±52.47U/L，较正常对照组显著升高，符合胆汁淤积性肝病的疾病特征。

模型对照组动物根据D11的ALP水平分组后，给予供试品hPC-MSC治疗，供试品hPC-MSC在本试验设定治疗方案下治疗一周(D21)时对ANIT诱导的ALP水平升高有一定的改善效应，低、高剂量治疗组动物血清ALP水平分别为357.50±39.18U/L和368.75±80.44U/L，较其模型诱导期(D11)血清ALP水平(276.75±43.92U/L和301.75±55.12U/L)分别升高31.73±22.77％和22.66±15.72％，其中高剂量组动物血清ALP水平升高的幅度与同期模型对照组(52.45±19.14％)相比显著降低(P<0.01)。

至实验终点(D29)，hPC-MSC低、高剂量治疗组动物血清ALP水平分别为224.25±42.30U/L和228.33±19.35U/L，较其模型诱导期(D11)分别降低-18.38±12.31％和-12.08±11.36％，变化率与同期模型对照组(-16.94±7.36％)接近，无明显差异。

表4供试品hPC-MSC对模型动物血清ALT和AST水平的影响

除血清ALP水平升高外，模型动物经肝毒剂ANIT诱导后肝脏功能异常反应还表现为血清ALT和AST水平显著升高，于治疗一周(D21)及终点(D29)模型对照组动物血清ALT水平分别为210.29±67.45U/L和63.71±4.35U/L，与正常对照组动物(48.75±12.41U/L和36.63±4.90U/L)相比具有显著的统计学差异(P<0.05)，供试品hPC-MSC在本试验设定治疗方案下治疗一周(D21)时对模型动物血清ALT水平显著升高具有一定的改善作用，低、高剂量治疗组动物血清ALT水平分别为185.00±31.42U/L和153.75±37.23U/L，与同期模型对照组相比ALT水平均有一定程度的降低。

至实验终点(D29)，hPC-MSC低、高剂量治疗组动物血清ALT水平分别为63.38±15.40U/L和59.33±1.53U/L，与同期模型对照组动物相比没有明显差异。

模型动物血清AST水平的变化趋势与ALT类似，于治疗一周(D21)及终点(D29)模型对照组动物血清AST水平分别为275.63±92.91U/L和127.14±23.95U/L，与正常对照组动物(122.38±6.78U/L和105.75±9.91U/L)相比具有显著的统计学差异(P<0.05)，供试品hPC-MSC在本试验设定治疗方案下治疗一周(D21)时对模型动物血清AST水平显著升高具有一定的改善作用，低、高剂量治疗组动物血清AST水平分别为253.25±39.98U/L和229.25±44.44U/L，与同期模型对照组相比AST水平均有一定程度的降低。

至实验终点(D29)，hPC-MSC低、高剂量治疗组动物血清AST水平分别为115.25±21.74U/L和91.00±8.72U/L，其中hPC-MSC高剂量治疗组动物血清AST水平与同期模型对照组动物相比明显降低，具有显著的统计学差异(P<0.05)。

实施例5考察供试品hPC-MSC对模型动物肝脏组织病理病变特征改变的影响

于实验终点(D29)对各试验组动物进行安乐死，解剖采集肝脏样本称重，计算肝体指数后，行常规固定进行组织病理学检测(H&E染色、天狼星红染色和CK7免疫组化染色)。

5.1考察肝体指数

肝体指数测定方法：实验动物经3％戊巴比妥钠(60mg/kg)腹腔注射麻醉后，待大鼠完全麻醉后，行大体解剖，取肝脏组织，准确称量肝脏重量，计算肝体指数(肝体指数＝肝脏重量/动物体重)。

表5供试品hPC-MSC对模型动物肝体指数的影响

实验动物大体解剖观察发现，正常对照组动物肝脏形态未见异常，色泽鲜红，质地柔软，表面光滑，分叶清楚，边缘锐利易分离，而模型对照组动物肝脏则出现肉眼可见增大，色泽暗黄，质地偏硬，表面粗糙边缘钝圆，肝脏分叶不清晰，肝体表面出现明显结节增生。供试品hPC-MSC在设定治疗方案下对模型动物肝脏解剖学表现未见明显改善，各治疗组动物肝脏均出现肉眼可见肿大及结节性增生等表现。

通过计算各试验组动物肝体指数结果表明，模型对照组动物肝体指数在本试验ANIT诱导周期内呈现明显增大，为4.42±0.32％，与正常对照组动物(2.62±0.15％)相比具有显著的统计学差异(P<0.05)，供试品hPC-MSC在设定治疗方案下对模型动物肝体指数异常升高反应没有呈现明显改善效应，低、高剂量治疗组动物肝体指数分别为4.34±0.19％和4.30±0.13％。

5.2肝脏组织病理学检测

检测方法：药物治疗周期结束24小时，实验动物经安乐死后行大体解剖，取肝脏组织，称重后，10％甲醛固定，石蜡包埋，切成3μm厚的切片，然后在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水合，HE染色，脱水、透明，封固，显微镜下观察并拍摄肝脏组织病理学改变。

如图2所示，肝脏组织病理学检测的实验结果显示，本研究体系下，正常对照组动物肝脏结构正常，肝小叶清晰，肝板内肝细胞索沿中央静脉向四周呈放射状排列，肝窦间隙未见异常，肝细胞胞质及细胞核界限清楚，染色均匀，没有炎性细胞浸润。

模型对照组动物则出现明显肝脏胆汁淤积诱导的组织病理学改变，主要表现为肝小叶结构破坏，汇管区及肝小叶内肝细胞肿大，变性破裂，可见大量点状、片状及灶状坏死区，坏死灶内可见细胞溶解后残留物，坏死灶周围肝细胞核仁浓染，嗜酸性增强，同时汇管区小胆管数量明显减少，胆管上皮细胞基底膜及血管上皮增生增厚，官腔扩大，伴有纤维组织增生，并与其相临近的汇管区纤维连接成桥，出现大范围结节，结节周围肝细胞胆汁淤积，可见毛细胆管胆栓，并且肝脏汇管区及中央静脉周围均出现胆管增生灶，呈花环状排列看，肝板界面肝细胞胆管化程度明显升高，以上组织病理学改变符合胆汁淤积肝硬化/肝纤维化组织病理学病变特征。

供试品hPC-MSC在设定治疗方案下对模型动物肝脏组织病理学病变特征未见明显改善，均与模型对照组动物病变程度一致。

5.3供试品hPC-MSC对模型动物肝脏纤维化进程的影响

检测方法：药物治疗周期结束24小时，实验动物经安乐死后行大体解剖，取肝脏组织，称重后，10％甲醛固定，石蜡包埋，切成3μm厚的切片，然后在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水合，天狼星红染色，脱水、透明，封固，显微镜像拍取不同倍数图像，采用Image J对图像进行分析。

表6供试品hPC-MSC对模型动物肝脏纤维容积分数的影响

如图3所述，肝脏天狼星红染色结果显示，与正常对照组相比，模型对照组动物肝脏汇管区和中央静脉区域出现大量阳性染色(红色部分)，主要为花环状胆管增生灶，同时纤维增生灶周围可见明显纤维丝状物，供试品hPC-MSC两个剂量治疗组动物肝脏汇管区和中央静脉区域胆管增生灶面积与模型对照组相比均未见明显改善。

采用ImageJ软件计算各试验组动物肝脏纤维化面积结果显示，如表6所示，模型动物肝脏纤维化程度在ANIT设定诱导方案下显著升高，于实验终点，模型对照组动物肝脏纤维容积分数(CVF％)为5.26±0.72％，与正常对照组动物肝脏纤维化程度(0.99±0.15％)相比具有显著的统计学差异(P<0.05)，模型动物肝脏纤维化进行在供试品hPC-MSC设定剂量干预下未见明显改善，低、高剂量治疗组动物肝脏CVF％分别为5.28±0.34％、5.15±0.43％。

5.4肝脏CK7免疫组化染色

检测方法：药物治疗周期结束24小时，实验动物经安乐死后行大体解剖，取肝脏组织，称重后，10％甲醛固定，石蜡包埋，切成3μm厚的切片，然后在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水合，CK7免疫组化染色，脱水、透明，封固，显微镜像拍取不同倍数图像，采用Image J对图像进行分析。

结果如图4所示，正常对照组动物肝脏除胆管周围出现CK7阳性表达外，其余正常肝板界面未见CK7阳性染色，而模型对照组动物肝脏在ANIT诱导下出现CK7强阳性表达，且CK7阳性表达分布及面积与胆管增生灶分布一致，提示本实验系统下，模型动物经ANIT诱导后出现明显肝细胞胆管化现象。供试品hPC-MSC在设定治疗方案下对模型动物肝脏肝细胞胆管化进程未见明显改善效应，与模型对照组相比，各治疗组动物肝脏CK7阳性染色程度及分布均未见明显改变。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以150-50mg/kg剂量的α-异硫氰酸萘酯处理实验动物，处理周期为7-30天。

2.根据权利要求1所述的原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述实验动物为大鼠。

3.根据权利要求1所述的原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述实验动物为SD大鼠。

4.根据权利要求1所述的原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述实验动物为SD大鼠,SD大鼠的体重为180-220g。

5.根据权利要求1所述的原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述实验动物为SD大鼠,SD大鼠的体重为180-220g，年龄为4-6周。

6.根据权利要求1所述的原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法，其特征在于，将150-50mg/kg剂量的α-异硫氰酸萘酯以经口灌胃的方式处理实验动物。

7.根据权利要求1所述的原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法，其特征在于，处理实验的动物的频率为每间隔3-7天处理一次。

8.根据权利要求1所述的原发性胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述α-异硫氰酸萘酯的剂量为100mg/kg。

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