CN105555282A - 包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分用于预防和治疗肝纤维化或肝硬化的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防和/或治疗肝纤维化或肝硬化的组合物，其包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分。在本发明中，已确认源自人胚胎干细胞的间充质干细胞具有抗肝纤维化的预防性作用。因此，可将源自人胚胎干细胞的间充质干细胞有效用作用于保护肝和预防及治疗肝纤维化或肝硬化的组合物或功能性保健食品中的活性成分。

Description

包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分用于预防和治疗肝纤维化或肝硬化的组合物
技术领域
本发明涉及用于预防和治疗肝纤维化和肝硬化的药物组合物，其包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分。
技术背景
肝是行使多种功能的器官。近年来，肝病的发展和由肝病引起的死亡数目逐渐增加。在韩国的肝病患者中，过去以乙型肝炎或丙型肝炎患者居多，但目前酒精肝患者而非传染性肝病患者有所增加，与欧洲和美洲肝病患者相似。此外，由于活跃社交的女性逐渐增加，女性饮酒机会也有所增加，因此具有酒精肝病的女性与前些年相比也有所增加。由于这种趋势，对治疗肝病的作用剂的研究已在世界范围积极开展。
一般来说，肝硬化指肝病的末期。肝硬化的主要诱因多种多样，包括肝炎、病毒感染、酒精中毒、胆汁酸分泌病症、药物成瘾、过敏和过量的铁过度沉积。
由于其很强的再生能力，即使有一定程度的损害，肝细胞仍可通过再生进行修复。然而，当肝细胞破坏发生一定时间后，损坏的细胞并不再生而将经历纤维化，这导致肝脏硬化。此肝脏通过其结构改变而硬化使得其不能回复至最初状态的病况称为肝硬化。
导致肝硬化的肝纤维化过程是在应答持续刺激中发生的反应，且与创伤愈合过程相似其可分为下列三步：1)急性炎症，2)细胞外基质(ECM)组分包括胶原的合成和3)组织重建(瘢痕形成)(RamadoriR,KnittelR,andSaileB.(1998)FibrosisandAlteredMatrixSynthesisDigestion59:372-375)。细胞外基质由胶原、基质糖蛋白(纤连蛋白、层粘蛋白等)、蛋白多糖等组成，但主要由胶原组成。肝细胞受破坏后，肝组织重建成新的肝细胞。在此时，如果细胞不能组成完美的细胞结构如细胞质和细胞外膜而仅形成支持细胞骨架结构的细胞外膜，则作为肝细胞的细胞外基质主要组分的胶原将过度沉积，且肝组织通过纤维胶原硬化，导致肝硬化。
肝纤维化指其中慢性炎症状态的肝组织反复损伤和修复使得结缔组织如胶原在肝组织中过度沉积由此导致肝组织中的疤痕的疾病。
一般而言，与肝硬化不同的是，肝纤维化是可逆的且由细纤维组成而无小结形成。一旦消除肝损伤的原因，肝脏可恢复至正常状态。然而，如果肝纤维化机制持续重复，肝纤维化导致不可逆的肝硬化，其中结缔组织间的交联增加以积累成粗纤维，且肝小叶丧失其正常结构而导致小结形成。
肝病由多种诱因导致，但如果这些肝病称为慢性的，则无论诱因为何，其通常导致肝纤维化或肝硬化。肝病在初始阶段无症状，但因此也难于在早期诊断。此外，由于肝病通常在慢性阶段发现，这些肝病并不易于治疗且具有高死亡率，并因此带来社会问题。此外，尚未开发出具有优异效果的治疗剂。
如本领域已知，肝纤维化的机制由细胞、细胞因子和细胞外基质(ECM)间复杂的相互作用导致。肝纤维化中ECM的过度产生是由于肝星状细胞(HSC)的活化通过肝脏中的巨噬Kupffer细胞的活化所分泌的多种细胞因子促进并由于活化的肝星状细胞中结缔组织的产生增加而引起。
肝星状细胞在1876年由Kupffer发现，由Ito进行了描述，且由Wake在1971年建立。肝星状细胞位于肝窦内皮细胞间的狄氏(Disse)空间，且肝上皮细胞以多种方式命名，如由于其卫星形状的肝星状细胞、由于具有包含维生素A的脂质滴的维生素A储存细胞、Ito细胞、脂肪储存细胞或窦周肝脂肪细胞，但在1990年正式称为“肝星状细胞(HSC)”，且该术语以沿用至今。
Kupffer细胞通过多种毒性物质损伤的肝细胞的吞噬作用或直接通过毒性物质活化以分泌细胞因子如转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生的生长因子(PDGF)等，且通过这些细胞因子以自分泌方式的方式再次活化。此外，肝脏组织中的肝窦内皮细胞和肝星状细胞通过由Kupffer细胞分泌的细胞因子活化。细胞外基质(ECM)组分的正常比例通过由活化的肝星状细胞分泌的IV型胶原酶和基底膜ECM(基底膜样基质，例如IV型胶原)降解时增加的胶原产生而破坏，且间质性ECM(间质型基质，例如I型胶原和III型胶原)彼此纠缠以形成纤维形成胶原，且随后积累于狄氏空间中。肝星状细胞通过降解的基底膜ECM和积累的间质性ECM活化。
此外，活化的肝星状细胞还通过刺激巨球蛋白和TIMP(其为金属蛋白酶(MMP)活性的抑制剂)的产生抑制间质性ECM的降解。由于血液和肝细胞间的质量交换通过狄氏空间积累的间质性ECM抑制，难以对肝细胞供给营养物和释放毒性物质，且肝细胞仍持续损伤。在重复这一系列反应时，结缔组织在肝组织中积累，引起肝纤维化或肝硬化。
最近，以多种方式积极实施了对肝纤维化的研究，包括对ECM的研究，对涉及ECM的细胞和多种细胞间关系、细胞活化机制、多种细胞因子和抗纤维形成剂等的研究，且旨在开发用于早期诊断肝纤维化的方法和用于治疗肝纤维化的作用剂。具体地，已知涉及过度积累的结缔组织产生的肝纤维化和肝硬化的最主要原因是肝星状细胞的活化，持续实施了对能够抑制星状细胞活性和活化的药物开发的研究。
目前使用的药物多种多样，但大多数用于肝病如肝炎，且这些药物的多种导致临床应用的副作用或价格昂贵。
同时，干细胞是能够分化成多种构成器官的组织细胞的细胞，且一般指分化前未分化的细胞，其可从胚胎胎儿和成年体的相应组织获得。干细胞通过由分化刺激物(环境)分化成特定细胞来进行表征；允许其由细胞分裂(自我更新)通过产生与自身相同的细胞而增殖(扩增)，而不同于由于分化完成而细胞分裂停止的细胞；且由于其在不同环境下或通过不同刺激可分化成为其他细胞因此在分化中具有可塑性(plasticity)。
根据其分化能力，干细胞可分为全能、多能和单能干细胞。全能干细胞是具有分化成所有细胞的全能性的全能细胞，且这些包括胚胎干细胞(ES细胞)和诱导的全能干细胞(iPS细胞)等。成人干细胞可为多能和/或单能干细胞的实例。
胚胎干细胞由早期胚胎形成中胚细胞的内细胞团形成；具有分化成所有细胞的全能性，使得其可分化成任何种类的组织细胞；可以永生和未分化的状态培养；且可通过生殖细胞的制备遗传至下一代，而不同于成人干细胞(Thomson等,Science,282:1145-1147,1998；Reubinoff等,Nat.Biotechnol.,18:399-404,2000)。
人胚胎干细胞通过在形成人胚胎形成时仅分离和培养内细胞团制备且，目前，全球制备的人胚胎干细胞已从灭菌操作后保留的冷冻胚胎获得。已有使用可分化成为全部细胞的全能人胚胎干细胞作为细胞治疗产物的多种尝试；然而，其尚未完全克服如致癌作用风险和免疫排斥等高的障碍。
近来，具有免疫调节功能和无肿瘤生成风险的间充质干细胞已作为用于解决该问题的备选方案出现。间充质干细胞是多能细胞，其能够分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞等，且已报道具有调节免疫响应的功能。可从多种组织分离并培养间充质干细胞，但其容量和细胞表面标记物取决于其来源而彼此不同。因此，明确定义间充质干细胞并不容易。然而，间充质干细胞一般通过如下定义：可分化成骨细胞、软骨细胞和肌细胞的细胞；具有螺旋形；且表达基本细胞表面标记物CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)和CD45(-)。
同时，为将间充质干细胞用作细胞治疗产物，需满足再生药物和/或细胞疗法领域所需的最小细胞数目(约1×109)。然而，当考虑用于设置合适条件和标准的实验时，实际需要的细胞数目进一步增加。
解决上述现有间充质干细胞培养系统的问题的最理想备选方案是使用人全能性干细胞以产生间充质干细胞。然而，目前为止，从人全能性干细胞分化成间充质干细胞的诱导需要通过特定细胞因子(例如BMP、bFGF)的诱导步骤，其花费高昂且需要对浓度进行控制，或需要在具有异种病原体风险的异种供体(OP9小鼠细胞系)上的诱导步骤和其后通过特定标记物(例如CD73)的分选。由于这些原因，间充质干细胞在再生药物和细胞疗法领域中用作理想细胞治疗产物具有局限性。
发明内容
技术问题
进行本发明以解决本领域中存在的上述问题，且本发明的目的是使用源自人胚胎干细胞的间充质干细胞开发用于预防和/或治疗肝纤维化和肝硬化的药物组合物或功能性保健食品。
然而，通过本发明实现的技术目的不限于上述目的，但本领域的技术人员从如下说明将显而易见地理解其他未提及的目的。
技术方案
为实现上述目的，本发明提供用于预防和/或治疗肝纤维化或肝硬化的组合物，其包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分。
本发明还提供用于缓解和/或预防肝纤维化和肝硬化的功能性保健食品，其包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分。
本发明还提供用于治疗肝纤维化或肝硬化的方法，其包括将源自人胚胎干细胞的间充质干细胞施用至受试者的步骤。
本发明还提供源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分用于治疗肝纤维化或肝硬化的用途。
优势作用
本发明的间充质干细胞可从所有人的全能干细胞通过分化获得，而无论其基因背景的差异，且具体地，可将其诱导以从人胚胎干细胞分化，并可通过增殖培养以大量产生。此外，本发明的间充质干细胞与常规源自骨髓的间充质干细胞相比对肝纤维化的预防具有优异效果，且因此可有效用作可预防和治疗肝纤维化或肝硬化的细胞治疗产物或功能性保健食品中的活性成分。
附图简述
图1是总结用TAA和间充质干细胞处理的测试动物的时间间隔和取样步骤的示意图。
图2显示对未处理的正常组(TAA-/E-MSC-)、用TAA处理以诱导肝纤维化的测试组(TAA+/E-MSC-)和诱导肝纤维化后用间充质干细胞注射的测试组(TAA+/E-MSC+)实施Masson三色(MT)染色的结果。此处，图2a显示MT染色结果的显微镜观察结果，图2b显示纤维化程度的数字量化结果。
图3显示对未处理的正常组(TAA-/E-MSC-)、用TAA处理以诱导肝纤维化的测试组(TAA+/E-MSC-)和诱导肝纤维化后用间充质干细胞注射的测试组(TAA+/E-MSC+)的肝组织实施Pico-Sirius红染色的结果。
图4显示对未处理的正常组(正常)、用TAA处理以诱导肝纤维化的测试组(仅TAA)和通过TAA处理诱导肝纤维化后用间充质干细胞注射的测试组(TAA+E-MSC)实施免疫组化的结果。
图5显示在图4所示的结果中，扩大并观察通过TAA处理诱导肝纤维化后用间充质干细胞注射的测试组(TAA+E-MSC)中与人特异型抗体HLA-abc反应部分的结果。
图6显示对未处理的正常组(TAA-/E-MSC-)、用TAA处理以诱导肝纤维化的测试组(TAA+/E-MSC-)和通过TAA诱导肝纤维化后用间充质干细胞注射的测试组(TAA+/E-MSC+)的肝组织测量肝毒性参数(AST和ALT)的结果。
图7显示对未处理的正常组(正常)、用TAA处理以诱导肝纤维化的测试组(TAA)和通过TAA诱导肝纤维化后用人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞注射的测试组(TAA+/E-MSC)，和通过TAA诱导肝纤维化后用骨髓衍生的间充质干细胞注射的测试组的肝组织实施MT染色、观察和量化评估的结果。
用于实施本发明的最佳模式
发明人已从人全能干细胞特别是人胚胎干细胞产生大量的间充质干细胞，且已发现产生的间充质干细胞具有针对肝纤维化的预防性作用，表明源自人胚胎干细胞的间充质干细胞可在用于保护肝脏和预防和治疗肝纤维化或肝硬化的组合物中有效用作活性成分，由此完成本发明。
此后，将对本发明进行详述。
本发明提供用于预防和/或治疗肝纤维化或肝硬化的组合物，其包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分。
本发明还提供用于治疗肝纤维化或肝硬化的方法，其包括将源自人胚胎干细胞的间充质干细胞施用至受试者的步骤。
根据本发明的间充质干细胞有效通过包括下列a)-c)步骤的方法产生，但不限于此：a)从人全能肝细胞形成胚体；b)将胚体附着至组织培养皿，并诱导附着的胚体以自发分化成间充质干细胞；且c)维持并增殖性培养由胚体分化诱导产生的间充质干细胞。
此外，从人全能干细胞形成胚体的步骤可根据本领域已知的方法实施。例如，该步骤可通过用蛋白酶处理人全能干细胞并以板或悬液状态在无bFGF(基础成纤维细胞生长因子)胚胎干细胞培养基中培养经处理的人全能干细胞来实施。
此外，间充质干细胞优选由包括下列步骤a)-c)的方法产生，但不限于此：
a)培养人全能干细胞12-16天以形成胚体；
b)在包含补充了FBS(胎牛血清)的基础DMEM(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)的培养基中培养胚体以诱导胚体分化成间充质干细胞；和
c)在维持间充质干细胞特性(identity)的同时增殖性培养间充质干细胞。
如本文使用，术语“干细胞”指可无限繁殖以形成组织或器官的特化的细胞的主细胞。干细胞是发育上全能或多能的细胞。干细胞可分裂以产生两个子干细胞，或一个干细胞和一个祖(“过度”)细胞，其随后增殖成组织成熟的完全成形的细胞。这种干细胞可以多种方式分类。根据分化能力(其为最常用于分类的方法)可将干细胞分为能够分化成三胚层的全能干细胞、能够分化成三胚层中一或多层的多能干细胞，和仅能够分化成某种胚层的单能干细胞。
如本申请使用的，“全能干细胞”指具有分化成生物体三胚层中任何的潜力的干细胞，且一般包括胚胎干细胞和诱导的全能干细胞(iPSs)。成人干细胞可分为多能干细胞和单能干细胞。
如本申请使用的，术语“分化”指其中细胞的结构或功能在分裂、增殖和其生长过程中特化的现象，即，生物体细胞或组织的特征和功能改变以实施给予细胞或组织的功能。一般而言，其指其中相对简单的系统分为两种或多种性质不同的部分系统的现象。例如，其意指任何生物系统的部分之间发生性质的差别(所述生物系统在最初彼此相同)，例如卵的部分间的差异如头或身体(其在个体发育中最初彼此性质上相同)发生，或细胞间差异如肌细胞或神经细胞发生，或作为其结果生物系统分为性质上可区别的部分或部分系统。
当全能干细胞无板或支持物在无bFGF(基础成纤维细胞生长因子)的胚胎干细胞培养基中悬浮培养时，可产生分化衍生物。如本领域报道，由该方法产生的分化衍生物可根据特定的诱导物分化成形成内胚层、中胚层和外胚层所需的全部细胞类型，且该方法是用于证明全能干细胞全能性的体外方法。
如本文使用，术语“细胞治疗剂”指用于治疗、诊断和预防目的的药物，其包含通过从人、培养物和特定操作(如由USFDA提供)分离制备的细胞或组织。具体地，其指通过体外倍增和分选活的自体、同种异体和异种细胞或通过用于恢复细胞和组织的功能的其他方式改变细胞的生物特征的一系列行为用于治疗、诊断或预防目的的药物。
根据本发明用于预防和/或治疗肝纤维化或肝硬化的组合物包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分，其可作为细胞单独或在温育器中在细胞培养后注射入患者身体。例如，Lindvall等(1989,Arch.Neurol.46:615-31)或DouglasKondziolka(DouglasKondziolka,Pittsburgh,1998)报道的临床方法可用于施用所述组合物。除可从源自人胚胎干细胞的间充质干细胞初始分化的脂肪、骨、肌肉，神经元、软骨和心肌细胞外，所述组合物的制剂可包括药物上可接受的常规载剂。对于注射，所述制剂可包含防腐剂、止痛剂、增溶剂、稳定剂等，且对于局部施用，所述制剂可包含基底(base)、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。
包含于本发明的药物组合物中的药物可接受载剂通常用于制剂中。其实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。除上述组分，本发明的药物组合物可进一步包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、芳香剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。
根据本发明的药物组合物可根据本领域的技术人员容易实施的方法使用药物可接受的载剂和/或赋形剂制备成单剂量形式或多剂量包装。此处，所述药物组合物的制剂可为在油或水性介质中的药物组合物的溶液、悬浮液或乳液，且可进一步包括分散剂或稳定剂。
根据本发明的药物组合物可肠胃外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)。优选地，根据本发明的药物组合物可通过心内注射施用。用于肠胃外施用的根据本发明的组合物(例如可注射溶液)可通过在药物可接受的载剂中的其分散液和/或溶液体内注射，例如，无菌纯化的水、约pH7的缓冲剂或盐水溶液。本发明的药物组合物可包括常规的添加剂如防腐剂、稳定剂等。
此外，在本发明中，注射的间充质干细胞的量并无特定限制，但可为104-1010细胞/注射，优选105-109细胞/注射，更优选5×107细胞/注射。本发明的药物组合物的优选剂量可取决于多种因素合适地选择，包括配制方法、施用方法、患者年龄、体重、性别、疾病的严重性、饮食、施用路径和时间、排泄速度和响应的敏感性。
如本文使用，术语“预防”指通过施用本发明的组合物抑制肝纤维化或肝硬化或延迟肝纤维化或肝硬化进展的全部活动。
如本文使用，术语“预防”或“防止”指与通过施用本发明的组合物抑制或延迟肝纤维化或肝硬化相关的各种活动。
如本文使用，术语“治疗”或“缓解”指通过施用本发明的组合物缓解或有益改变肝纤维化或肝硬化的各种活动。
除非另外表明，本文使用的术语具有与本发明所述领域的技术人员通常理解的相同的含义。
本发明的药物组合物可与已通常用于治疗或预防肝纤维化和肝硬化的治疗方法组合施用。
本发明还提供用于缓解和/或预防肝纤维化和肝硬化的功能性保健食品，其包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分。
如果根据本发明的源自人胚胎干细胞的间充质干细胞用作食品添加剂，这些细胞可单独添加或可适当地与根据常规方法的其他食品或食品成分一起使用。组合物中的活性成分的含量可根据使用的目的(预防、保健或治疗处理)适当确定。一般而言，基于原材料的总重量，源自人胚胎干细胞的间充质干细胞在食品或饮品生产过程中可以0.0001-30wt％，优选0.1-10wt％的量添加，但添加的源自人胚胎干细胞的间充质干细胞的量可依赖于其意欲的用途适当控制。对食品种类无特定限制。可添加源自人胚胎干细胞的间充质干细胞的食品的实例可包括肉、香肠、面包、巧克力、糖果(candies)、小吃、糖果(confectionery)、披萨、面条、口香糖、乳制品包括冰淇淋、多种汤、饮料(beverages)、茶、饮品(drinks)、酒精饮料和多种维生素制备物。
实施例
此后，本发明将参照实施例进一步说明。对本领域的技术人员显而易见的是这些实施例仅出于说明目的而不应理解为对本发明保护范围的限制。因此，本发明的实质性保护范围将通过所附权利要求和其等同物限定。
实施例1：源自人胚胎干细胞的间充质干细胞的产生
根据本发明的源自人胚胎干细胞的间充质干细胞根据下列方法构建和培养。
(1)胚体的形成
首尔国立大学医院(SeoulNationalUniversityHospital)中保持在未分化状态的人胚胎干细胞(东方#1，男性，STO补料器)用中性蛋白酶(dispase)(2mg/ml)处理并通过微操作分离，随后在无bFGF胚胎干细胞培养基中悬浮培养14天。
(2)分化成间充质干细胞的诱导
由14天的悬浮培养制成的胚体附于组织培养皿，且随后诱导附着的胚体自发分化成间充质干细胞。当胚体在包含10％(v/v)的FBS(胎牛血清)的DMEM(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)中培养16天时，观察到胚体分化成间充质干细胞的诱导。
(3)从分化的诱导产生的间充质干细胞的维持和增殖性培养
将实施例1-(2)中胚体附着后通过16天培养将从胚体分化的间充质干细胞通过用胰蛋白酶-EDTA(0.25％具有EDTA4Na的胰蛋白酶)处理解离成单细胞，且随后再次附着至组织培养皿。随后，将细胞维持并在500ml的培养基(EGM-2MV,CC4147,Lonza)中于37℃增殖培养，所述培养基包含470ml的基础培养基、0.5ml的hEGF(人表皮生长因子)、0.5ml的VEGF(血管内皮生长因子)、2ml的hFGF-B(人基础成纤维细胞生长因子)、0.5ml的IGF-1(胰岛素样生长因子)、0.2ml的氢化可的松和0.5ml的抗坏血酸。
实施例2：源自人胚胎干细胞间充质干细胞对肝纤维化的预防作用
为检查实施例1中产生的间充质干细胞是否具有预防肝纤维化的作用，测试动物用已知作为肝纤维化诱导剂的硫代乙酰胺(TAA；C2H5NS)处理以诱导肝硬化。此外，间充质干细胞心内注射入测试动物，且检查动物中的肝硬化是否得到缓解。
硫代乙酰胺(TAA；C2H5NS)是一种与CCl4或D-半乳糖胺相似的诱导细胞坏死或死亡的肝毒素，已知硫代乙酰胺干扰RNA从核迁移入细胞质由此诱导对细胞膜的损伤和细胞结构和功能的破坏。
具体地，用TAA(在0.9％正常盐水溶液中)以200mg/kg体重的剂量腹膜内注射免疫缺陷的小鼠(裸鼠，雄性、8-12周龄，OrientBio)，每周三次进行3周以诱导纤维化。在用TAA首次处理的24小时后，将实施例1中产生的5x104细胞的间充质干细胞通过心内注射施用至小鼠一次，且在用TAA最终处理后的24小时，从小鼠取样组织并进行分析(图1)。①视觉观察取样的组织以确定组织聚集程度，②通过使用组织切片的纤维化Masson三色(Masson’strichrome)染色分析以比较纤维化缓解程度，③使用人细胞特异性表达因子HLA-abc通过免疫组化分析以确定注射的间充质干细胞是否残余，且④测量肝毒性标记物(AST和ALT)。
2-1：纤维化(Masson三色(MT))染色
肝细胞的纤维化进展时，合成胶原以填充损伤的位点，而MT染料与胶原反应以显色标记纤维化部分的蓝色。通过MT染色分析获得的组织样品以检查纤维化的程度。
具体地，以下列方式实施MT染色。
将用石蜡固定的组织切片脱蜡，且随后用Bouin氏溶液固定并用Weigert氏铁苏木精Biebrich猩红酸性品红苯胺蓝溶液或2％亮绿染色，之后进行观察。纤维组织显示为蓝色，且细胞质、肌肉和角蛋白显示为红色，且细胞核显示为深褐色。
结果，如图2a和2b所示，用TAA处理以诱导肝纤维化的组(TAA+/E-MSC-)与未处理的正常组(TAA-/E-MSC-)相比显示了蓝色区域的增加，且用间充质干细胞治疗的组(TAA+/E-MSC+)与TAA+/E-MSC–组相比显示蓝色区域的显著减少。
此外，如图2a所见，已观察到在用TAA处理以诱导肝纤维化的组织中，由于肝纤维化形成了团块和表面异常，且该现象通过间充质干细胞的注射有所改善。
2-2.Picro-Sirius红染色
当干细胞的纤维化进展时，合成胶原以填充损伤位点，且MT染料与胶原反应以显色标记纤维化部分的蓝色。获得的组织样品通过Picro-Sirius红染色分析以检查纤维化的程度。
Picro-Sirius红染色是标记待检查的纤维化的方法，如MT染色。使用这两种染色方法一式两份以检查纤维化抑制的程度。
作为结果，以下列方式实施Picro-sirius红染色。
将石蜡组织切片脱蜡，且随后用Picro-sirius红染色1小时且用水洗涤，随后干燥并固定。
作为结果，如图3所见，用TAA处理以诱导肝纤维化的组(TAA+/E-MSC-)与未处理的正常组(TAA-/E-MSC-)相比显示红色区域的增加，且用间充质干细胞治疗的组(TAA+/E-MSC+)与TAA+/E-MSC–组相比显示了红色区域的显著减少。
2-3:HLA-abcIHC染色
为检查实施例2-1和2-2中确认的肝纤维化缓解效果是否归因于注射入动物的人间充质干细胞，使用人细胞特异性表达因子HLA-abc实施了免疫组化，由此确定残留在组织样品中的间充质干细胞是否显示肝纤维化缓解效果。
具体地，使用人特异性表达抗原HLA-abc以下列方式实施了IHC染色。
抗原抗体反应后，用生物素第二抗体处理组织样品。用链霉亲和素-HRP处理后，将组织样品用底物色原体溶液染色以显褐色。具体地，使用VectorlabR.T.U试剂盒的IHC试剂盒(Vector,目录#PK-7800)实施IHC染色，且使用从Abcam购买的HLA-abc。此外，将包括于试剂盒中的泛特异性通用二抗用作二抗，并将DAB(VectorlabNOVA红DAB底物试剂盒目录#SK-4800)用于显色。
作为结果，如图4所见，在正常组和用TAA处理以诱导肝纤维化的组(仅TAA)的肝组织中，未观察到褐色反应，但在TAA处理以诱导肝纤维化后用间充质干细胞注射的组(TAA+E-MSC)的组织中观察到褐色反应，指示发生了抗原抗体反应。组(TAA+E-MSC)的组织的放大观察显示治疗的间充质干细胞的移入(图5)。
2-4：肝毒性参数的测量(AST和ALT)
为进一步确认由如实施例2-1至2-3中所确认的肝纤维化的进展引起的肝毒性减轻的效果，对在未处理的正常组(TAA-/E-MSC-)、用TAA处理以诱导肝纤维化的测试组(TAA+/E-MSC-)、和通过TAA处理诱导肝纤维化后用间充质干细胞注射的测试组(TAA+/E-MSC+)中测量作为肝毒性参数的AST(天冬氨酸氨基转移酶)和ALT(丙氨酸氨基转移酶)。氨基转移酶是存在于任何组织中的一种酶，且细胞内氨基转移酶活性高于血清氨基转移酶活性。因此，如果组织损伤，则酶氨基转移酶释放入血液使得氨基转移酶活性增加。然而，由于该酶具有高分子量(约100,000Da)，酶从损伤细胞迁移入血液受到阻碍。因此，如果肝脏、心肌、肌肉和血细胞(其中该酶可容易释放入血液)收到损伤，血清氨基转移酶活性增加，但如果其他器官损伤，则血清氨基转移酶活性基本上不增加。
使用已知方法测量AST和ALT。具体地，使用其中酶活性基于显色剂的变化而数字量化的方法，所述显色剂添加至分离自收集的血液的血清中AST和ALT底物的降解过程中发生的反应。
作为结果，如图6中可见，在第21天，用TAA处理以诱导肝纤维化的组中AST和ALT显著增加，而诱导肝纤维化后用间充质干细胞注射的组中AST和ALT显著减少。
这表明本发明的间充质干细胞对肝纤维化的预防和治疗显示优异的效果。
实施例3：人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞和骨髓衍生的间充质干细 胞之间效果的比较
比较性评估实施例1中产生的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞和骨髓衍生的间充质干细胞之间对肝纤维化的缓解效果。
除使用骨髓衍生的间充质干细胞来取代人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞外，以实施例2-1中所述的相同的方式实施MT染色。
作为结果，如图7中可见，通过TAA处理诱导肝纤维化后用人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞注射的测试组(TAA+E-MSC)与用骨髓衍生的间充质干细胞注射的测试组(TAA+BM-MSC)相比显示减少的蓝色染色区域。这表明本发明的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞对肝纤维化的缓解具有更佳效果。
工业实用性
根据本发明，本发明的间充质干细胞与常规的骨髓衍生的间充质干细胞相比对预防肝纤维化具有优异的效果，且因此其可能提供细胞治疗产品或功能性保健食品，其能够预防和治疗肝纤维化或肝硬化。
尽管已提及具体特征对本发明进行详细描述，但对本领域的技术人员显而易见的是此描述仅用于优选的实施方案而非限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围会通过所附权利要求和其等同物来进行限定。

Claims (3)

1.一种用于预防和/或治疗肝纤维化或肝硬化的组合物，其包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分。
2.一种用于缓解和/或预防肝纤维化和肝硬化的功能性保健食品，其包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分。
3.一种用于治疗肝纤维化或肝硬化的方法，其包括将源自人胚胎干细胞的间充质干细胞施用至受试者的步骤。
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