KR102175493B1 - 인간 자궁 경부 줄기세포 집단 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 자궁 경부 조직으로부터의 세포 현탁액을 제조하는 단계를 포함하는 줄기세포 분리 방법, 상기 방법에 의해 분리된 상기 줄기세포, 및 상기 줄기세포의 배양물로부터 획득된 조건 배지(Conditioned medium)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암, 전암 병변, 염증성 질환, 자가 면역 질환, 만성 병리 또는 감염성 질환, 조직 손상 관련 질환의 치료 또는 예방, 또는 임신 장애의 진단, 예측 또는 치료 뿐만 아니라 미용 치료를 위한 상기 줄기세포 또는 조건 배지의 용도를 포함한다. 따라서, 본 발명은 줄기세포의 분야 및 이들의 치료적 또는 미용적 용도에 관한 것이다.

Description

인간 자궁 경부 줄기세포 집단 및 이의 용도{HUMAN UTERINE CERVICAL STEM CELL POPULATION AND USES THEREOF}
본 발명은 자궁 경부 조직으로부터의 세포 현탁액을 제조하는 단계를 포함하는 줄기세포 분리 방법, 상기 방법에 의해 분리된 상기 줄기세포, 및 상기 줄기세포의 배양물로부터 획득된 조건 배지(Conditioned medium)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암, 염증성 질환, 자가 면역 질환 만성 병리 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방용 뿐만 아니라 미용 치료용 상기 줄기세포 또는 조건 배지의 용도를 포함한다. 따라서, 본 발명은 줄기세포의 분야 및 이들의 치료적 또는 미용적 용도에 관한 것이다.
줄기세포는 자기 재생(self-renew) 및 다양한 계통 경로를 따라 분화할 수 있는 능력을 특징으로 한다. 치료적 적용을 위한 성체 줄기세포의 특정 유망한 유형은 소위 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)이다. 다분화능 중간 엽 기질 세포(multipotent mesenchymal stromal cells)로도 정의되는 중간엽 줄기세포는, 플라스틱-접착 세포와 같이 체외에서 증식하는 세포들의 이종 군집(heterogeneous population)이고, 섬유 아세포와 같은 형태를 가지며, 체외에서 콜로니를 형성하고 골 세포, 연골 세포 및 지방 세포와 같은 중배엽 계통의 세포뿐만 아니라 다른 배아 계통의 세포로 분화할 수 있다.
줄기세포는 줄기세포의 자가 재생 및 조직 재생 간의 균형을 조정하는 니치(niche)에 존재하는 것으로 여겨진다. 줄기세포 니치의 개념은 본래 포유류 조혈(hematopoiesis)을 참조하여 설명되었고, 상기 니치는 조혈 줄기세포를 하우징하고 이의 지속적인 존재를 보장하는 특정 미세환경을 나타낸다. 니치 내 지지세포들은 그들의 분비 산물들과 함께 상호 작용 및 줄기세포 거동(stem cell behavior)을 지배하는 것으로 제시되었다. 줄기세포의 활성을 지지하기 위해서, 이 모델에 따라, 니치 내의 조건을, 임의의 외부 활성화 신호가 없는 경우 줄기세포 휴지기는 유지하나, 필요한 경우 전구세포의 증식 및 성숙은 촉진되도록 할 수 있고, 또한 상기 줄기세포 풀(stem cell pool)이 자가 재생되도록 할 수 있다.
배아 중배엽으로부터 유래된 연조직 다능성 성체 세포의 서로 다른 군집의 존재는 여러 저자들에 의해 보고된 바 있다. 예를 들어, 다능성 세포는 포유 동물의 골격근 및 다른 연결 조직, 인간 지방 흡입 조직 또는 골수[소위 다능성 성체 전구세포(Multipotent Adult Progenitor Cells, MAPC)]로부터 수득할 수 있다고 보고되었다. 원칙적으로, 모든 이러한 분리된 세포 집단은 골수의 MSC와 유사한 방식으로 결합 조직의 복구 및 재생에 이용될 수 있다. 그러나, MAPC를 제외하고, 현재까지 이러한 군집 중 어느 것도 표현형 수준에서 충분히 특징되는 것이 없었다. 따라서, 다능성 성체 세포의 존재가 다른 결합 조직에서 설명되었으나, 당업계의 현재 상태에서, 연조직으로부터 얻은 다른 다능성 세포 유형들을 식별하고 명백하게 구별하거나, 순수한 군집을 실질직으로 얻는 것은 불가능하다. 현재, 줄기세포의 표현형 특성은 다른 것들 중에서 세포 표면 수용체와 같은 마커에 의한 결정; 및 체외 배양에서 분화에 대한 이들의 능력에 의한 결정을 포함한다. 각각의 세포 유형은 표면 마케의 특정 조합, 즉, 다른 것으로부터 구별되는 특정 세포 유형을 특징으로 하는 발현의 특정 프로파일을 갖는다,
성체 줄기세포의 이상적인 공급원은 그들이 쉽고 비-침습적인 방법으로 수득 될 수 있고, 충분한 수의 세포들이 분리될 수 있는 것이다. 특히, 공급원은 상당한 위험 및 불편없이 생체로부터 쉽게 분리될 수 있는 줄기세포가 제공되도록 해야 하고, 상기 공급원은 분리 및 배양시 과도한 비용없이 다른 세포 유형으로부터 최소의 오염으로 고수율로 수득되도록 해야 한다.
골수(bone marrow, BM)가 다능성 MSCs의 분리에 대한 주요 공급원이었으나, 지방 조직은 BM의 수집이 아닌 이러한 세포의 다른 공급원이고 지방 조직은 매우 침습적인 방법이다. 다른 대체 공급원은 제대혈(umbilical cord blood)로서, 이는 어머니 또는 유아에게 유해하지 않고, 덜 침습적인 방법에 의해 얻을 수 있다. MSCs의 다른 공급원은 태반, 두피 조직 및 장 줄기 세포를 비롯한 다양한 다른 인간의 성체 조직에서 확인되었다. BM, 지방 조직 또는 제대혈(UCB)로부터 분리된 모든 세포들은 전형적인 MSC 특성을 나타낸다: 섬유아세포(fibroblastoid) 형태, CFU-F(colony-forming-unit-fibroblasts)의 형성, 다능성 분화능, 및 표면 단백질의 전형적인 세트의 발현. 3 가지 공급원으로부터 분리된 MSCs가 전형적인 MSC 마커 단백질을 발현하는 반면, CD90, CD105 및 CD106의 발현에 관해서는 유의한 차이가 관찰되었다. 따라서, MSCs는 이들 공급원의 다른 표현형을 보여줄 수 있다.
골수를 획득하는 과정은 고통스럽고 수율도 매우 낮으며, 임상적으로 관련된 양을 얻기 위해서는 생체 외 증식으로 상당히 증가된 세포 수가 필요하다. 이 단계는 비용을 증가시키고, 오염의 위험 및 물질의 손실이 증가될 뿐만 아니라 시술 시간을 소요된다. 이러한 이유로, 골수 이외 간엽 조직에서 다능성 세포를 분리할 수있는 것이 매우 바람직할 것이다. 특히, 이들의 외과적 접근성을 감안할 때, 피부, 지방 및 근육 조직과 같은 비-골연골 중배엽 조직으로부터 세포를 분리할 수 있는 것이 편리하지만, 이에 한정되지 않는다.
따라서, 당업계에서는 비-침습적 무통 채취하여 줄기세포의 대체 공급원을 제공하는 것에 대한 필요성이 존재한다. 이러한 의미에서, 자궁은 줄기세포의 공급원이 될 수 있다. 그러나, 자궁은 상이한 부분으로 분할되는 복잡한 기관이다. 구체적으로는, 인간 자궁은 상부 근육 자궁 체부(uterine corpus)와 질 내로 연장되는 하부 섬유 경부로 구분될 수 있는 섬유근성(fibromuscular) 기관이다. 자궁체(corpus uteri)는 기저부(fundus)와 자궁 동맥의 줄기 및 자궁 경부의 내부 os 수준과 거의 가까이 놓인 자궁하분절(lower uterine segment)(또는 협부)로 나눠진다. 자궁 경부(cervix)는 질(vagina)과 함께 하부 말단 및 상부 말단으로 연결되는 좁은 원통형 통로이고, 자궁 경부가 넓어지며 자궁하분절(협부)을 형성하고; 자궁하분절은 차례로 자궁 기저부쪽으로 넓어진다(도 18). 부인과 검사 중에 질 내부에서 볼 수 있는 경부 하단부는 자궁경질부(ectocervix)로 알려져 있다. 외부 os로 알려진 자궁경질부의 중앙에 있는 개구부는 자궁 및 질 사이에 통로를 허용하도록 열려있다.
자궁경내막(endocervix)은 외부 os에서부터 자궁으로 자궁 경부를 통과하는 터널인 자궁내경관(endocervical canal)을 둘러싸고 있다(도 19). 자궁경내막 및 자궁경질부 사이의 겹쳐지는 경계를 변형대(transformation zone)라고 한다. 변형대는 본 발명의 줄기세포가 바람직하게 수집되는 영역이다.
저명한 캐나다 조직학자인 아서 워드 햄은 많은 실무자들이 필수로 참조하는 그의 저서 "조직학"((Ham, A.W. and Cormack, D.H. Ham's Histology, 9th ed. Philadelphia: Lippincott, 1987)에서 자궁체 및 자궁 경부의 다른 조직층에 대하여 설명하고 있다. 인간 자궁체는 하기 세 가지 조직층으로 구성된다: 1) 자궁 내막(endometrium)으로 불리는 내부 층으로, 가장 활성화된 층이며 난소 호르몬의 변화에 대하여 반응하고; 자궁 내막은 매우 특성화되며, 생리 및 생식 기능에 필수적이고(이 조직 층으로부터 유래된 자궁 내막 줄기 세포); 2) 중간층 또는 자궁 근층(myometrium)은 자궁 체적의 대부분을 구성하고, 주로 평활근 세포로 구성된 근육층이며(이 조직 층으로부터 유래된 자궁 근층 줄기 세포); 3) 장막 또는 자궁외막(perimetrium)인 자궁의 외층은 자궁을 감싸는 상피 세포로 이루어지는 조직의 얇은 층이다. 그러나, 자궁 경부 벽과 관을 둘러싼 막 모두는 자궁체와는 다른 특성을 가지고 있다. 실제로, 경부 벽은 주로 결합 조직에 의해 구성된다. 자궁 경부는 편평 상피 세포로 알려진 얇은 평면 비늘세포로 이루어진 점막으로 알려진 내부선및 장막(미끄러운 외막)으로 알려진 외곽선으로 구성된다. 또한, 자궁하분절 또는 협부로 불리는 자궁 경부와 만나는 자궁체 부위의 벽은 주로 평활근으로 구성된다. 따라서, 조직학 및, 자궁의 이들 두 부분의 기능(자궁하분절을 포함하는 자궁체, 및 자궁 경부)이 다르다.
국제 출원 WO2011/042547은 자궁 근층 조직, 특히, 기저부 및 자궁하분절을 포함하는 자궁체라고 부르는 상기 자궁 경부 부위로부터 줄기세포를 제공하는 방법을 개시한다. 또한, 저자는 자궁 근층 이식편(explants)이 박리(exfoliation)에 의한 자궁체의 자궁하분절로부터 획득된 것임을 언급했다. 상술한 바와 같이, 자궁하분절은 자궁경부의 상부 말단이고 해부학 및 조직학적으로 자궁경부와 상이한 자궁체의 일부로 간주된다. 그러나, 자궁 내막 층이 이 수준으로 감소되기 때문에 하부 자궁체의 벽은 주로 자궁 근층 조직으로 구성된다는 것으로 고전적으로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 자궁 경부의 외부 벽은 주로 결합 조직으로 구성되어 있다. 따라서, 자궁 경부의 표면 세포학적 샘플링으로 자궁 근층 조직을 얻을 수 없다. 따라서, 생체 물질은 생검, 자궁 근층 조직편, 자궁 근층 이식편 또는 자궁 근층까지 닿을 수 있는 고급의 박리를 필요로 하는 자궁 박리에 의해 획득된다. 따라서, 조직 샘플은 자궁 근층 전구체를 분리하는데 이용하기 전에 자궁 내막, 장막, 지방 및 섬유 조직으로 정돈하였다. 국제 출원 WO2011/042547에 기재된 줄기세포 집단은 조혈 계통으로부터의 표면 마커인 CD31, CD34 및 HLA-DR와 같은 표면 마커를 발현한다. 반면, 중간엽 줄기세포는 이러한 조혈 마커를 발현하지 않았다.
배지 아스트리드 C 및 동료(Baege Astrid C et al. Proc Amer Assoc Cancer Res Annual Meeting. Vol 47, 2006: 938)들은 중간엽 줄기세포와 다른, 상피 줄기 세포로 추정되는 줄기세포의 분리를 개시한다. 상기 세포 집단의 인간 유두종바이러스-유도 자궁 경부 암 발생에 있어서의 잠재적인 역할의 관련성을 개시하고 있음을 아는 것이 중요하다.
또한, 마루야마 T 등 (Maruyama T et al. Reproduction; 2010; 140:11-22)은 자궁의 생리 및 병리에 있어 자궁 내막 및 자궁 근층 줄기/전구 세포의 역할을 개시하고 있으나, 이 문헌에서는 중간엽 자궁경부 줄기세포를 언급하고 있지 않다. 상술한 바와 같이, 상기 근육층은 자궁체의 중간층이고, 그것은 자궁 체적의 대부분을 차지하며, 주로 평활근 세포로 구성된 근육층이다.
한편, 로페즈 J 등 (Lopez J et al. Open Virol J. 2012; 6: 232-240) 및 시아오천 S 등 (Xiaochun S et al. Cell Biol Int. 2011;35:119-123)은 인간 자궁암에서 분리 및 동정된 줄기세포를 개시한다. 이러한 줄기세포의 단점은 종양 성장에 기여한다는 것이다. 그런 의미에서, 중간엽 줄기세포가 암 줄기세포 니치(niches)의 구성요소이었고 따라서, 종양 세포의 성장을 지원하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 개시하고 있다(Ramasamy R et al., Leukemia, 2007). 따라서, 종양 조직으로부터 분리된 줄기세포는 종양 특성 및 다른 특성에 있어 정상 조직에서 분리한 줄기 세포에 비해 차이점을 나타낸다.
본 발명자들은 자궁 경부 조직이 줄기 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 이 조직에서 분리한 세포인 자궁 경부 줄기 세포(uterine cervical stem cells, UCESC)은, 다른 조직에서 분리된 다른 중간엽 줄기 세포보다 더 높은 항-염증 활성, 항-종양능, 항균 활성 및 성장율을 나타내고, 최소 10 세포 계대 동안 이들의 기능 및 안정적인 핵형을 유지할 수 있다. 추가적으로, 줄기 세포의 새로운 공급원은 일반적인 부인과 검사 중에 상기 장기를 박리하여 상기 조직을 얻을 수 있으므로 비-침습 및 무통증 방법에 의하여 중간엽 줄기 세포를 분리시킬 수 있다.
본 발명자들은 줄기 세포의 새로운 공급원 및 그것으로부터 얻어지는 세포를 기반으로 하여 본 발명을 개발하였고 하기에서 본 발명의 양태를 상세히 개시한다.
본 발명의 방법
상술한 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 자궁 경부 조직, 바람직하게는 비-종양성 자궁 경부 조직이 줄기 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 줄기 세포를 분리하는 방법에 관한 것으로서, 본 명세서에서 "본 발명의 방법"은 다음을 포함한다:
(a) 자궁 경부 조직으로부터 세포 현탁액을 제조하는 단계,
(b) 상기 세포 현탁액으로부터 상기 세포들을 회수하는 단계,
(c) 세포들이 증식할 수 있는 적합한 세포 배양 배지 및 조건 하에서 상기 세포들을 인큐베이션하는 단계, 및
(d) 상기 줄기 세포를 선별하는 단계.
단계 (a)-(d)는 당업자에게 공지된 통상의 기술에 의해 실시될 수 있다. 줄기 세포의 본 새로운 공급원이 추가적인 장점은 비-침습 및 무통증 방식으로 동물 체에서 줄기 세포를 얻는 수 잇다는 것이다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "비-침습"은 피부가 손상되지 않고, 체강에 부인과 검사용 일반적인 도구가 아닌 도구를 사용하지 않는 과정을 지칭한다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "무통증"은 신체적 통증을 유발하지 않는 과정을 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법은 상기 분리된 줄기 세포의 공급원이 자궁 경부이므로 줄기 세포를 분리하는 비-침습적이고 통증을 유발하지 않는 방법이다.
따라서, 첫번째 단계[단계 (a)]에서, 본 발명의 방법은 자궁 경부 조직으로부터 세포 현탁액을 제조하는 단계를 포함한다.
용어 "자궁 경부 조직"은 자궁 경부로부터 나오는 조직, 즉, 질에서부터 자궁체와 공동을 구분하는 기관을 의미한다. 자궁 경부(cervix)는 질과 함께 하부 말단 및 상부 말단으로 연결되는 좁은 원통형 통로이고, 자궁 경부가 넓어지며 자궁하분절(협부)을 형성하고; 자궁하분절은 차례로 자궁 기저부쪽으로 넓어진다(도 18). 부인과 검사 중에 질 내부에서 볼 수 있는 경부 하단부는 자궁경질부(ectocervix)로 알려져 있다. 외부 os로 알려진 자궁경질부의 중앙에 있는 개구부는 자궁 및 질 사이에 통로를 허용하도록 열려있다. 자궁경내막(endocervix)은 외부 os에서부터 자궁으로 자궁 경부를 통과하는 터널인 자궁내경관(endocervical canal)을 둘러싸고 있다(도 19). 자궁경내막 및 자궁경질부 사이의 겹쳐지는 경계를 변형대(transformation zone)라고 한다. 변형대는 본 발명의 줄기세포가 바람직하게 수집되는 영역이다.
자궁 경부 조직은 생검과 같은 침습적 방법, 및 자궁 경부의 박리와 같은 비-침습적 방법 모두로 침윤성, 동물체로부터 조직을 제거하기 위하여 본 기술 분야에서 당업자에 의해 공지된 임의의 통상적인 방법에 의해 얻을 수 있다. 바람직하게는, 자궁 경부 조직은 일반적인 부인과 검사 중에 자궁 경부를 박리하여 얻는 것이며, 이는 줄기 세포를 수득하는 비-침습적 및 무통증 방법이다. 자궁 경부 조직은 임의의 적합한 포유류, 예를 들면, 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 말, 영장류 등, 바람직하게는 인간으로부터 획득할 수 있다.
자궁 경부 조직이 획득되면, 물질의 나머지로부터 본 발명의 세포를 분리하기 위해 처리되기 전에 바람직하게 세척한다. 프로토콜에서, 자궁 경부 조직은 생리적-호환가능한 식염수(예를 들면, 인산염 완충 식염수(PBS)) 또는 무-혈청 배지에서 유지된다. 자궁 경부 조직의 특별한 특성으로 인해, 특정 구현예에서, 본 발명의 방법의 단계 (a)는 자궁 경관 점액을 효소적으로 분해하는 단계를 포함한다. 자궁 경관 점액을 분해할 수 있는 임의의 효소(예, 콜라게나제, 디스파제, 트립신, 등)는 본 방법에 사용될 수 있다. 효소 처리의 양과 지속 시간은 사용 조건에 따라 달라질 수 있지만, 이러한 효소의 사용은 일반적으로 당해 분야에 공지되어있다. 대안적으로 또는 효소적 처리와 함께, 자궁 경관 점액은 기계적 교반, 음파 에너지, 열 에너지 등의 다른 처리를 사용하여 분해될 수 있다. 효소적 방법에 의해 분해가 달성되는 경우, 적합한 기간에 따라 효소를 중화하여 세포에 해로운 영향을 최소화하는 것이 바람직하다.
분해 단계는 전형적으로 응집 세포의 슬러리 또는 현탁액 및 일반적인 자유 간질 세포(예컨대, 적혈구 세포, 내피 세포, 섬유 아세포 세포 및 줄기 세포)를 함유하는 유체 분획(fluid fraction)을 생성시킨다. 본 방법의 다음 단계[단계 (b)]는 상기 세포 현탁액으로부터 상기 세포들을 회수하는 단계이며, 이는 나머지로부터 응집된 세포액을 분리하는 것을 의미한다. 이것은 상층액에 덮힌 펠릿으로 세포에 힘을 가하는 원심 분리에 의해 달성될 수 있다. 이어서 상층액을 버리고 펠렛은 생리적-호환가능한 액체에 현탁될 수 있다. 또한, 현탁된 세포는 전형적으로 적혈구를 포함하고, 대부분의 프로토콜에서 그들을 용균하는 것이 바람직하다. 적혈구를 선택적으로 용해시키기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 임의의 적합한 프로토콜을 이용할 수 있다(예를 들면, 저장성 또는 고장성 배지에서의 인큐베이션, 암모늄 클로라이드 등을 이용한 용해). 물론, 적혈구가 용해되어 있는 경우, 남은 세포를 용해물로부터 분리, 예를 들면 여과, 침강, 원심 분리 또는 밀도 분획해야한다. 현탁된 세포를 세척하고, 한번 이상 연속적인 시간을 재원심분리하여 고순도를 달성할 수 있다. 대안적으로, 세포는 세포 표면 마커 프로파일 또는 세포 크기 및 입도(granularity)를 기반으로 하여 분리될 수 있다.
세포 현탁액으로부터 세포를 회수한 후, 세포들이 증식할 수 있는 적합한 세포 배양 배지 및 조건 하에서 상기 세포들을 배양한다[단계 (c)]. 바람직하게는, 세포는 적당한 세포 밀도와 배양 조건에서, 적합한 세포 배양 배지를 이용하여, 분화하지 않고 배양될 것이다. 따라서, 세포는 적합한 세포 배양 배지[예를 들면, 소 태아 혈청(fetal bovine serum), 소 태아 혈청(fetal calf serum), 갓 태어난 송아지 혈청, 송아지 혈청, 돼지 혈청, 양 혈청, 말 혈청, 인간 혈청 또는 인간 혈청, 인자, 아미노산, 등과 같은 적합한 혈청 5-25%(예를 들어, 20%)로 일반적으로 보충된 DMEM, DMEM-F12, 알파-MEM, RPMI] 존재 하에서 고체 표면에서 분화없이 배양되어, 세포가 증식할 수 있는 조건하에서 인큐베이션시킨다. 배양 조건은, 예를 들면, pH, 온도 등, 당업계의 당업자에게 일반적인 상식이다. 바람직하게는, 세포는 세포가 고체 표면에 부착하고 증식할 수 있는 고체 표면 및 조건하에서 배양된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "고체 표면(solid surface)"은 본 발명의 세포가 부착할 수 있는 임의의 물질을 말한다. 예를 들어, 상기 물질은, 그 표면에 포유 동물 세포의 접착을 촉진하기 위해 처리된 배양 접시 또는 세포 배양 플라스크와 같은 플라스틱 물질이고, 예컨대, 젤라틴, 피브로넥틴, 폴리-D-라이신 또는 다른 시약으로 선택적으로 코팅된 시판되는 폴리스티렌 플레이트이다. 인큐베이션 후, 비-부착 세포 및 세포 조각을 제거하기 위해 세포들을 세척한다.
세포가 증식되면, 이것들은 적절한 컨플루엔스(confluence), 통상적으로 약 80% 세포 컨플루엔스에 도달할 때까지, 필요한 경우 세포 배양 배지를 교체하여 동일한 배지 및 동일한 조건 하에서 배양을 유지할 수 있다. 원하는 세포 컨플루엔스에 도달한 후, 트립신과 같은 분리제 및 적당한 세포 밀도(일반적으로 2,000-10,000 세포/cm2)로 더 큰 세포 배양 표면으로의 분주를 이용하는 연속적인 계대를 이용하여 세포는 증식될 수 있다. 따라서, 세포는 여전히 그의 발달 표현형은 유지하면서, 분화하지 않고 그러한 배지에서 최소 두 번 계대된다. 보다 바람직하게는, 세포는 발달 표현형을 상실하지 않고 최소 10 번(예컨대, 최소 15 번 또는 최소 20 번) 계대될 수 있다. 전형적으로, 상기 세포는 약 100 세포/cm2 내지 약 100,000 세포/cm2(예컨대 약 500 세포/cm2 내지 약 50,000 세포/cm2, 또는 보다 특히, 약 1,000 세포/cm2 내지 약 20,000 세포/cm2 사이) 사이와 같은 원하는 밀도로 플레이팅한다. 낮은 밀도(예를 들어, 약 300 세포/cm2)로 플레이팅하는 경우, 세포는 보다 쉽게 동일하게 분리할 수 있다. 예를 들어, 몇일 후 상기 농도로 플레이팅된 세포들은 균질 집단으로 증식할 것이다.
마지막으로, 본 방법은 상기 줄기 세포를 선별하는 단계[단계 (D)]를 포함한다. 상기 줄기 세포는 면역세포화학법(ICC), 유세포 계측법(Flow cytometry) 등과 같은 임의의 통상적인 방법으로 선별될 수 있다. 면역세포화학법은 세포(배양된 세포, 세포 현탁액) 내에서 특정 단백질 또는 항원의 존재를 평가하기 위해 사용되는 기법이며, 그에 결합하는 특정 항체를 이용하여 현미경 하에서 시각화 및 검사할 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 염색된 세포들은 고체 지지체에 부착될 수 있어 여러 가지 방법에 의해 달성될 수 있는 후속 과정에서 취급이 용이할 수 있다: 부착 세포들은 현미경 슬라이드, 커버 슬립, 광학적으로 적합한 플라스틱 지지체 등에서 성장될 수 있다. 한편, 유세포 계측법은, 유체의 흐름에 세포를 현탁하고 전자 검출 장치에 그들을 통과시킴으로써 세포 계수, 정렬, 바이오마커 검출 및 단백질 공학에 이용되는 레이저 기반의 생물리학적 기술이다. 유세포 계측법의 특정화된 유형은 형광-활성 세포 분리(fluorescence-activated cell sorting) 또는 FACS이다. 특정 광 산란과 각 세포의 형광 특성을 기반으로 하여, 한 번에 하나의 세포를 둘 이상의 용기 내로 생물학적 세포의 이종 혼합물을 선별하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 당업자에게 널리 공지되었을 뿐만 아니라, 예를 들면, 세포 표면 마커와 같은 세포 마커로 줄기 세포를 식별하거나 선별하기 위해 검출된다.
원하는 경우, 임의의 단계와 줄기 세포를 분리하는 절차는 수동으로 실시될 수 있다. 대안적으로, 세포를 분리하는 과정은 제작 및/또는 당업계에 공지된 하나 이상의 적합한 장치를 통해 자동화될 수 있다. 실시예 1에 인간 자궁 경부 조직으로부터 본 발명의 세포 분리를 상세하게 설명한다. 본 발명의 방법의 결과로서, 자궁 줄기 세포의 동종 세포 집단을 얻을 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 상기 분리된 줄기 세포는 다음과 같다:
(a) 세포 마커 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, 비멘틴(vimentin), 사이토케라틴(cytokeratin)(CKAE1AE3), Klf4, Oct4 및 Sox-2를 발현하고,
(b) 데스민(desmin), 액틴 HHF35, β-카테닌, p63, E-카드헤린(cadherin), CD117, CD133, HLA-DR, TRA1-81, CD45, CD34 및 CD31로 이루어진 군으로부터 선택된 최소 1 종의 세포 마커를 발현하지 않는다.
목적 표현형의 확인은 통상적인 수단을 사용하여 실시될 수 있다. 세포 마커, 예를 들면, 세포 표면 마커는, 일반적으로 양성/음성 선별을 기반으로 하는 임의의 적합한 통상적인 기술에 의해 식별될 수 있고, 예를 들면, 다른 기술들을 이용할 수 있으나, 세포 내 존재/부재를 확인해야하는 세포-표면 마커에 대한 단일 클론 항체들을 이용할 수 있다.
CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, 비멘틴, 사이토케라틴(CKAE1AE3), Klf4, Oct4 및 Sox-2 세포 마커에 대한 단일 클론 항체들을 이용하여 선별된 세포 내 세포 마커의 존재(또는 상기 마커들의 검출가능한 발현 수준)를 확인할 수 있고, 데스민(desmin), 액틴 HHF35, β-카테닌, p63, E-카드헤린(cadherin), CD117, CD133, HLA-DR, TRA1-81, CD45, CD34 및 CD31로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 마커들의 최소 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개에 대한 단일 클론 항체들을 이용하여 이들의 부재를 확인할 수 있다. 상기 단일 클론 항체들은 공지된 것들고, 상업적으로 판매되거나 통상적인 방법으로 당업계의 당업자에 의해 획득될 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 상기 분리된 줄기 세포는 추가적으로 다음과 같이 나타난다:
(a) 성장 배지에서 24 시간 당 0.4 내지 2.1 세포 분열 증식 속도,
(b) 섬유 아세포와 같은 형태,
(c) 최소 10 계대 동안 안정적인 핵형,
(d) 단층으로 성장하고 기판에 부착할 수 있는 능력,
(E) 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포 계통으로 분화 될 수 있는 능력,
(F) 비-종양(non tumorigenic) 생성능 및/또는
(g) 구(spheres) 형성 능력.
다른 특정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 상기 방법은 비-종양성 자궁 경부 조직인 자궁 경부 조직을 특징으로 하며, 바람직하게는 비-종양성 포유류 자궁 경부 조직이고, 보다 바람직하게는, 인간 비-종양성 자궁 경부 조직이다.
상기 용어 "비-종양성 자궁 경부 조직"은 암 또는 악성 조직과 같은 정상 자궁 경부 조직에서 상이한 형태를 갖는 자궁 경부 조직을 의미한다.
본 발명의 방법에 의해 수득된 줄기 세포의 상세한 개시 내용은 하기에서 확인할 수 있다.
상술한 바와 같이, 자궁 경부 줄기 세포, 바람직하게는 비-종양성 자궁 경부 줄기 세포를 획득하기 위해 분리된 자궁 경부 조직, 바람직하게는, 비-종양성 분리된 자궁 경부 조직, 즉, 조직이 그의 원래 환경(자궁 경부)로부터 제거되어 그의 자연 상태로부터 "인간의 손에 의해" 변형된 것의 용도는 본 발명의 또 다른 양태로서 고려된다는 것은 당해 기술 분야의 당업자에게 이해된다.
본 발명의 세포 및 조건 배지
본 발명의 방법의 실제 결과인 자궁 경부 줄기 세포(상기 도시된 바와 같이)가 획득된다.
따라서, 다른 양태에 있어, 본 발명은 분리된 자궁 경부 줄기 세포, 이하 "본 발명의 세포"에 관한 것으로서, 상기 세포는 다음과 같다:
(a) 세포 마커 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, 비멘틴(vimentin), 사이토케라틴(cytokeratin)(CKAE1AE3), Klf4, Oct4 및 Sox-2를 발현하고,
(b) 데스민(desmin), 액틴 HHF35, β-카테닌, p63, E-카드헤린(cadherin), CD117, CD133, HLA-DR, TRA1-81, CD45, CD34 및 CD31로 이루어진 군으로부터 선택된 최소 1 종의 세포 마커를 발현하지 않는다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "분리"는 인간 또는 동물 신체로부터 분리된 세포를 의미하며, 이는 생체 내 세포 또는 시험관 내 세포와 관련된 하나 이상의 세포가 실질적으로 유리된 것이다.
본 발명의 방법에 의해 수득된 줄기 세포는 세포 마커 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, 비멘틴, 사이토케라틴(CKAE1AE3), Klf4, Oct4 및 Sox-2를 발현한다. 본 발명의 문맥에서, 분석된 세포 마커의 "유의한 발현"이 있을 때 세포가 세포 마커를 발현하는 것으로 고려된다. 본 명세서에서 사용되는 표현 "유의한 발현"이란, 본 발명의 세포를 10 % 초과, 바람직하게는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 포함하거나 또는 모든 세포를 포함하는 세포 집단은, 통상적인 방법 및 장치(예를 들어, 시판되는 항체 및 당업계에 공지된 표준 프로토콜을 사용하는 Beckman Coulter Epics XL FACS system 또는 Dako Autostainer Plus system)를 이용한 유세포 계측 또는 면역세포화학에서 특정 세포 마커에 대한 시그널이 백그라운드 시그널 이상으로 나타낸다.
사이토케라틴(CKAE1AE3)의 경우 "유의한 발현"은 국소 발현의 존재를 의미한다. 백그라운드 시그널은 통상적인 FACS 분석에 있어 각 표면 마커를 검출하기 위해 사용된 특정 항체와 동일한 아이소타입의 비-특이적 항체에 의해 발생된 시그널 강도로 정의된다. 따라서, 세포 또는 양성에 있어 "존재하는 것"으로 고려되는 마커의 경우, 통상적인 방법 및 장치(예를 들어, 시판되는 항체 및 당업계에 공지된 표준 프로토콜을 사용하는 Beckman Coulter Epics XL FACS system)를 이용하여 관찰된 특정 시그널이 백그라운드 시그널 강도보다 10% 초과, 바람직하게는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 500%, 1000%, 5000%, 10000% 또는 그 이상으로 강하다.
추가적으로, 본 발명의 세포는 데스민(desmin), 액틴 HHF35, β-카테닌, p63, E-카드헤린(cadherin), CD117, CD133, HLA-DR, TRA1-81, CD45, CD34 및 CD31로 이루어진 군으로부터 선택된 최소 1 종의 세포 마커를 발현하지 않는다, 즉, 그것들은 마커인 데스민(desmin), 액틴 HHF35, β-카테닌, p63, E-카드헤린(cadherin), CD117, CD133, HLA-DR, TRA1-81, CD45, CD34 및 CD31의 최소 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개에 대하여 음성이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포 마커에 대해 "음성", 즉, 본 발명의 세포를 10 % 미만, 바람직하게는 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%로 포함하거나 또는 전혀 포함하지 않는 세포 집단은, 통상적인 방법 및 장치(예를 들어, 시판되는 항체 및 당업계에 공지된 표준 프로토콜을 사용하는 Beckman Coulter Epics XL FACS system 또는 Dako Autostainer Plus system)를 이용하는 유세포 계측 또는 면역세포화학에서 특정 세포 마커에 대한 시그널이 백그라운드 시그널 이상으로 나타낸다.
유리하게, 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명의 세포는 다른 유용한 특성을 나타낸다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 세포는 추가적으로 하기 특정 중 최소 하나, 바람직하게는 모두가 나타난다:
(a) 성장 배지에서 24 시간 당 0.4 내지 2.1 세포 분열 증식 속도.
본 발명의 세포의 높은 성장 속도는 빠르게 많은 양의 줄기 세포 또는 조건 배지가 제조되도록 할 수 있다. 이것은 (i) 이러한 줄기 세포들의 생물학 및 용도를 분석하기 위한 다량의 실험의 실시(이는 낮은 성장 속도를 나타내는 것으로 당업계에 최근 공지된 중간엽 줄기 세포와 복합적이다); (ii) 많은 수의 줄기 세포를 단시간에 얻을 수 있으므로 빠른 조직 재생; 및 (iii) 항-염증, 항-종양 및 항-감염 치료에서의 사용을 위하여 줄기 세포의 많은 양을 신속하게 획득할 수 있는 가능성을 제공한다.
(b) 섬유 아세포와 같은 형태.
(c) 최소 10 세포 계대, 바람직하게는 20 세포 계대 동안 안정적인 핵형, 즉, 세포들은 핵 내 염색체의 숫자 및 모양을 전체 기간 동안 유지한다.
이는 장기간 동안 줄기 세포의 기능이 보장되도록 하여, 줄기 세포 계대를 따라 재현가능하고 효과적인 약제를 제조하는 것이 가능하게 된다.
(d) 단층으로 성장하고 기판에 부착할 수 있는 능력.
(E) 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포 계통, 바람직하게는, 지방 세포, 골 세포, 신경 또는 근세포 세포 계통으로 분화될 수 있는 능력. 상기 선별된 세포의 최소 하나의 상기 계통으로의 분화가능한 능력은 당업자에게 당업계에 공지된 종래의 방법으로 분석될 수 있다.
(F) 비 종양 생성능, 즉, 이것들은 종양 세포를 발생시키는 변경된 행동 또는 증식 표현형을 나타내지 않는다.
(g) 구(spheres) 형성 능력, 즉, 현탁액 배양물 내에서 세포의 그룹 또는 콜로니를 형성하는 능력으로, 미토겐 인자(mitogenic factors)(주로, EGF(epidermal growth factor) 및 FGF(fibroblast growth factor))의 존재하에서 매우 증식한다.
이 능력은 체외 신경 전구 세포-유사를 얻을 수 있는 잠재적인 방법을 나타낸다.
특정 구현예에서, 본 발명의 세포는 포유류, 바람직하게는 인간, 비-월경 상태(non-menstrual phase)인 인간으로부터의 분리된 것이다.
당업계의 당업자는 본 발명의 세포가 세포 집단의 일부가 될 수 있음을 이해한다. 따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 세포, 이하 "본 발명의 세포 집단"을 포함하는 분리된 세포 집단에 관한 것이다.
세포 집단에 적용되는 용어 "분리"는 인간 또는 동물 신체로부터 분리된 세포 집단을 의미하며, 이는 생체 내 세포 또는 시험관 내 세포와 관련된 하나 이상의 세포 집단이 실질적으로 유리된 것이다.
필요한 경우, 세포 집단을 클로닝하는 적절한 방법을 이용하여 본 발명에 의해 제공되는 세포 및 세포 집단을 동일하게 증식시킬 수 있다. 예를 들어, 세포의 증식된 집단은 물리적으로 포착할 수 있고, 별도의 플레이트(또는 멀티-웰 플레이트의 웰)에 접종할 수 있다. 대안적으로, 세포를 멀티-웰 플레이트에 통계적 비율로 서브클로닝하여 단일세포를 각 웰로 배치할 수 있도록 할 수 있다. 물론, 저 밀도로 이들을 배치하고(예컨대, 페트리 디쉬 또는 다른 적합한 기판) 클로닝 링과 같은 장치를 이용하여 다른 세포로부터 이들을 분리함으로써 세포들을 클로닝할 수 있다. 클론 집단의 생산은 임의의 적합한 배양 배지로 확장시킬 수 있다. 그것들의 발달 표현형이 평가될 수 있을 경우, 임의의 이벤트에서 분리된 세포는 적당한 시점에 배양될 수 있다.
또한, 추가적으로 자궁 경부 줄기 세포에 대하여, 본 발명은 상기 세포의 배양물로부터 수득된 조건 배지를 고려한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 이러한 조건 배지는 본 발명의 세포에 의해 분비되는 다양한 화합물을 제공하므로 조건 배지는 세포 자체 대신으로 이용될 수 있다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 조건 배지, 이하 "본 발명의 조건 배지"에 관한 것으로서, 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다:
(a) 본 발명의 분리된 줄기 세포 또는 본 발명의 세포 집단을 인큐베이션하는 단계, 및
(b) 배양 배지로부터 세포를 제거하는 단계.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조건 배지(conditioned medium)"는 배양된 세포, 즉, 본 발명의 배양된 세포(자궁 경부 줄기 세포)로부터 수확되는 사용된 배지를 의미한다. 조건 배지는 배양된 세포에 의하여 배지에 분비된 대사 물질, 성장 인자 및 세포외 기질 단백질을 함유한다. 각 구성 요소의 예로는 글루코스, 아미노산, 뉴클레오시드 등과 같은 대사 물질; 인터루킨, EGF (epidermal growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), 등과 같은 성장 인자; 및 콜라겐, 피브로넥틴, 각종 프로테오글리칸과 같은 기질 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조건 배지는 배지에 활성 화합물을 분비하도록 충분한 시간 동안 본 발명의 분리된 세포를 적합한 조건 하에서 배양함으로써 생산된다. 본 발명의 세포를 배양하는 데 적합한 세포 배양 배지는 예를 들어, 소 태아 혈청(fetal bovine serum), 소 태아 혈청(fetal calf serum), 갓 태어난 송아지 혈청, 송아지 혈청, 돼지 혈청, 양 혈청, 말 혈청, 인간 혈청 또는 인간 혈청, 인자, 아미노산, 등과 같은 적합한 혈청 5-25%(예를 들어, 20%)로 일반적으로 보충된 DMEM, DMEM-F12, 알파-MEM, RPMI를 포함한다. 배양 조건은, 즉, pH, 온도 등은, 당업계의 당업자에게 일반적인 상식이다. 한편, 생물 반응기를 이용한 세포의 배양을 실시하여 고용량 배지 및 세포에 적합한 제어된 환경 모두를 관리할 수 있다. 생물 반응기는 당 업계에 널리 알려져 있고, 이의 사용은 당업자에게 일상적이다.
배양 후, 배지는 세포를 제거하도록 처리된다. 이는 임의의 통상적인 방법, 예컨대, 경사법, 원심분리, 여과 등으로 실시될 수 있다. 이어서, 상층액을 조건 배지로서 수집하고 액체 질소 또는 그 기능을 보존할 수 있는, 예컨대, 동결 건조, 감압 동결 건조 또는 냉동건조를 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 상태로 4℃, -20℃, -80℃에서 유지하거나 또는 즉시 이용할 수 있다. 조건 배지를 제조 또는 처리하여 농축 o 희석되도록 할 수 있다. 또한, 조건 배지 조성물의 전부 또는 일부를 합성할 수 있다.
본 발명의 세포의 용도
본 발명의 세포가 분리되면, 상기 세포 및 그것으로부터 얻어지는 조건 배지 모두는 약제학적 조성물 제조에 사용될 수 있다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 분리된 줄기 세포, 세포 집단, 또는 본 발명의 조건 배지 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물, 이하 "본 발명의 약학적 조성물"에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 세포, 세포 집단, 또는 본 발명의 조건 배지의 예방 또는 치료적인 유효량을 포함한다. 따라서, 용어 "예방" 또는 "치료 학적 유효량"은 그들의 약리학적 특성에 의해 결정된 치료적 작용을 할 수 있는 약 제의 양을 말한다. 이는 환자의 나이, 상태, 장애 또는 질환의 심각도 및 경로 및 투여 빈도를 비롯하여 화합물 및 환자의 특성을 조합함으로써, 다른 것들 중에서, 원하는 효과를 생성하기 위해 계산되고, 일반적으로 결정될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 담체가 연방 규제 기관 또는 주 정부의 승인을 받거나 US 약전(Pharmacopeia) 또는 유럽 약전, 또는 동물, 보다 바람직하게는 인간에게 사용되는 일반적으로 인식되는 다른 약전에 열거된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제가 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 전달체를 의미한다. 또한, 원하는 경우, 조성물은 pH 완충제를 소량 함유할 수 있다. 적절한 약학적 담체의 예는 EW 마틴의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"(18th edition, Mack Publishing Co)에 설명되어 있다. 이러한 조성물은 대상에게 투여하는데 적절한 형태를 제공하는 적합한 양의 담체와 함께 본 발명의 세포, 또는 바람직하게는 정제된 형태의 본 발명의 세포 집단, 본 발명의 조건 배지의 예방 또는 치료적 유효량을 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 멸균되고 대상에게, 바람직하게는 동물 대상, 보다 바람직하게는 포유류 대상, 가장 바람직하게는 인간 대상에게 투여하는데 적합한 형태이다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이는 예를 들어, 동결 건조 제제, 액체 용액 또는 현탁액, 주사 가능하고 주입 가능한 용액 등과 같은, 고체, 반고체 및 액체 투여 형태를 포함한다. 바람직한 형태는 투여 방식 및 치료적 적용에 따라 달라진다.
본 발명의 세포 또는 세포 집단 또는 조건 배지, 또는 이들을 포함하는 약학적 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것은 통상적인 수단에 의해 실시될 수있다. 바람직하게는, 상기 세포 또는 세포 집단은 원하는 조직, 시험관 내 또는 생체 내, 직접적으로 동물 조직에 세포를 전달하는 것과 관련된 방법에 의해 대상에게 투여된다. 상기 세포 또는 조건 배지는 조직 유형에 따라 달라질 수 있는 임의의 적절한 방법에 의해 하는 조직으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 세포들은 조직 내 원하는 부위에 접종되어 집단을 형성할 수 있다. 세포 또는 조건 배지는 카테터, 트로카, 캐뉼라, 스텐트, 봉합실, 등(세포에 접종할 수 있거나 또는 조건 배지에 담글 수 있는)과 같은 장치들을 이용하여 생체 내 부위로 전달될 수 있다.
실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명 세포 또는 본 발명의 조건 배지는 대상의 면역계 조절에 유익한 질환와 관련된 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 개선시키는 데 이용될 수 있고, 상기 장애는 염증성 질환, 자가 면역 질환, 이식된 장기와 조직의 거부를 포함하는 면역학적으로 매개된 질환, 만성 병리 및 감염성 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 항-암 능력으로 인해, 그것들은 암을 치료 또는 예방하는 데 이용될 수 있다. 또한, 조직 재생(재생 의학)을 재생하거나 또는 자극할 수 있는 능력으로 인해, 그것들은 조직 파괴와 관련된 상처 치유 또는 다른 과정에 이용될 수 있다.
또한, 조직 재생(재생 의학)을 재생하거나 또는 자극할 수 있는 능력으로 인해, 그것들은 조직 파괴와 관련된 상처 치유 또는 다른 과정에 이용될 수 있다. 추가적으로, 자궁 경부 점액 물질(정자가 자궁내경관을 통과하여 난자에 도달하도록 돕는)에 대한 물질을 분비하는 능력으로 인해, 그것들은 임신 과정에 이용될 수 있다. 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 세포 또는 조건 배지는 신선한 정액 및 수정능획득 정자의 특성을 변경하여, 임신 과정에 적합한 생식 세포를 선별을 돕는다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약제학적 조성물의 약제로서의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 암, 염증성 질환, 자가 면역 질환, 만성 병리, 감염성 질환, 조직 손실/파괴 관련 질환의 치료 또는 예방, 또는 임신 장애의 진단 또는 치료를 위한 본 발명의 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는, "치료(treatment, treat, treating)"는 다음을 의미한다: (a) 질환 또는 증상에 걸리기 쉽지만, 아직 그것으로 진단되지 않은 대상에서 발생하는 질병 또는 증상을 예방하는 것; (b)질환 또는 증상을 억제, 즉, 그것의 발생을 정지시키는 것; (c) 질환 또는 증상을 격감 또는 완화, 즉, 질환 또는 증상의 퇴행을 초래하는 것; 또는 (d) 질환 또는 증상을 치료, 즉, 그것의 발생과 진행을 막는 것. 본 발명의 줄기 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약학적 조성물에 의해 치료된 대상자 집단은 바람직하지 않은 증상 또는 질환으로 고통받는 대상뿐만 아니라 상기 증상 또는 질환의 발생 위험이 있는 대상도 포함한다. 본 발명 에 있어서, 치료되는 질환은 암, 전암 병변, 염증성 질환, 자가 면역 질환, 이식된 장기와 조직의 거부를 포함하는 면역학적으로 매개된 질환, 만성 병리 및 감염성 질환; 조직 파괴 또는 조직 손실과 관련된 질환 및 임신 장애로부터 선택된다.
용어 "장애" 및 "질환"은 대상의 증상을 의미하며 서로 통용된다.
용어 "암"은 일반적으로 세포 증식, 분화, 및 세포 생존의 조절의 실패로 인해 발생되는 질환의 종류를 의미하며, 악성 변환을 겪는 세포(또한 암세포 또는 종양 세포를 지칭)의 발생, 주변 조직으로 침입(및 악성 종양 형성)을 야기하고, 이는 궁극적으로 체내 다른 부위로 이동할 수 있어 전이라는 과정에서 이차 종양을 발생할 수 있다. 또한, 본 발명의 맥락에서, 용어 "종양"은 비정상적인 조직 덩어리를 지칭하며, 양성 및 악성 덩어리 모두를 포함한다. 또한, 양성 조직 덩어리는 본 발명의 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약학적 조성물로 치료될 수 있다.
암의 예로는 부신피질암, AIDS-관련 암, AIDS-관련 림프종, 항문암, 항문 직장암, 항문암, 충수암, 소아 소뇌 성상세포종, 소아 뇌 성상세포종, 기저세포 암, 담도암, 간외담도 암, 간내담관암, 방광암, 요로방광암, 뼈 및 관절암, 골육종, 악성 섬유성 조직구종, 뇌암, 뇌종양, 뇌간 신경 교종, 소뇌 성상 세포종, 대뇌 성상 세포종/악성 신경 교종, 뇌교종, 천막상 속질모세포종, 시각 경로 및 시상 하부 신경 교종, 유방암, 기관지 선종/유암종, 유암종암, 위장관암, 신경계 암, 신경계 림프종, 중추 신경계 암, 중추 신경계 림프종, 자궁 경부암, 소아암, 만성 림프 구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수 증식 질환, 대장암, 직장암, 피부 T 세포 림프종, 림프 종양, 균상식육종, 세지아리(Seziary) 증후군, 자궁 내막암, 식도암, 두개외 생식 세포 종양, 성선외 생식 세포 종양, 간외 담도 암, 안암, 안구 내 흑색종, 망막 모세포종, 담낭암, 위장관 유암종, 위장관 간질 종양(GIST), 생식 세포 종양, 난소 생식 세포 종양, 임신성 융모 상피 종양 신경 교종, 두경부암, 간세포(간)암, 호지킨 림프종, 하인두암, 안구 내 흑색종 안구암, 섬세포 종양 (내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암, 신장암, 신장암, 후두암, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 세포성 백혈병, 입술 및 구 내강암, 간암, 폐암, 비소 세포 폐암, 소세포 폐암, , AIDS-관련 림프종, 비호지킨 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 왈덴스트람(Waldenstram) 마크로글로불린혈증, 수모세포종, 안구(눈) 흑색종, 메르켈 세포암, 악성 중피종, 악성, 전이성 편평 목암, 구강암, 설암, 여러 내분비 종양 증후군, 균상식 육종, 골수이 형성 증후군, 골수 형성 이상/골수 증식성 질환, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종 암, 만성 골수 증식성 질환 , 인두암, 신경모세포종, 구강암, 구강암, 인두암, 난소암, 난소상피암, 난소 저악성 가능성 종양, 췌장암, 섬세포 췌장암, 부비동 및 비강암, 갑상선암, 음경암, 인두암, 갈색 세포종, 송과체아세포종 및 천막상 수모세포종, 뇌하수체 종양, 형질 세포 종양/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 전립선암, 직장암, 신우 및 요관, 이행세포 암, 망막 모세포종, 횡문근 육종, 타액선암, 육종 종양 유잉 집단, 카포시 육종, 연부 조직 육종, 요도암, 자궁 육종, 피부암(비-흑색종), 피부암(흑색종), 메르켈 세포 피부암종, 소장암, 연조직 육종, 편평세포암, 위(위)암, 천막상 수모세포종, 고환암, 후두암, 흉선종, 흉선 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관 및 기타 비뇨기의 이행 세포암, 임신성 융모암, 요도암, 자궁 육종, 자궁 음경암, 질암, 외음부 암 및 윌름스 종양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "전암 병변"은 암 발생의 위험 증가와 관련된 조직학적 변화를 나타내는 병변을 의미한다.
용어 "염증성 질환"은 염증, 예를 들어 만성 염증을 특징으로 하는 대상의 증상을 의미한다. 본 발명의 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약학 조성물로 치료될 수 있는 염증성 질환의 예로는, 류마티스 관절염(RA), 염증성 장 질환(IBD), 천식, 뇌염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 염증성 골용해, 알레르기성 질환, 패혈성 쇼크, 폐 섬유증(예, 특발성 폐 섬유증), 염증성 맥관염(예, 다발성 동맥염, 웨 그너 육아종증, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염, 및 림프종양 육아종증), 외상 후 혈관 성형술(예를 들어, 혈관 성형술 후 재협착), 미분화 척추 관절 병증, 미분화 관절증, 관절염, 염증성 골용해, 만성 간염 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염으로 인한 만성 염증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "자가 면역 질환"은 자신의 세포, 조직 및/또는 기관에 대한 대상의 면역 반응으로 인해 발생된 세포내, 조직 및/또는 장기의 손상을 특징으로 하는 대상의 증상을 의미한다. 본 발명의 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약학 조성물로 치료될 수 있는 자가 면역 질환의 예로는, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가 면역 애디슨병, 부신 자가 면역 질환, 자가 면역 용혈성 빈혈, 자가 면역 간염, 자가 면역 난소염 및 고환염, 자가 면역 혈소판 감소증, 베체트 병, 수 포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루-피부염, 만성 피로 면역 부전 증후군 (CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 신경병증, 척-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, CREST 증후군, 냉 응집소 질환, 원반 모양 루푸스, 핵심 혼성 한랭 글로불린 혈증, 섬유 근육통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 병, 길랑-바레, 하시모토 갑상선염 , 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소 자반병(ITP), IgA 신경병증, 청소년 관절염, 편평 태선, 메니에르병, 혼합 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 1 형 또는 면역 매개성 당뇨병, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발 동맥염, 다발 연골염, 분비선 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 다발성 근염과 피부 근염, 원발성 감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 사르코이드증, 피부 경화증, 진행성 전신경화증, 쇼그렌 증후군, 구드패스츄어 증후군, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 포진성 피부염, 백반증, 베게너 육아종증 등과 같은 맥관염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "만성 병리"는 장기간 질환을 특징으로 하는 대상의 증상을 의미하며, 안정적이거나 느리게 진행되고, 끊임없이 존재하거나 차도를 보이다가 주기적으로 재발된다. 본 발명의 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약학 조성물로 치료될 수 있는 만성 병리의 예로는, 심혈관 질환, 심장 질환, 뇌졸중, 암, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환과 같은 만성 호흡기 질환, 당뇨병, 관절증, 비만, HIV/AIDS, 충치, 치주 질환, 만성 중이염, 녹내장 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "감염성 질환"은 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 곰팡이와 같은 병원성 미생물의 유기체의 존재를 특징으로 하는 증상을 의미한다. 본 발명의 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약학 조성물로 치료될 수 있는 감염성 질환의 예로는, 인플루엔자, 조류 인플루엔자, HIV/AIDS, 레지오넬러병, 패혈증, 결핵, 부룰리 궤양, 트리파노소마 증, 출혈열(예를 들어, 마르부르크 출혈열, 에볼라 출혈열 또는 뎅기열 출혈열), 간염(예를 들어, A 형 간염, B 형 간염, C 형 간염), 수막염 (예를 들어, 수막구균성 수막염), 콜레라, 황열, 말라리아, 나병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 정의에서 용어 "대상"은 포유류, 바람직하게는 영장류, 보다 바람직하게 인간을 포함하는 임의의 동물을 의미하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 분리된 줄기 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약학적 조성물은 상기 언급 된 질환으로 고통받는 임의의 동물의 치료에 사용할 수 있다.
용어 "조직 파괴" 또는 "조직 손실"은 (a) 구조물 질량의 백분율이 제거되고, 또는 b) 일부 흔적 세포 및/또는 패턴이 남아있으면서 구조물을 포함하는 세포의 내부 패턴 및 숫자가 손상되거나 사멸하는 질환을 의미한다. 조직 파괴 또는 조직 손실 관련 질환의 예는 안구 건조 질환, 각막 상처와 같은 안구 표면 질환; 또는 연령 황반 변성, 망막 이영양증-퇴화와 같은 망막 질환; 또는 광학 신경병증, 녹내장, 포도막염; 또는 피부 질환, 심장 질환, 신장 질환, 또는 중추 신경계, 알츠하이머 병, 근위축성 측삭 경화증 또는 척수 근위축증으로부터 선택된다.
용어 "임신 장애"는 배란과 관련된 문제로 아이를 임신하는 데 어려움을 의미하며, 저급 난자 품질, 호르몬 결핍 또는 불균형으로 인한 배란 실패, 불규칙한 배란 및 다낭성 난소 증후군(PCOS)을 포함하나 이에 한정되지 않으며; 또는 정자와 관련된 문제를 의미하며, 비정상 정자, 불충분 정자 또는 저운동성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약학적 조성물은 남성 및 여성 모두의 임신 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
용어 "생식 세포"는 정모세포 또는 난모세포와 같은 성세포(reproductive cell) 또는 성세포로 발전하는 세포를 의미한다.
용어 "적절한 생식 세포"는 수정 과정 후, 접합자가 되는 배우자(gamete)를 의미한다. 배우자가 접합자로 될 수 있는 경우를 결정하기 위한 분석법은 당업계에 공지되어 있고, 이들은 당업자에게 일반적이다.
또한, 본 발명은 암, 전암 병변, 염증성 질환, 자가 면역 질환, 만성 병리, 감염성 질환, 조직 손실 관련 질환의 치료 또는 예방, 또는 임신 장애의 진단, 예측 또는 치료를 위한 병용 요법에 있어 본 발명의 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약제학적 조성물의 용도로 고려된다.
용어 "병용 요법"은 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 경감하기 위한 본 발명의 방식으로 다른 활성제 또는 치료 방법과 함께 하는 본 발명의 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약제학적 조성물의 용도를 의미하며, 상기 장애는 암, 전암 병변, 염증성 질환, 자가 면역 질환, 만성 병리, 감염성 질환 또는 이식된 기관 및 조직의 거부를 포함한 면역학적으로 매개된 질환, 또한, 조직 손상에 관련된 질환 및 임신 장애를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다른 치료제 또는 치료 방법은 이러한 질환의 치료를 위해 공지된 약제와 치료법을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약학적 조성물은 코르티코스테로이드, 비-스테로이드성 항-염증 화합물, 또는 암, 염증성 질환, 자가 면역 질환, 만성 병리를 치료하는데 유용한 다른 제제와 조합될 수 있다. 이러한 다른 치료제 또는 치료 방법과 함께 본 발명의 제제의 병용은 동시 또는 순차적으로 부여될 수 있으며, 즉, 두 가지 치료법은 본 발명의 세포 집단 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 다른 치료제 또는 치료 방법 전후에 제공할 수 있다. 주치의는 다른 제제, 치료 또는 치료법과 조합하여, 본 발명의 세포 집단, 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 적당한 순서를 결정할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 미용 치료 용도에서의 본 발명의 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "미용 치료"는 예를 들어, 노화된 피부, 특히 잔주름, 주름 및/또는 패인(셀룰라이트) 피부에 적용하여 피부 질감을 향상시킴으로써 피부의 외관을 개선시키거나 또는 화상의 외관을 향상시키는 처리를 의미한다. 이 경우, 화장품 제제는 바람직하게는 크림, 로션, 겔 또는 왁스로 제형화되고, 미용 효과를 향상시키는 화합물을 포함할 수 있다. 화장품 제제는 바람직하게는 피부, 피하 또는 경피, 또는 국소, 경피, 표피 또는 피내 적용된다. 바람직하게는 본 발명의 줄기 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약학적 조성물은 종래 기술에서 공지된 화장용 충전제로 쉽게 적용할 수 있다. 또한, 상기 줄기 세포 제제 또는 조건 배지는 피부 질감이 개선되는 경우, 여러 스폿에서 주입될 수 있으며, 예를 들어, 잔주름, 주름 및/또는 패인 피부 주변 및/또는 아래에 바람직하게는 스폿 당 200 ㎕ 내지 2 ㎖, 가장 바람직하게는 스폿당 0.5 ㎖ 내지 2 ㎖이다.
다른 양태에서, 본 발명은 종양 세포의 증식 및/또는 전이, 단핵구 분화, 병원성 미생물 성장 및/또는 복제, 또는 말초 혈액 단핵 세포 증식을 억제 또는 감소, 또는 종양 세포의 세포자멸사의 향상 또는 유도, 또는 조직 재생(재생 의학)의 향상, 또는 임신 장애의 진단, 예측 또는 치료 또는 생식 세포의 선택을 위한 용도의 본 발명의 분리된 줄기 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약학적 조성물에 관한 것이다 .
용어 종양 세포의 증식 및/또는 전이의 "억제(inhibiting 또는 ihibition)", 각각 종양 세포의 분열을 중단, 블록킹 또는 방지하는 것, 또는 종양 세포의 다른 조직 또는 다른 비-인접 기관 또는 부분으로의 확산을 중지, 블록킹 또는 방지하는 것을 의미한다. 유사하게, 용어 종양 세포의 증식 및/또는 전이의 "감소"는, 각각 종양 세포의 세포 분열을 감소시키는 것, 또는 종양 세포의 다른 조직 또는 다른 비-인접 기관 또는 부분으로의 확산을 감소시키는 것을 의미한다.
용어 "단핵구 분화 및/또는 말초 혈액 단핵 세포 증식의 억제(inhibiting 또는 ihibition)"는, 각각 단핵구의 대식세포로의 분화를 중지, 블록킹 또는 방지하는 것, 또는 말초 혈액 단핵 세포의 세포 분열을 중지, 블록킹 또는 방지하는 것을 의미한다. 유사하게, 용어 "단핵구 분화 및/또는 말초 혈액 단핵 세포 증식의 감소"는, 각각 단핵구의 분화를 감소시키는 것, 또는 말초 혈액 단핵 세포의 세포 분열을 감소시키는 것을 의미한다.
용어 "병원성 미생물의 성장 및/또는 복제의 억제(inhibiting 또는 ihibition)"는 미생물의 세포 분열을 중지, 블록킹 또는 방지하는 것을 의미한다. 결과적으로, 미생물의 수가 감소하거나 일정하게 유지된다.
표현 "종양 세포의 세포자멸사의 향상"은 "종양 세포의 세포자멸사의 유도"와 유사하며 이 둘은 종양 세포의 프로그램된 세포사멸의 과정을 증가시키거나 또는 자극하는 것을 의미한다. 종양 세포의 증식 및/또는 전이, 단핵구 분화, 병원성 미생물 성장 및/또는 복제, 또는 말초 혈액 단핵 세포 증식의 억제 또는 감소를 측정하는 방법뿐만 아니라 종양 세포의 세포자멸사가 증가 또는 감소되는 경우를 확인하는 방법은 본 명세서의 실시예에 나타난다. 이러한 모든 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 당업자에게 일반적이다.
한편, 또한, 본 발명은 본 발명의 세포, 세포 집단, 조건 배지 또는 약학적 조성물을 포함하는 키트뿐만 아니라 암, 염증성 질환, 자가 면역 질환, 만성 병리 또는 감염성 질환, 조직 파괴 또는 조직 손실 관련 질환, 임신 장애의 치료 또는 예방, 및 종양 세포의 증식 및/또는 전이, 단핵구 분화, 또는 말초 혈액 단핵 세포 증식의 억제 또는 감소, 또는 종양 세포의 세포자멸사의 향상 또는 유도, 또는 조직 재생의 향상 또는 유도, 또는 장애의 진단, 예측 또는 치료 용도의 상기 키트의 용도로 고려된다. 또한, 본 발명은 미용 목적을 위한 본 발명의 키트의 용도를 포함한다.
또한, 본 명세서에 개시된 본 발명의 세포 집단, 조건 배지 또는 약학적 조성물의 용도와 동일한 처리의 해당 방법은 본 발명의 맥락에서 고려된다.
이러한 의미에서, 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 줄기 세포,세포 집단, 조건 배지, 또는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 암, 염증성 질환, 자가 면역 질환, 만성 병리 또는 감염성 질환, 조직 손실 관련 질환 또는 임신 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 분리된 줄기 세포, 세포 집단, 조건 배지, 또는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포의 증식 및/또는 전이, 단핵구 분화 또는 말초 혈액 단핵 세포 증식의 억제 또는 감소, 또는 종양 세포의 세포자멸사의 향상 또는 유도, 또는 조직 재생의 향상 또는 유도, 생식 세포의 선별의 향상 또는 임신 장애의 진단, 예측 또는 치료 방법에 관한 것이다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 당업자 중 하나에 의해 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질은 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 설명 및 청구범위를 통해 단어 "포함" 및 그 변형은 다른 기술적 특징, 첨가, 인자, 또는 단계를 배제하는 것은 아니다. 본 발명의 추가적인 목적, 장점 및 특징은 발명의 상세한 설명의 검토시 당업자에게 명백해지거나 본 발명의 실시에 의해 학습될 수 있다. 이하의 실시예, 도면 및 서열 목록은 예시적으로 제공되며 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다.
도 1: 자궁 줄기 세포는 성체 중간엽 줄기 세포의 면역 표현형(immune phenotype)을 나타낸다. A. 경부 도말로부터 획득하고 90 일 동안 배양한 세포들을 특정 항체로 면역표지한 후 단백질 발현을 평가하였다. 데스민, 액틴 HHF35, SMA(smooth muscle actin), p63, 및 E-카드헤린 발현은 검출되지 않은 반면, CKAE1AE3는 중심으로 발현되고, 비멘틴은 강한 발현을 나타낸다. B. klf4, OCT4 및 sox2와 같은 특정 줄기 세포 마커들은 자궁 줄기 세포에서 강한 면역표지를 나타냈다. C. hUCESCs(human uterine cervical stem cells)의 유동 세포 계측법은 CD29, CD44, CD73, CD90와 CD105 단백질의 높은 백분율을 나타내나, CD31, CD34, CD45, CD117, CD133, HLA-DR 및 Tra1-81 단백질의 음성적인 발현을 나타낸다. D. 특정 배지에서 배양하는 경우 분리된 hUCESCs는 구형세포(spheroids)를 형성한다.
도 2: hUCESCs 의 성장 속도. hUCESCs의 성장은 2,000 세포/웰 씨딩한 후 세포의 숫자로 나타냈다.
도 3: 면역원성 분석. 도면은 두 공여체(donor)로부터의 대표적인 MLR을 표시한다. 자극 세포(stimulator cells)의 부재, 자가(autologous) 미토마이신 C 처리 PBMC의 존재(음성 대조군), 동종(allogeneic) 미토마이신 C 처리 PBMC의 존재(양성 대조군), 미토마이신 C 처리 hUCESCs의 존재, 및 Con A 자극 PBMC의 존재(양성 대조군) 시 PBMC의 증식을 확인하였다. 자극 세포를 웰 당 2 × 104의 밀도로 시험하였다. 일방향 MLR 분석을 실시하여 hUCESCs의 면역원성을 평가하였다. 미토마이신 C 처리 자극 세포의 존재하에 대사적으로 활성인 살아있는 세포의 증가된 수에 기반하여 PBMC의 증식을 측정하였다. 자가 및 동종 PBMC는 각각 음성 및 양상 자극 세포 대조군의 역할을 하였다. Con A 자극 PBMC는 다른 양성 자극 대조군 세포의 역할을 하였다. hUCESCs는 MLR 분석에서 T 세포의 증식을 유도하지 않았다.
도 4: hUCESCs 조건 배지의 존재 하에서 자극받은 단핵구 분화의 억제. A) U937 세포의 생존율은 80%보다 높다. B) 대식세포 분화 마커의 발현에 있어서의 hUCESCs 및 ASCs 조건 배지의 효과. U937 CD11b 발현의 기준 수준은 34%이다. PMA 처리 대조군 U937 세포와 비교하여, CD11b에 대하여 양성으로 염색된 세포들의 백분율은 PMA 처리 U937 세포의 경우 73%에서 hUCESCs 조건 배지 처리 U937 세포의 경우 48%로 감소되었다. ASCs 조건 배지로 처리된 U937 세포에 대한 CD11b 발현의 백분율은 67%이다.
도 5: 단핵구 분화의 억제: 24 시간 동안 자극 및 hUCESCs 조건 배지의 추가. A) U937 세포의 생존율은 80%보다 높다. B) U937 CD11b 발현의 기준 수준은 38%이다. PMA 처리 대조군 U937 세포와 비교하여, CD11b에 대하여 양성으로 염색된 세포들의 백분율은 PMA 처리 U937 세포의 경우 82%에서 24 시간 동안 제조된 hUCESCs 조건 배지 처리 U937 세포(CM 24 시간)의 경우 48%, 및 48 시간 동안 제조된 조건 배지 처리 U937 세포(CM 48 시간)의 경우 34%로 감소되었다. 그럼에도 불구하고 ASCs CM 48 시간 처리 U937 세포의 CD11b 발현은 77%이다.
도 6: 조건 배지에 의한 PBMC 증식의 억제. 24 시간 및 48 시간 hUCESCs 배지 조건 모두, PBMC 증식을 억제하였다. 억제는 ASCs 조건 배지보다 hUCESCs 조건 배지에서 더 효과적이었다. hUCESCs 조건 배지에 의한 억제의 규모는 덱사메타손의 것을 초과하였다.
도 7: hUCESCs로부터의 조건 배지(CM)는 HT29, AGS 및 MDA-MB-231 세포에서는 세포 증식이 감소시켰으나, MCF -7 세포주에서는 그렇지 않다. A. 48 시간 동안 완전 배지(대조군), 불완전 배지(w/o FBS), 24 시간 또는 48 시간 동안 제조된 hUCESCs로부터의 조건 배지 및 48 시간 동안 제조된 ASCs로부터의 조건 배지로 처리된 대장암(HT29) 및 위암(AGS) 세포주에 대해서 세포 증식 분석. B-C. 완전 배지(+FBS), 불완전 배지(-FBS), 24 시간 또는 48 시간 동안 제조된 MCF-7로부터의 조건 배지, 또는 24 시간 또는 48 시간 동안 제조된 hUCESCs로부터의 조건 배지로 24 시간 또는 48 시간 처리된 MCF-7의 MTT 분석. D-E. 완전 배지(+FBS), 불완전 배지(-FBS), 24 시간 또는 48 시간 동안 제조된 MDA-MB-231로부터의 조건 배지, 또는 24 시간 또는 48 시간 동안 제조된 hUCESCs로부터의 조건 배지로 24 시간 또는 48 시간 처리된 MDA-MB-231의 MTT 분석. F. MCF-7 세포(1x105)를 CellTracker Green dye로 표지하고 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 4 시간 후, CellTracker Red dye로 표지된 1x105 hUCESCs을 MCF-7 세포에 첨가하여 불완전 배지(FBS 없는)에서 공동-배양하였다. 마지막 래인은 성장의 대조군으로 이용된 불완전 배지(FBS 없는)에서의 MCF-7 세포 성장의 예를 나타낸다. G. MDA-MB-231 세포를 표지하고 MCF-7 세포에 대하여 (F)에서 상술한 바와 같이 hUCESCs와 함께 공동-배양하였다.
도 8: MDA-MB-231 세포에 대한 hUCESCs로부터의 조건 배지(CM)의 투여는 세포 주기를 지연시키고 세포 자멸사를 유도한다. A. MDA-MB-231 세포를 10% FBS가 있는 DMEM(+FBS), FBS가 없는 DMEM(-FBS), 또는 hUCESCs로부터의 48 시간 CM으로 48 시간 동안 배양한 후, PI(propidium iodide)를 이용하여 유동 세포 계측법을 실시하였다. 각 단계의 세포의 백분율(평균 ± 기준 편차)로 나타낸다. B. (A)에 기재된 바와 같이 48 시간 동안 처리된 MDA-MB-231 세포로부터의 단백질 추출물의 cyclin A, cyclin B, cyclin E, cyclin D1, 및 GAPDH의 웨스턴 블롯. C. 완전(+FBS), 불완전(-FBS), 또는 hUCESCs로부터의 CM으로 48 시간 동안 배양한 MDA-MB-231 세포에서 아넥신 V/PI를 이용하는 유동 세포 계측법으로 세포자멸사를 측정하였다. 아넥신 V+/PI- 및 아넥신 V+/PI+는 각각 초기와 후기 세포 자멸을 의미한다. D. (C)에 나타낸 바와 같이 MDA-MB-231 단백질 추출물의 카스파제-8, -12, -11, 활성형(Activated) 카스파제-3, 및 절단형(Cleaved) PARP의 웨스턴 블롯. E. (C)와 같이 처리된 MDA-MB-231 단백질 추출물의 항-자멸성(apoptotic) Bid, 절단형 Bid, 및 Bim의 웨스턴 블롯. GAPDH는 로딩 대조군으로 이용하였다.
도 9: hUCESCs 로부터의 조건 배지(CM)는 이종이식 마우스 모델에서 암의 침윤, 삼차원 성장, 및 부피를 억제시킨다 . A. hUCESCs로부터의 48 시간 조건 CM는 매트리겔 매트릭스를 통해 MDA-MB-231 세포 침윤을 유의하게 감소시켰다. B. 9 일 동안 배양한 hUCESCs 배양 48 시간 조건 CM의 투여는 완전(+FBS) 또는 불완전(-FBS) 배지로 처리된 세포들과 비교하여, MDA-MB-231 세포의 3D 성장을 감소시켰다. C. MDA-MB-231-luc 세포들을 13 마리 SCID 마우스에게 피하주사하였다. 15 일 후, 7 마리 마우스에게 매 5 일 마다 hUCESCs로부터의 조건 배지(CM) 150 ㎕을 종양내부(intratumoural) 주사하였고(CM-처리, CM-treated), 6 마리 마우스에게 불완전 배지를 주사하였다(-FBS, 대조군). 대조군 및 CM-처리 마우스로부터의 대표적인 이미지는 15, 20, 25, 및 30 일째에 촬영하였다. D. 발광을 측정하여 종양 부피를 확인하였다. 값은 상대적인 발광 수준의 평균 ± 표준 편차로 표현된다. **: P = 0.011 vs. 대조군. E. (C)에 기재된 바와 같이, CM 및 위약으로 처리된 SCID 마우스의 대표적인 종양에서의 활성형 카스파제-3 발현의 면역조직화학적 검출. F. CM-처리 마우스 vs. 대조군 마우스에서의 전체 생존의 카플란-메이어 플롯(Kaplan-Meier plots). CM으로 처리된 마우스는 대조군에 비해 긴 DFS를 가진다. 차이는 통계학적으로 유의하였다(P = 0.019).
도 10: 높은 증식 속도의 유방 종양으로부터의 일차 배양물(primary culture)에 있어 세포 증식은 hUCESCs 로부터의 조건 배지(CM)의 투여 후 유의하게 감소된 다. A. 인간 유방 종양으로부터의 10 개 일차 배양물에 다음과 같이 처리하였다: a) 완전 배지(+FBS) b) 불완전 배지(-FBS), c) 자신의 세포로 48 시간 동안 제조된 조건 배지(CM), d) 지방-유래 기질 세포(ASCs)로 48 시간 동안 제조된 CM, 및 e) hUCESCs로 48 시간 동안 제조된 CM. 배양 48 시간 후, MTT 분석법을 실시하여 세포 증식을 평가하였다. 높은 증식율을 갖는 배양물들(빨간색 11B512, 11B3285, 11B3171 및 11B7352)에서 hUCESCs로부터의 CM의 투여는, 다른 처리들과 비교하여 세포 증식에 있어 유의한 감소를 유도하였다(P<0.001). B. hUCESCs로부터의 CM 또는 불완전 배지(-FBS)로 처리된 높은 증식율을 갖는 일차 종양으로부터의 단백질 추출물을 cyclin D1, 절단형 PARP, 및 GAPDH(로딩 대조군) 항체들로 인큐베이션하여 웨스턴 블롯에 대해 분석하였다.
도 11: 96- 마이크로웰 플레이트에서 hUCESCs 조건 배지에 의한 병원성 미생물의 성장 억제의 대표적인 예. A. 대조군 배지(M)에서는 대장균의 성장이 나타났고, hUCESCs 조정 배지(1)는 최대 웰 4(1/20 희석)까지 박테리아 성장의 억제를 나타냈다. 지방 조직-유래 MSC 조건 배지는 모든 웰에서 박테리아의 성장이 나타났다. B. 각 조건에 대하여 추가된 부피의 표. 원은 박테리아 성장 억제를 나타내는 웰을 가르킨다.
도 12: hUCESCs 에 의한 미생물의 성장 억제의 대표적인 예. hUCEScs에 의한 미생물 성장의 유의한 억제(p<0.001)를 CFU 계산 및 OD로 분석하였다. 배지 단독 및 정상 인간 섬유 아세포(NHF)는 어떠한 대장균 성장의 억제도 나타내지 않았다.
도 13: hUCESCs 조건 배지에 의한 미생물의 성장 억제의 대표적인 예. hUCEScs 조건 배지에 의한 미생물 성장의 유의한 억제(p<0.001)를 CFU 계산 및 OD로 분석하였다. 배지 단독 및 정상 인간 섬유 아세포 조건 배지(CM NHF)는 어떠한 대장균 성장의 억제도 나타내지 않았다.
도 14: 랫트에서의 안구 건조 모델. A. 절제 전 안외 눈물샘을 보여주는 사진. B. 응용된 쉬르머 검사를 이용하여 눈물 생산을 측정하였다. C. 정상적인 눈(normal eye, NE) 및 안외 눈물샘 절제 7일 후 건조한 안구(dry eye, DE)에서의 쉬르머 검사 결과.
도 15: ' 생체내 ' 상피 재생. A. 알칼리 화상 직후(T0h), 15 시간 후(T15h) 및 5 일 후(T5d)의 각막 형광 염색의 대표 이미지. B. 알칼리 화상 15 시간 후 상피 각막 재생 백분율의 통계 분석(*p<0.005). C. 알칼리 화상 5 일 후 상피 각막 재생 백분율의 통계 분석(*p=0.005). 이용된 처리는 조건 배지(CM), 세포와 이전에 어떠한 접촉도 없던 배지 단독(M), 소디윰 히알루론산(SH)으로 점안 및 비처리군(NoTreat)이었다.
도 16: 조직학.
알칼리 화상 5 일 후 조건 배지(CM), 세포와 이전에 어떠한 접촉도 없던 배지 단독(M), 소디윰 히알루론산(SH)으로 점안 및 비처리군(NoTreat)으로 처리한 각막으로부터의 20μ 슬라이드의 헤마톡실린 에오신 염색의 대표 이미지(확대, X10).
도 17: 항 염증 효과. A-C. 알칼리 화상 5 일 후 MCP-1(A), MIP-1α(B), TNF-α(C)의 실시간 PCR 결과의 통계 분석. 분석된 조건은 조건 배지(CM)로 처리된 각막; 세포와 이전에 어떠한 접촉도 없던 배지(M)로만 처리된 각막; 소디윰 히알루론산(SH)으로 점안 처리된 각막, 건조하나 어떠한 병변(NoUlc)도 없는 각막 및 어떠한 병변(Normal)도 없는 건강한 눈으로부터의 각막이었다.
실시예
실시예 1: 인간 자궁 경부 줄기 세포(human uterine cervical stem cells)의 분리 및 특성
I - 대상 및 방법
인간 자궁 경부 줄기 세포의 분리 및 성장
인간 자궁 경부 줄기 세포(Human uterine cervical stem cells, hUCESCs)를 일반적인 부인과 검사 중 자궁 경부의 박리물로부터 획득하였다. 간단히, 세포학적 샘플은 자궁 경부 점액을 분해할 수 있는 트립신, 콜라게나제 또는 다른 효소와 효소 분해시켰다. 그 후, 샘플을 400g에서 5 분간 원심 분리하고, 펠릿을 회수하여 배양 플레이트에 접종하였다. 웰은 미리 1% 젤라틴 또는 피브로넥틴 또는 부착을 허용하는 다른 기판(substrate)으로 코팅될 수 있다. 샘플을 DMEM-F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)에서 배양하였다: 영양 혼합물 F-12, 글루타민, 항생제 포함 유무, 혈청, 표피 성장 인자(EGF), 하이드로코르티손, 인슐린, 비-필수 아미노산, 소디윰 피루베이트. 세포의 계대배양을 트립신 또는 아큐타제(accutase) 또는 다른 단백질분해 및/또는 콜라겐분해 효소로 실시하였다.
유동 세포 계측법(Flow cytometry ) 특성
인간 자궁 경부 줄기 세포(hUCESCs)를 특정 단일 클론 항체의 패널로 염색하였다: CD29-PE, CD45-FITC, CD90-PE, CD105-PE, HLA-DR-PE(Beckman Coulter), CD44-PE, CD73-을 PE, CD31-PE, TRA1-81-FITC(Becton Dickinson, Biosciences Pharmingen), CD34-FITC, CD117-PE 및 CD133-PE(Miltenyi Biot). 7-AAD(7-amino-actinomycin-D)(BD Pharmingen)을 사멸한 세포의 판별을 위해 첨가하였다. 상이한 튜브에 동일한 양의 세포를 분주하여 면역표현형 분석을 실시하였다. 염색된 세포를 PBS에서 재현탁하고 Cytomics FC500 유세포 계측기(flow cytometer)(Beckman Coulter)을 이용하여 분석하였다. 제조사에 의해 제공된 CXP 소프트웨어를 이용하여 계산된 데이터를 분석하였다.
면역세포화학 특성
상술한 바와 같이 인간 자궁 경부 줄기 세포(hUCESCs)를 배양하였다. 면역세포화학법에 대한 처리 전에 3x104 세포들을 슬라이드에 접종시키고, 96% 에탄올에서 10 분 동안 고정시켰다. 마우스 종양을 24 시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 침지-고정시키고 일반적으로 파라핀에 포매하였다.
4 ㎛ 두께 섹션을 플렉스 IHC 현미경 슬라이드(Dako, Glostrup, Denmark)상에 봉입하였다. 면역조직화학(IHC) 기술을 자동화기(AutostainerLink 48, Dako)로 실시하였다. CK (clone AE1/AE3), E-카드헤린(clone NCH-38), 비멘틴(clone V9), 데스민(clone D33), 액틴(clone HHF35), 평활근 액틴(smooth muscle actin, clone 1A4), 및 β-카테닌(clone beta-catenin-1)에 대하여 FLEX 레디-투-유즈 Dako 1차 항체를 이용하였다. 또한, Abcam (Cambridge, UK)사의 p63 (clone 4A4)에 대한 단일 클론 항체를 사용하였다. KLF4, OCT4, 및 Sox2 일차 항체는 각각, Santa Cruz Biotechnology, Millipore, 및 Sigma-Aldrich로부터 획득하였다. 에피토프 회복은 EnVision FLEX 타겟 회복 용액(pH 9)을 사용하여 전자 레인지로 20분 실시하였다. 30분 동안 인큐베이션한 p63을 제외한 모든 항체는 20 분 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 검출 시스템으로서 본 발명자들은 EnVision FLEX/HRP Dako(홀스래디쉬 퍼옥시다제 및 친화성-분리 고트 항-마우스 및 항-래빗 면역 글로불린이 결합된 덱스트란 중합체를 20 분 동안 사용하였다. E-카드헤린을 위해, 마우스 링커(Dako)를 추가하였다.
성장률
hUCESCs의 증식 속도는 12 일 동안 매일 2 개의 웰 내 세포의 총 수를 계수함으로써 결정하였다. 초기에, 세포들을 6-웰 플레이트 배양접시에 2,000 세포/웰로 접종하였다.
스페로이드 (Spheroid) 형성과 지방(adipose) 분화
hUCESCs을 DMEM/F12 medium (vol/vol) (Invitrogen), 1% B27 (Invitrogen), 10 ng/㎖ 상피 세포 성장 인자(EGF) 및 5 ng/㎖ 섬유 아세포 성장 인자 2(FGF-2), 100 IU/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 60mm 접시에 배양하고, 5-7일 후 스페로이드를 촬영하였다. 지방 분화를 유도하기 위하여, hUCESCs을 12일 동안 60mm 접시에 hMSC Differentiation Bulletkit-Adipogenic 배지 (Lonza Biologics, Walkersville, USA)에서 배양한 후, 오일 레드 O 염색(Sigma)을 위해 포름알데히드 고정하였다.
조건 배지(Conditioned medium) 제조
10% FBS 및 항생제가 있는 DMEM:F12 배지에 세포를 3 × 104 세포/cm2의 밀도로 플레이팅하였다. 48 시간 후, 세포를 인산 완충 식염수(PBS)로 3 회 세척한 후, FBS없이 DMEM:F12에서 24 시간 또는 48 시간동안 배양하였다. 이후, 배지를 조건 배지(CM)로서 수집하고, 300g에서 10 분간 원심 분리하여 즉시 사용하거나 -20℃에서 보관하였다.
II - 결과
자궁 경부의 박리물로부터 얻은 인간 자궁 경부 줄기 세포(hUCESCs)를 면역세포화학법(immunocytochimestry) 및 유동세포 계측법을 이용하여 면역 표현형에 대해 조사하였다. 도 1A에 나타낸 바와 같이, hUCESCs은 β-catenin 및 vimentin 에 양성으로 면역표지되었고, 또한 일부 분산된 국소 세포(difuse focal cell)는 pan-cytokeratin 항체에 대하여 양성이다. 또한, hUCESCs은 배아 줄기 세포의 특징적 세가지 전사 인자, 즉 OCT4, KLF4 및 Sox2이 강하게 발현된다(도 1b). 또한, hUCESCs 표현형을 유동세포 계측법에 의해 결정하였다. 본 발명자들은 이러한 세포들이 CD29, CD44, CD73, 및 CD90에 대하여 양성인 반면에, CD34, CD45, CD133 (조혈 마커), CD117, CD31, TRA-1-81 (배아 줄기 세포 표면 마커) 및 HLA-DR에 대해 음성이라는 것을 발견하였다(도 1C).
hUCESCs 세포의 특성을 추가적으로 평가하기 위해, 그것들이 스페로이드를 형성하도록 유도하였다. 배양 7 일 후, 각각의 세포들을 무-혈청 조건 배지에서 현탁 배양하였다. 7 일 후, 상기 세포들은 동일한 구형 구조를 형성하였다(도 1D).
또한, hUCESCs의 증식 속도는 12 일 동안 매일 2 개의 웰 내 세포의 총 수를 계수함으로써 결정하였다. hUCESCs는 24 시간당 0.4-2.1 분열 속도로 증식한다.
실시예 2: 염증 관련 실험
I - 대상 및 방법
면역원성 분석
일방향 혼합 림프구 반응(MLR) 분석법을 사용하여 인간 자궁 경부 줄기 세포 (hUCESCs)의 면역원성을 확인하였다. FBS 없는 RPMI 1640 배지를 사용하여 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 MLR을 실시하였다. 두 개의 다른 공여체로부터 유래된 말초 혈액 단핵 세포(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 웰 당 공여체 당 2 × 105 세포로 플레이팅하였다. 다른 공여체들을 이용하여 PBMC 중 적어도 하나가 hUCESCs 시험 세포에 주요한 불일치라는 가능성을 최대화하였다. 분석에 사용된 자극 세포는 자가 PBMC(기준선 반응), 동종 PBMC (양성-대조군 반응), 및 hUCESCs 세포 집단을 포함하였다. 자극 세포들을 배양 웰(웰 당 2 x104, 10% 자극 세포)에 첨가시키기 전에 미토마이신 C(mitomycin C ) 처리를 하였다. 추가적인 대조군 배양은 배지 단독(자극 세포 없음)에 플레이팅된 PBMC, 콘카나발린 A(concanavalin A, ConA) 자극 PBMC 및 미토마이신 C 처리된 hUCESCs 단독으로 구성하였다. 삼중 배양은 각각의 처리를 위해 세번의 배양을 실시하였다. 증식은 세포 증식 시약 WST-1(Roche applied bioscience)로 측정하였다. 살아있는(대사적으로 활성) 세포들은 테트라졸리윰 염(tetrazolium salts)을 감소시켜 포르마잔 화합물에 대해 색깔이 나타난다; 사멸한 세포는 그렇지 않다. 따라서, 테트라졸리움 염-기반 비색 분석은 독점적으로 가시화가능한 세포를 검출한다. 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 블랭크와 같은 백그라운드 대조군에 대한 시료의 흡광도를 측정하였다. 포르마잔 산물의 흡광도를 측정하기 위한 파장은 420-480 nm 사이이다(약 440 nm에서 최대 흡광). 기준 파장은 600 nm 초과이어야 한다.
단핵구 분화의 억제
U937 세포주를 이 시험에 사용하였다. 24 웰-플레이트에 1.5 x105 세포/웰의 밀도로 10 % FBS와 항생제가 있는 DMEM:F12에 플레이팅하였다. 2ng/㎖ PMA(phorbol 12- myristate 13-acetate)를 첨가하였고, PMA 처리는 단백질 키나제 C를 활성화시키고 증가된 부착 및 대식세포 분화와 관련된 표면 마커의 발현으로 반영되는 바와 같이 U937 세포의 큰 분화 정도를 유도한다. 대조군 웰에는 PMA 용액을 첨가하지 않았다. 24 시간 후, 배지를 hUCESCs로부터의 조건 배지 또는 인간 지방-유래 줄기 세포(ASCs, StemPro® Invitrogen)로부터의 조건 배지로 바꾸고, 시험 웰은 추가적으로 24 시간 동안 두었다. 추가적인 테스트는 조건 배지의 존재하에 PMA로 자극된 U937 세포주로 구성된다. 상층액을 수집하고, 접착 세포를 세척, 트립신처리하여 해당 튜브에 수집하였다. 세포들은 200g에서 5 분간 원심 분리하고, PBS 100 ㎕에 재현탁하였다. 대식세포로의 분화는 유동세포 계측법 분석으로 단핵구 분화 마커 CD11b의 발현에 의해 측정하였다. 세포들을 PE-CD11b를 단일 클론 항체 및 7-AAD로 염색하여 세포 생존율을 평가하였다. Mac-1(CD11b) 항원은 본래 대식세포에 대한 세포 표면 마커로서 기재되었다. Mac-1 항원은 과립구 및 대식세포에 의해 C3bl으로 코팅된 입자의 부착 및 식균 작용을 매개한다. 또한, Mac-1은 표면 및 응집에 대해 과립구 주화성, 부착성을 포함하는 다양한 접착 의존 기능을 매개하는 것으로 나타난다.
조건 배지로 PBMC 증식의 억제
건강한 지원자로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Histopaque-1077(Sigma) 밀도 구배 원심 분리에 의해 헤파린처리 말초 혈액 20 ㎖을 분리하였다. 계면로부터 회수된 세포를 PBS로 두 번 세척하고, 보충된 RPMI 1640에 재현탁 하였다. PBMC 생존율은 트리판 블루 배제에 의해 결정하였다. 분리된 PBMC의 분주를 동결하고 추가적으로 사용전까지 -80℃에서 보관하였다. 실험을 위해, 동결된 PBMC의 분주를 임의로 8 개의 무관한 공여체로부터 선택하고, 해동하여 이용하였다.
PBMC 증식을 분석하기 위하여, 분리된 PBMC(2 × 105 세포/웰)을 4 일 동안 96-웰 평편-바닥 마이크로타이터 플레이트에 조건 배지(hUCESCs 또는 ASCs로부터의)와 함께 FBS 없는 DMEM:F12에 배양하고 1㎍/㎖ 콘카나발린 A(ConA)로 자극하였다. PBMC 단독 및 10-6 M 덱사메타손과 함께 ConA 자극 PBMC는 각각 기준 증식 대조군 및 억제 대조군 역할을 한다. 증식은 세포 증식 시약 WST-1로 측정하였다. 이 분석은 독점적으로 가시화된 세포를 검출한다. 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 블랭크와 같은 백그라운드 대조군에 대한 시료의 흡광도를 측정하였다.
II - 결과
일방향 MLR 분석법을 실시하여 hUCESCs의 면역원성을 측정하였다. PBMC 증식은 미토마이신 C의 존재하에서 자극 세포로 처리된 대사적으로 활성화된 살아있는 세포의 증가된 수를 기반으로 하여 측정하였다. 자가 및 동종 PBMC는 각각 음성 및 양성 자극 세포 대조군 역할을 하였다. ConA 자극 PBMC는 다른 양성 자극 대조군 세포로서 역할하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, hUCESCs는 MLR 분석에서 T 세포 증식을 유도하지 않았다.
또한, 대식세포로의 분화는 유세포 분석으로 단핵구 분화 마커 CD11b의 발현에 의해 모니터링하였다. 도 4는 hUCESCs 조건 배지의 존재하에서 자극받은 단핵구 분화의 억제를 보여준다. U937 CD11b 발현의 기준 수준은 34%이었고, PMA 처리 대조군 U937 세포와 비교하여, CD11b에 대하여 양성으로 염색된 세포들의 백분율은 PMA 처리 U937 세포의 경우 73%에서 hUCESCs 조건 배지 처리 U937 세포의 경우 48%로 감소되었다. ASCs 조건 배지로 처리된 U937 세포에 대한 CD11b 발현의 백분율은 67%이었다. 또한, U937 세포의 생존율이 모든 조건에서 80% 이상임을 주목할 가치가 있다. 이러한 데이터는 hUCESCs 조건 배지의 존재 하에서 단핵구 분화의 억제 또는 방지를 나타낸다. 도 5는 단핵구 분화의 억제를 나타낸다: 24 시간 동안 자극 및 hUCESCs 조건 배지 첨가. U937 CD11b 발현의 기준 수준은 38%이었고, PMA 처리 대조군 U937 세포와 비교하여, CD11b에 대하여 양성으로 염색된 세포들의 백분율은 PMA 처리 U937 세포의 경우 82%에서 24 시간 동안 제조된 hUCESCs 조건 배지 처리 U937 세포(CM 24 시간)의 경우 48%, 및 48 시간 동안 제조된 조건 배지 처리 U937 세포(CM 48 시간)의 경우 34%로 감소되었다. 그럼에도 불구하고 ASCs CM 48 시간 처리 U937 세포의 CD11b 발현은 77%였다. U937 세포의 생존율이 모든 조건에서 80% 이상임을 주목할 가치가 있다. 이러한 데이터는 hUCESCs 조건 배지의 존재 하에서 단핵구 분화의 억제 또는 방지를 나타내고 48 시간 조건 배지의 경우 CD11b 양성 세포의 백분율이 U937 기준 수준과 상당히 동일하다는 것을 나타낸다.
도 6은 조건 배지에 의한 PBMC 증식의 억제를 나타낸다. 24 시간 및 48 시간 hUCESCs 배지 조건 모두, PBMC 증식을 억제하였다. 억제는 ASCs 조건 배지보다 hUCESCs 조건 배지에서 더 효과적이었다. hUCESCs 조건 배지에 의한 억제의 규모는 덱사메타손의 것을 초과하였다. 덱사메타손은 더 강력한 항-염증 약물이고, 이러한 데이터는 hUCESCs 조건 배지의 높은 항-염증 가능성을 시사한다.
실시예 3. 암 관련 실험
I.- 대상 및 방법
세포 배양
MCF-7 및 MDA-MB-231 세포(인간 유방 선암 세포주)들을 European Collection of Cell Cultures (Salisbury, Wilts., UK) 으로부터 획득하였고 HT29 (대장 선암 세포주) 및 AGS(위 선암 세포주)는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 획득하였다. 이 세포주들을 90-mm 페트리 접시에서 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 DMEM으로 CO2(95:5) 대기의 37℃에서 배양하였다. 컨플루엔스된(Confluent) 세포를 인산 완충 식염수로 두 번 세척하고 PBS 중 트립신 EDTA 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 짧게 인큐베이션하여 수득하였다. 인간 자궁 경부 줄기 세포, 인간 유방 종양으로부터의 초대 배양물, 및 인간 지방-유래 줄기세포(ASCs, StemPro® Invitrogen)를 90-mm 페트리 접시에서 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 DMEM-F12(1:1)로 CO2(95:5) 대기의 37℃에서 배양하였다.
DMEM-F12(10% FBS)에서 70% 컨플루엔스로 세포를 배양하여 hUCESCs, ASCs, MCF-7 및 MDA-MB-231로부터의 조건 배지(CM)를 수득하였다. 이후, 세포들을 PBS로 3 회 세척하고, FBS 없는 DMEM-F12로 재배양하였다. 24 또는 48 시간 후, 배지를 300g에서 10 분간 원심 분리하여 상층액을 수집하여, 즉시 사용하였다.
삼차원 세포 배양을 실시하였다. 요약하면, 배양 슬라이드를 빙냉 매트리젤 (BD Biosciences) 60 ㎕로 코팅하고 37℃에서 20 분 동안 인큐베이션하여 매트리겔이 응고될 수 있도록 하였다. 세포들을 5 분 동안 0.25% 트립신-EDTA 용액(트립신2.5 g/L, EDTA 0.38 g/L) (Invitrogen)로 처리하였다. 매트리겔 2%(vol/vol)로 보충된 배지 100 ㎕ 부피 당 5 × 103 세포를 함유하는 단일 세포 현탁액을 조심스럽게 응고된 매트리겔의 상부에 배치하였다. 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션을 실시하여 세포가 매트리겔에 부착할 수 있도록 하였다. 이후, 배양 슬라이드를 6-웰 플레이트에 위치시키고, 배지 500 ㎕을 웰 당 첨가하여 세포를 10 일 동안 배양하였다. 이후, hUCESCs을 상이한 배지(10% FBS가 있는 DMEM-F12(+FBS), FBS가 없는 DMEM-F12(-FBS) 또는 hUCESCs으로부터 48시간-조건 배지)로 1 주간 처리하였다. 단층과같은 세포 또는 삼차원 배양물의 위상 대비 사진은 올림푸스 DP72 카메라로 촬영 하였다. 구(sphere) 직경의 정량은 구의 직경을 걸쳐 직선을 따라서 임의의 길이의 단위로 그 가치를 기록하여 수동으로 실시하였다.
공동-배양(co-cultures)
상술한 바와 같이 세포를 배양하였다. 배지를 70% 컨플루엔스에서 제거하고 세포들을 제조사의 지침에 따라 pre-warmed CellTrackerTM 용액(MCF-7 및 MDA-MB-231는 CellTrackerTM GREEN CMFDA, 및 hUCESCs는 CellTrackerTM RED CMPTX; Invitrogen, Eugene, USA)로 표지하였다. 이후, 1 × 105 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포/웰을 6-웰 플레이트에 플레이팅하였고, 4 시간 후에 1 × 105 hUCESCs 세포를 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포에 첨가하여, 72 시간 동안 공동 배양시켰다. 12, 48 72 시간에 고해상도 디지털 카메라(Olympus DP 72; Olympus Corp., Tokyo, Japan)로 이미지를 무작위로 촬영하였다. 카운팅 프레임(102 ㎛2)을 캡쳐된 이미지 상에 중첩시키고, 현미경 사진의 최소 3 가지 다른 구역에서 명확하게 보이는 세포만을 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여, 계수하였다.
대장 및 위암 세포주의 증식
HT29 및 AGS는 세포 증식 시약 WST-1(Roche)을 사용하여 평가하였다. HT29 및 AGS 세포주를 96-웰 편평 바닥 마이크로타이터 조직 배양 플레이트에 웰 당 2 × 104 세포로 플레이팅하였다. 24 시간 후, 세포들을 동량(150 ㎕)의 10% FBS가 있는 DMEM-F12, 10% FBS가 없는 DMEM-F12, 및 24 또는 48 시간 동안 제조된 hUCESCs로부터의 24 또는 48 시간-조건 배지, ASC로부터의 24 또는 48 시간-조건 배지로 처리하였다. WST-1 시약(15 ㎕)을 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 흡광도(440 nm)를 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 블랭크와 같은 백그라운드에 대해 측정하였다.
MTT 대사
세포 생존율/증식 실험은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 이용하여 실시하였다. MCF-7, MDA-MB-231, 또는 인간 유방 종양의 일차 배양물을 24-웰 플레이트에 웰 당 3 × 104 세포로 플레이팅하였다. 24 시간 후, 세포들을 동량(500 ㎕)의 10% FBS가 있는 DMEM-F12, 10% FBS가 없는 DMEM-F12, 및 24 또는 48 시간 동안 제조된 MCF-7, MDA-MB-231, hUCESCs, ASCs, 또는 인간 유방 종양의 일차 배양물로부터의 24 또는 48 시간-조건 배지로 처리하였다. MTT(0.5 ㎍/㎕)를 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 배지를 제거하고, DMSO(500 ㎕)를 각 웰에 첨가하였다. 샘플의 흡광도를 멀티웰 플레이트 판독기(Tecan ULTRA Evolution, Mannedorf, Switzerland)로 570 nm에서 측정하였다. 결과는 적어도 두 개의 독립적인 실험으로부터의 네번 평균 ± SD 값으로 플롯팅하였다.
웨스턴 블롯 분석
MCF-7, MDA-MB-231, 및 인간 유방 종양의 일차 배양물을 4℃에서 300 ㎕ 용해 완충액(50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 5 mM EGTA; 1.5 mM MgCl2; 1% SDS; 10% glycerol; 1% Triton X-100; 10 mM sodium orthovanadate; 4　mM PMSF, 및 50 ㎍/㎖ aprotinin)으로 용해하였다. 이후 세포 용해물을 4℃에서 5 분간 14,000 xg에서 원심분리하고, 결과물인 상층액을 회수하여, 브래드 포드법으로 단백질 농도를 측정하였다. 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 요약하면, 총 60 ㎍의 단백질을 SDS PAGE에서 전기영동하였다. 단백질들을 니트로셀룰로오스 막에 트랜스퍼하고, 블록킹하여 1차 항체(표 1 참조)로 4℃에서 밤새 면역표지하고, PBS-트윈 20으로 3 회 세척한 후, 1 시간 동안 해당 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 피어스 ECL 웨스턴 블롯팅 기질(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)로 시그널을 검출하고, 제조사의 지침에 따라, 표준 X 선 필름에 접촉시켜 블롯의 위치를 시각화하였다.
표 1: 1차 항체들
항원(Antigen) 구입처 적용
데스민 Dako ICC
CK (clone AE1/AE3) Dako ICC
액틴 HHF35 Dako ICC
활성형 카스파제-3 (asp175) Cell Signaling IHC, WB
p63 Dako ICC
사이클린 D1 (clone 7213G) Santa Cruz Biotech WB
평활근 액틴 Dako ICC
E-카트헤린 (clone NCH-38) Dako ICC
KLF4 (clone B-9) Santa Cruz Biotech ICC
OCT4 (clone 7F9.2) Millipore ICC
절단형 PARP Cell Signaling WB
Sox2 (clone SOX2-6) Sigma-Aldrich ICC
사이클린 A BD Biosciences WB
사이클린 B Santa Cruz Biotech WB
사이클린 E Santa Cruz Biotech WB
b-카테닌 (clone1) Dako ICC
비멘틴 (clone V9) Dako ICC
GAPDH Santa Cruz Biotech WB
카스파제 8 (D391) Cell Signaling WB
카스파제 9 (clone C9) Cell Signaling WB
카스파제 12 Cell Signaling WB
Bim (clone C34C5) Cell Signaling WB
Bid Cell Signaling WB
ICC: 면역세포화학(immunocytochemistry); IHC: 면역조직화학(immunohistochemistry); WB: 웨스턴 블롯(Western blot)
세포주기 및 세포 자멸( Apoptosis ) 분석
Guava flow cytometer (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)을 이용하여 세포주기 및 세포 자멸 분석법을 실시하였다. 요약하면, 2 × 105 세포/웰을 a) 10% FBS가 보충된 DMEM-F12 (1:1), b) FBS가 없는 DMEM-F12 (1:1), 및 c) 48 시간 동안 제조된 조건 배지에서 배양한 후, 회수하고 30 분 동안 70% 냉 에탄올로 고정하여, PBS로 세척하고, 암실에서 30 분 동안 리보뉴클레아제(100 ㎕/㎖) 및 요오드화 프로피듐(PI, 50 ㎍/㎖)으로 인큐베이션하여 세포주기를 측정하였다. 세포자멸사 분석은 아넥신 V-FITC를 사용하여 실시하였다. 세포를 수확하여 PBS로 두 번 세척하고, 1X 결합 완충액(0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 및 25 mM CaCl2)에 재현탁하였다. FITC-아넥신 V 5㎕를 첨가하고, 실온의 암실에서 15 분간 인큐베이션하였다. 최종적으로, 1X 결합 완충액 400 ㎕을 각 튜브에 첨가하여 분석하였다. 아넥신 V 양성 및 PI 음성은 초기 세포 자멸을 나타내는 반면, 아넥신 V 음성 및 PI 양성은 후기 세포 자멸을 나타낸다.
세포 침윤 분석
제조사의 지침(BD Biosciences)에 따라 BD BioCoatMatrigel 침윤 챔버에서 분석을 실시하였다. 매트리겔로 전코팅된 필터를 이용하여 세포 침윤을 검사하였다. MDA-MB-231 세포를 DMEM 무혈청 배지 0.5 ㎖의 상부 챔버에 위치시켰다(필터 당 5x104 세포). 배양 48 시간의 hUCESCs 조건 배지를 20% FBS의 하부 챔버에 배치 하였다. 22 시간 배양 후, 필터의 하부 표면으로 이동한 세포를 실온에서 2 분 동안 메탄올로 고정하고, 2 분 동안 크리스탈 바이올렛을 이용하여 염색하여 가시화하고 계수하였다. 세포 이동 또는 침윤의 값은 중복 실험한 필터 당 네 개의 구역 전체 미세구역 당 세포의 평균 수로서 표현하였다. 실험은 3 회 반복하였다.
동물 연구
심한 결합 면역 결핍 자발적인 돌연변이에 대해 동형 접합체 6-8주령 암컷 마우스(CB17-Prkdcscid, 명명 SCID, Parc Recerca Biomedica, Barcelona, Spain)를 이종이식(xenografting)에 이용하였다. 좌우 플랭킹된 pcDNA3-루시퍼라제 벡터(MDA-MB-231-luc cells)로 안정적으로 형질전환된 3x106 MDA-MB-231 세포를 13 마리 SCID 마우스(6 대조군 및 7 처리군)에게 피하주사하였다. 세포 주입 15 일 후, 마우스에게 47 일까지 매 5 일마다 hUCESCs로부터의 48 시간-조건 배지(CM) 또는 위약(150 ㎕)을 종양내부(intratumoural) 주사하였다. 루시페린 주입(150 ㎎/㎏) 후, 종양의 성장을 생체 내 이미징 시스템(IVIS, Caliper Life Sciences, Alameda, CA, USA)을 이용하여 발광에 의해 외부 모니터링하였다. 강도 맵은 Living Image software (Caliper Life Sciences)를 사용하여 획득하였다. 이 소프트웨어는 각 픽셀의 강도(낮음을 나타내는 파란색부터 높음을 나타내는 빨간색까지 범위)를 표현하는 색깔-기반 스케일을 이용한다. 하나의 대조군 및 하나의 CM-처리 마우스를 31 일째에 희생하고, 종양을 분리하여, 24 시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고, 파라핀에 포매하여 조직학적 및 면역조직화학 연구에 이용하였다. 모든 나머지 마우스를 생존 분석에 대해 관찰하였다.
면역조직화학
마우스 종양을 24 시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 침지-고정시키고 일반적으로 파라핀에 포매하였다. 4 ㎛ 두께 섹션을 플렉스 IHC 현미경 슬라이드(Dako, Glostrup, Denmark)상에 봉입하였다. 면역조직화학(IHC) 기술을 자동화 AutostainerLink 48(Dako)로 실시하였다. 활성형 카스파제 3 항체(Cell signalling)를 이용하였다. 에피토프 회복은 EnVision FLEX 타겟 회복 용액(pH 9)을 사용하여 전자 레인지로 20분 실시하였다. 모든 항체는 20 분 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 검출 시스템으로서 본 발명자들은 EnVision FLEX/HRP Dako(홀스래디쉬 퍼옥시다제 및 친화성-분리 고트 항-마우스 및 항-래빗 면역 글로불린이 결합된 덱스트란 중합체)폴리머)를 20 분 동안 사용하였다.
II- 결과
인간 암세포의 증식에 미치는 hUCESCs 의 영향
암 세포주에 대한 hUCESCs의 가능한 효과를 확인하기 위해, 48 시간 동안 완전 배지(대조군), 불완전 배지(w/o FBS), 24 시간 또는 48 시간 동안 제조된 hUCESCs로부터의 조건 배지 및 48 시간 동안 제조된 ASCs로부터의 조건 배지로 처리된 대장암(HT29) 및 위암(AGS) 세포주에 대해서 세포 증식 분석을 측정하였다. 대장암과 위암 세포의 증식에 대한 hUCESCs 조건 배지의 효과는 ASC로부터의 조건 배지의 그것보다 강력했다(도 7A).
hUCESCs로부터의 조건 배지(CM)의 투여 후 유방암에 대한 hUCESCs의 가능한 효과를 확인하기 위해, 비-침윤성 인간 유방암 세포주 MCF-7 및 고 침윤성 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231에서의 증식/세포독성을 평가하였다. 도 7B-C에 나타낸 바와 같이, FBS 없는 배지, 또는 MCF-7로 24 시간 또는 48 시간 제조된 CM을 처리된 세포와 비교하여, hUCESCs으로부터 CM(24 또는 48 시간)을 MCF-7 세포에 투여한 지 24 및 48 시간 후, MTT 대사의 유의한 감소가 관찰되지 않았다. 그러나, hUCESCs로부터의 동일한 CM을 MDA-MB-231 세포주에 투여한 경우, 세포 증식의 유의한 감소는 24 시간(48 시간 동안 배양된 hUCESCs로부터의 CM, P<0.01) 및 48 시간(24 시간 및 48 시간 동안 배양된 hUCESCs로부터의 CM, 각각 P<0.01 및 P<0.001)에 나타난다(도 7D-E). 세포 증식에 hUCESCs으로부터 CM의 영향이 MCF-7 또는 MDA-MB-231와 hUCESCs의 공동-배양에 의해 유지될 수 있는지 또는 CM에만 의존적인지 여부를 평가하기 위하여, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포들은 녹색 염료로, hUCESCs은 빨간색 염료로 표지하였다. hUCESCs와 공동-배양된 MCF-7 세포는 단독 배양된 MCF-7처럼 성장한 반면(도 7F), hUCESCs와 공동-배양된 MDA-MB-231 세포는 MDA-MB-231 세포 단독의 성장과 비교하여, MDA-MB-231 세포의 수가 유의하게 감소한 것으로 나타났다(P<0.01)(도 7G).
MDA -MB-231 세포주에서 hUCESCs 로부터의 조건 배지는 세포주기를 지연시키고 세포 자멸사를 유도한다
hUCESCs로부터 CM이 유의하게 MDA-MB-231 세포의 증식을 감소시킨다는 점으로 볼 때, 이러한 감소의 가능한 매개자로서의 세포주기 및 세포 자멸을 평가하였다. MDA-MB-231 세포를 10% FBS가 있는 DMEM(+FBS), FBS가 없는 DMEM(-FBS), 또는 hUCESCs로부터의 48 시간 CM으로 48 시간 동안 배양한 후, 본 발명자들은 PI(propidium iodide)(세포주기를 평가), 및 아넥신 V/PI를 이용하는 유동 세포 계측법을 실시하여 세포자멸을 평가하였다. 또한, 웨스턴 블롯을 실시하여 세포주기 및 세포 자멸 모두에 관여하는 단백질의 발현을 평가하였다. 이러한 결과는 CM-처리 세포들이 완전(+ FBS) 또는 불완전(-FBS) 배지로 처리된 세포와 관련하여 G0-G1 단계를 유의하게 증가시킨다는 것을 나타낸다(도 8A). 따라서, cyclin A, cyclin B, 및 cyclin D1 단백질 발현의 보이는 감소는 CM-처리 세포에서 관찰되었다(도 8B). CM과 MDA-MB-231 세포의 처리는 아넥신+/PI-, 및 아넥신+/PI+ 세포 vs FBS 없이 배양된 세포의 유의한 증가를 유도하였고, 이는 CM이 초기와 후기 세포 자멸 각각을 유도한다는 것을 제시한다(도 8C). CM으로 처리된 MDA-MB-231 세포로부터의 단백질 추출물의 면역 블롯은 완전(+FBS)과 불완전(-FBS) 배지로 처리된 세포에 대해서 카스파제-8, -12, -11, 활성형 카스파제-3, 및 절단형 PARP의 명확한 증가(도 8D), 및 Bid 및 Bim의 감소(도 8E)를 나타냈다.
침윤, 3-D 배양물 형성, 종양 성장 및 생존율은 hUCESCs 로부터의 조건 배지에 의해 변화된다
hUCESCs로부터의 CM이 매트리겔 매트릭스를 통해 MDA-MB-231 세포의 침윤에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. 도 9A는 불완전 배지(-FBS)의 존재 하 세포와 비교하여, CM의 존재 하에서 MDA-MB-231 세포의 침윤능의 상당한 감소를 나타낸다(P<0.001). 또한, MDA-MB-231 세포의 삼차원 성장을 확인하였다. 이 실험을 위해, MDA-MB-231 세포는 그것들이 구형 구조를 형성하는 반고체 배지인 매트리겔에서 배양하였다. 세포를 불완전 배지로 처리한 경우 주목할만하지 않았던 이러한 구체의 직경에 있어 CM 처리는 상당한 감소를 나타냈다(CM, 평균 직경 = 2.8 + 1.0 vs -FBS, 평균 직경 = 5.7 + 1.6, 임의의 단위, P = 0.023)(도 9B).
SCID(severe immunodeficient) 마우스 종양 이종 이식 모델을 사용하여 생체 내에서의 CM의 종양 내 투여 효과를 다음과 같이 평가하였다. 루시퍼라제 벡터로 안정적으로 형질전환된 MDA-MB-231 세포를 마우스 유방 지방 패드에 주입하고, 15일 후, 종양이 눈으로 확인되는 경우, 그것들을 매 5 일마다 불안전 배지(대조군) 또는 hUCESCs로부터의 CM(150 ㎕)와 함께 종양내부(intratumoural)에 주사하고 발광으로 외부 모니터링하였다(도 9C). 종양 부피에서 유의한 감소(P = 0.011)는 CM 처리 15일 후(30일째)에 관찰되었다(도 9D). 33 일 째에, 두 동물(하나의 대조군 및 하나의 CM-처리 마우스)를 희생하여, 종양을 제거하고, 활성형 카스파제-3(세포 자멸의 지표)에 대한 면역조직화학으로 분석하였다. 도 9E는 CM-처리 마우스에서의 활성형 카스파제-3 발현의 상당한 증가를 나타낸다. 마우스의 생존율을 평가하기 위하여, 나머지 마우스는 CM 또는 위약을 매 5 일 마다 주사하여, 47 일 째까지 관찰하였다. 도 9F에 나타낸 바와 같이, 카플란-마이어 생존 플롯은 CM 처리한 마우스가 대조군 마우스에 비해 전체 생존율이 길다는 것을 나타낸다(P = 0.019).
조건 배지는 높은 증식율와 함께 종양의 증식을 감소시킨다
유방암 환자로부터의 일차 배양물에서 hUCESCs으로부터 CM의 투여 효과를 다음과 같이 평가하였다. 따라서, 10 유방암 일차 배양물을 MTT 분석을 이용하여 세포 증식을 평가하였다.
낮은 증식율의 유방암 세포(11B3186, 11B2445, 11B530, 11B545, 11B980 및 11B2127)에서, hUCESCs로부터의 CM의 투여는, 불완전 배지(-FBS), CM 자체, ASCc(adipose-derived stromal cells)으로 제조된 CM에 의해 생성된 효과에 비해 유의한영향을 미치지 않았다. 높은 증식율의 유방암으로부터의 일차 배양물(11B512, 11B3285, 11B3171 및 11B7352)에서, hUCESCs로부터의 CM의 투여는, 다른 처리들과 비교하여 세포 증식에 있어 유의한 감소를 유도하였다(P<0.001)(도 10A). 또한, 높은 증식율의 이러한 일차 종양으로부터의 단백질 추출물의 cyclin D1 및 절단형 PARP 발현을 평가하였다. 그 결과를 도 10B에 나타내었다. hUCESCc로부터의 CM을 투여한 경우, cyclin D1 및 PARP 절단의 발현에 있어 명확한 감소가 관찰되었으나, 불완전 배지(FBS 무첨가)로 처리한 일차 배양물에서는 그렇지 않았다.
실시예 4: hUCESCs 에 의한 병원성 미생물의 성장 억제
I - 대상 및 방법
사용된 균주는 다음과 같다: E. coli (ATCC 25992), 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus , ATCC 29213), 및 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis, ATCC 51299).
일련의 희석에 의한 멀티웰 플레이트에서의 성장 억제
병원성 미생물의 성장 억제를 96 마이크로웰 플레이트 배양에서 측정하여 항 미생물 활성을 갖는 배지의 최대 희석을 결정하였다. 간단히, 대조군(FBS 없이 DMEM-F12 배지) 및 조건 배지(hUCESCs 또는 지방 조직-유래 MSC)의 일련의 1:2 희석 100 ㎕ 및 일련의 1:2 희석 75 ㎕를 96 웰 플레이트에 넣었다. 이어서, 뇌 심장 액체 배지의 박테리아 현탁액(0,5 맥팔랜드 현탁액의 1:300 희석)을 각 웰에 첨가 하였다. 플레이트를 24 시간에서 48 시간까지 37℃에서 인큐베이션하였다. 박테리아 증식 억제를 hUCESCs 또는 지방 조직-유래 MSC 조건 배지를 함유하는 웰에 대조군 웰과 비교하여 결정하였다.
hUCESCs 및 이의 조건 배지에 의한 박테리아 성장 억제
각 실험 대장균(E. coli, ATCC 25992) 콜로니들을 냉동 스톡으로부터 접종하고, 37℃에서 액체 루리아- 베르타니(LB) 배지(Difco BD, USA)로 약하게 교반하여 밤새 배양하였다. 각 실험 전에, 박테리아 세포들을 1 회 세척하고, PBS에 재현탁하여, 현탁액의 광학 밀도(λ=600 nm에서 OD)를 측정하였다. CFU의 수는 다음과 같은 식에 따라 계산하였다: OD600 =1.0은 E. coli에 대하여 4 × 108 CFU/㎖에 해당ㅎ한다. hUCESCs 또는 이의 조건 배지(CM)에 의한 박테리아의 성장 직접 억제의 평가 는 CFU를 계산하고 OD를 판독하여 실시하였다.
간단히, 24-웰 플레이트에서, 300 CFU 대장균을 a) 10% FBS가 보충된 DMEM/F-12-HAM(1:1) 내 2 × 105 hUCESCs, b) 동일한 배양 배지 내 2 × 105 NHF(normal human fibroblasts), 및 c) 배양 배지 단독에 첨가하였다. 이어서, 배양물들을 CO2 가습 배양기에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 광학 밀도를 37℃에서 LB에 감염된 배양물들 2 시간 성장 후 측정하였다. CFU 정량은 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후 LB-한천 플레이트에서 실시하였다. 나머지 감염 배지를 10 분 동안 15,000 rpm으로 원심 분리하고 -20℃에서 동결시켰다(임의의 잔존 박테리아 미생물을 제거). 샘플을 얼음 위에서 해동하고, 분주들을 96-웰 플레이트에 옮기고, 100 CFU 대장균을 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 OD 및 CFUs를 상술한 바와 같이 계산하였다.
II- 결과
일련의 희석에 의한 멀티웰 플레이트에서의 성장 억제
대조군 배지의 모든 희석액에서 박테리아 성장이 나타냈다. hUCESCs 조건 배지는 최대 1/20 희석액까지 박테리아 성장의 억제를 나타내었으나, 지방 조직-유래 MSC 조건 배지에서는 어떠한 항균 활성을 나타내지 않았다(도 11).
hUCESCs 및 이의 조건 배지에 의한 박테리아 성장 억제
인간 hUCESCs은 대조군 배지 및 대조군 NHF 세포 모두와 비교하여 유의하게 모두 대장균 세균 증식을 억제하였다(p<0.001). CFU 및 OD 정량 모두는 대조군(배지 단독 및 NHF)과 비교하여 각각 콜로니 수(도 12) 및 흡광도(도 13)의 약 50% 감소를 나타냈다. hUCESCs로부터 유래된 감염 배지는 hUCESCs와 같이 대장균에 대해 동일한 효과를 나타냈다. 이러한 결과들은 항균 효과가 hUCESCs에 의한 일부 가용성 인자에 의해 생성된다는 것을 시사한다.
실시예 5: 조직 재생 관련 실험: 안구 건조 랫트 모델에서의 hUCESCs조건 배지에 의한 알칼리 각막 상피 상치 치유(Alkali corneal epithelial wound healing).
I - 대상 및 방법
200-250 g 무게의 15 마리 암컷 Sprague-Dawley 랫트를 본 실험에 이용하였다. 모든 동물은 NaOH(0.375 ㎖)에 넣은 케타민(0.425 ㎖) 및 자일라신(xilacine) (0.2 ㎖)의 혼합물을 복강 내 주사하여 마취시켰다. 실험 말기에, 모든 랫트들은 CO2 흡입에 의해 희생되었다.
안구 건조 모델
15 마리 랫트 중 3 마리는 건강한 눈을 유지하도록 하고, 나머지 12 마리 랫트는 마취하여 안외 눈물샘(extraocular lacrimal gland)을 양 방향으로 절제하여 건조한 눈을 만들었다. 안외 눈물샘은 랫트의 세 눈물샘 중 하나이다. 이 샘은 눈물을 생성하는 주요 샘이며 쉽게 접근할 수 있는 샘이다(도 14A). 수술 일주일 후, 눈물 생산을 쉬르머 검사(Laboratorios Cusi SA, Barcelona)로 측정하였다. 종이 스트립을 2mm 폭으로 절단하여 적용하였다. 스트립의 끝은 길이 1mm 길이로 접어 5 분 동안 눈꺼풀 아래에 도입시켰다. 이후, 접힌 표시로부터 젖은 스트립의 길이를 측정하였다(도 14B, C). 모든 12 랫트의 눈은 건조한 것으로 나타났다.
각막 알칼리 상처 및 검사
60 초간 2㎕ NaOH (1 mol/l)에 담근 와트만 페이퍼 (2x2mm)의 조각을 적용하여 중앙 각막 알칼리 상처를 양쪽 눈에 생성하였다. 이후, 각막을 30 초간 식염수로 세정하였다. 모든 랫트는 이전에 상술한 바와 같이 마취시켰다. 마취된 랫트의 각막 표면의 플루오레세인(Colircusi Fluoresceina, Alcon Cusi S. A., El Masnou-Barcelona) 염색 후 손상된 상피 세포가 눈에 보였다. 각막은 푸른 조명 아래 수술 현미경(Takagi OM-5 220-2, JAPAN)에 부착된 디지털 카메라(Nikon D200, Tokio, Japan)로 촬영하였다. 각막 손상의 정량적 측정은 눈 표면의 화소의 전체 개수에 대한 플루오레세인 착색 화소의 수로 계산하여 무료 상용 소프트웨어 ImageJ (Softonic International, SL)로 사진 상에서 실시하였다.
그룹 및 처리
15 마리 랫트를 각 3 마리씩 5그룹으로 나누었다. 각막 병변이 없는 건강한 눈의 1 개의 그룹(정상 그룹) 및 양쪽 눈이 건조하고 각막 알칼리 화상이 있는 4 개의 그룹(CM, M, SH 및 비-처리 그룹들)이었다. 처리는 하루에 4 번의 안약 투여의 국소 적용으로 이루어졌다:
CM 그룹: 조건 배지. M 그룹: 세포와 어떠한 이전 접촉이 없는 배양 배지(DMEM-F12; Gibco, Life Technologies, Paisley, UK).
SH 그룹: 소디윰 히알루론산(0.015 g/10 ㎖)으로 점안.
비처리 그룹: 처리 없음.
조건 배지(CM)
인간 자궁 경부 중간엽 줄기세포(본 발명의 세포)를 48 시간 동안 37℃, CO2(95:5) 대기에서, 5 ㎖ DMEM-F12(Gibco, Life Technologies, Paisley, UK) 배지로 70% 컨플루엔스가 될 때까지 90-mm 페트리 접시에서 배양하였다. 이후, 소브레나단트(sobrenadant)를 수집하여 냉동하여, 건조한 후 사용전까지 -80℃에서 저장하였다. 건조 분말은 사용 직전 ddH2O에 재현탁하였다.
조직학
실험 말기에, 각막 알칼리 화상 5 일 후, 한 마리의 랫트를 임의로 각 그룹으로부터 선택하여 희생시키고, 안구를 적출하여 10% 중성 완충 포르말린에 침지-고정하였다. 24 시간 후, 각막을 안구로부터 분리하고 에탄올(70%)에 침지하였다. 이후, 각막을 파라핀에 포매하여 20 ㎛ 섹션을 봉입하고 헤마톡실린-에오신(H-E)로 염색하여 조직학적으로 평가하였다.
mRNA 발현 분석
실험 말기에, 각막 병변 5 일 후, 각 그룹의 나머지 2 마리 랫트를 희생시키고, 각막을 분리하였다. 각막의 MIP-1α(macrophage inflammatory protein-1 alpha), MCP-1(monocyte chemotactic protein-1) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha) mRNA 발현 수준을 실시간 중합 효소 연쇄 반응(real-time PCR)을 사용하여 평가하였다. 총 RNA는 트리졸(Invitrogen)를 사용하여 각막으로부터 분리 하였다. Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics)와 30 ㎕의 반응액에서 RNA(1㎍)로부터 cDNA 를합성하였다. iCycler equipment (7500 PCR Systems, Applied Biosystems-Life Technologies) 상에서 iQ SYBRGreen Supermix (Bio-Rad) 를 이용하여 20 ㎕ 부피의 2㎍ cDNA로 정량 실시간 PCR의 반응을 실시하였다. 샘플은 10 초 동안 94℃에서 변성, 10 초 동안 58℃에서 어닐링, 10 초 동안 72℃에서 연장의 총 35 사이클을 실시하였다. 샘플은 내생 대조군인 β-액틴으로, Sequence Detection Software 1.4 (Applied Biosystems)를 사용하여 정량하였다. 올리고뉴클레오티드 서열은 표 2에 기재되어있다.
표 2: 실시간 PCR용 프라이머 셋트.
유전자 정방향 프라이머 (5'-3') 역방향 프라이머 (5'-3')
MIP-1α ATGAAGGTCTCCACCACTGC (SEQ ID No. 1) AAAGGCTGCTGGTCTCAAAA (SEQ ID No. 2)
MCP-1 ATGCAGTTAATGCCCCACTC (SEQ ID No. 3) TTCCTTATTGGGGTCAGCAC (SEQ ID No. 4)
TNF-α TCAGTTCCATGGCCCAGAC (SEQ ID No. 5) GTTGTCTTTGAGATCCATGCCATT (SEQ ID No. 6)
β-액틴 GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA (SEQ ID No. 7)
 GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG (SEQ ID No. 8)
데이터 분석
값은 평균 ± 표준 편차로 표현된다. 평균은 post hoc 비교에 대한 Tukey's range 시험으로, 일방향 ANOVA를 사용하여 비교하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. MATLAB R2011a Version7.1 (MathWorks, Inc) 소프트웨어를 모든 계산에 사용하였다.
상피 재생(epithelial regeneration)(% ER)의 백분율은 하기 공식으로 계산하였다:
%ER = 100(mi - mf)/mi
상기 mi는 각막 손상(알칼리 화상 직후)의 첫번째 측정이고 mf는 48시간 후 최종 측정이다. 두 측정은 각막의 전체 면적에 대한 상처 면적의 백분율로 나타낸다.
II - 결과
상피 회복에 미치는 영향
플루오레세인 각막 상피 염색은 상피 결손을 나타낸다(도 15A). 방법에서 설명된 바와 같이 각 그룹에 대한 상피 재생(%의 ER)의 백분율을 계산하였다. 알칼리 화상 15 시간 후 각막 표면은 다른 그룹보다 CM 처리 군에서 유의하게 빨리 회복되었다(p < 0.005, 일방향 ANOVA; 도 15B). 상피 재생(ER)의 평균은 다음과 같다: CM 그룹 62 ± 5 %; M 그룹 34 ± 15 %; SH 그룹 32 ± 15 % 및 비처리 그룹 36 ±13 %. 알칼리 화상 5 일 후 각막 표면은 모든 처리 그룹들이 거의 완벽하게 회복되었으나, CM 처리 그룹(> 75 %)이 비처리 그룹에 비해 여전히 유의하게 빨리 회복되었다(p = 0.005, 일방향 ANOVA; 도 15C). ER의 평균은 다음과 같다: CM 그룹 92 ± 4 %; M 그룹 77 ± 15 %; SH 그룹 74 ± 15 % 및 비처리 그룹 62 ± 16 %.
5 일에 알칼리 각막 상피 상처 봉합은 각막 섹션 염색 후 비교하였고, 각막 상피는 다른 그룹에 비해 CM 처리 그룹이 빨리 재생되었다.
항-염증 효과
CM 감쇠(attenuate) 염증에 의해 가능한 기전을 조사하기 위해, 본 발명자들은 화학주성 인자 MIP-1α 및 MCP-1 및 면역자극 사이토카인 TNF-α의 생성을 평가하였다. 본 발명자들은 MIP-1α, MCP-1 및 TNF-α의 수준이 비처리 그룹(병변이 있으나 비처리)을 포함한 나머지 그룹들과 비교하여 M 그룹(줄기 세포와 전혀 접촉하지 않은 배양 배지로 처리한 그룹)에서 매우 높은 것을 발견하였다(P <0.05; 일방향 ANOVA; 도 17). 그러나, 줄기세포로 사전 접촉한 동일한 배양 배지로 처리한 그룹(CM 그룹)은 M 군과 비교하여 모든 MIP-1α, MCP-1 및 TNF-α의 수준이 낮았다(p <0.05; 일방향 ANOVA; 도 4). 이 결과는 사용된 배양 배지(DMEM-F-12)가 병변의 이러한 유형에 대해 전염증성(proinflammatory) 효과를 가지고 있으며, 이러한 효과는 배양된 줄기 세포에서 분비된 일부 인자에 의해 콘트라레스트(contrarest)되었다는 것을 의미한다. 또한, CM 그룹에서 MIP-1α의 수준은 병변없는 그룹(No Les group, 각막 병변 없음)의 것과 유사하였고, 다른 처리 그룹(M 및 SH) 및 비처리 그룹에 비해 낮았다(p < 0.05; 일방향 ANOVA; 도 17B). 이 결과는 손상된 각막에 대한 CM의 항-염증 효과를 나타낸다.
실시예 6 : 생식 세포의 선별에 관한 실험: 정자에 대한 hUCESC 조건 배지의 효과.
I - 대상 및 방법
조건 배지(CM)를 동결 건조하고 세 가지 농도 0.5:1, 1:1 및 4:1로 재구성하였다. 실험은 신선한 정액 및/또는 수정능획득 정자(capacitated spermatozoa)로 0 시간(T0), 3 시간(T3) 및 24 시간(T24)에서 실시하였다.
정액 분석
광학 현미경을 사용하여 2010 세계 보건기구(WHO)의 지침에 따라 정액 분석을 실시하였다. 액화한 후 정액 5 ㎕을 Neubauer counting chamber (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel)에 로딩하였다. 전체 정자 수 (× 106/㎖) 및 백분율 운동성을 수동으로 측정하였다. 최소 200 세포들을 5 ㎕ 방울마다 계수하고, 최소 두 방울을 샘플 당 연구하였다. 정자 활력을 염료 배제법으로 연구하고, 또한 WHO 지침에 따라 에오신 레드 및 니그로신을 사용하였다.
산화 스트레스의 평가
DHE(Dihydroethidium)는 510 nm에서 흥분할 때 빨간색 핵 형광을 발생하는 DNA-민감 형광 색소를 생산하는 산화시 Et+(ethidium) 의 저조한 형광성 2-전자 환원 산물이다. 이 프로브로 얻은 결과는 수퍼 옥사이드 음이온의 명확한 식별을 포함 ROS를 생성하는 인간 정자의 능력의 척도로서 확인되었다. 세포 내 ROS 생산 분석을 위하여, DHE(3 μM)를 PBS 완충액에 희석시키고 최종 부피 500 ㎕의 0.5x106 신선한 정자에 첨가하였다. 이후 세포를 실온에서 45 분 동안 암실에서 인큐베이션하고, 2회(2000 rpm, 5 분) 세척하여, 결과물 적색(HE) 형광을 FACScan 형광 분석기를 사용하여 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 데이터는 형광 정자의 백분율로 표시하였다.
원형질막(plasma membrane)의 무결성(integrity)의 평가
미토콘드리아 원형질막의 무결성은 정자 운동성 및 활력과 양성적으로 관련이 있었고, 세포 자멸과 음성적으로 관련이 있었다. 산화적 인산화 과정 동안, 양성자는 미토콘드리아 내부에서 외부로 펌핑되어, 미토콘드리아 내막 전위(mitochondrial membrane potential, MMP)라는 전기 화학적 구배를 생성한다. 낮은 MMP를 갖는 것부터 높은 MMP를 나타내는 미토콘드리아 간을 구별하는 능력은 미토콘드리아 대사 기능과 막 무결성의 엄격한 평가를 제공한다. 정자에서의 MMP의 평가는 DiOC6(3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide) 형광 염료를 이용하여 유세포 분석에 의해 실시하였다. 간단히, 각 샘플로부터의 신선한 정자(0.5 × 106)는 최종 부피 500 ㎕로 45 분 동안 37℃의 수조에서 DiOC6(HTF 배지에 희석된 0.1 nM)과 함께 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 PBS로 2회 세척하고, 500 ㎕ PBS 완충액에 재현 탁하여 유세포분석으로 분석하였다. 또한, 음성 대조군으로 정자 샘플을 1mM CCCIP(uncoupler carbamoyl cyanide m-chlorophenylhydrazone)와 함께 인큐베이션하였다.
II - 결과
hUCESC 조건 배지(CM)는 농도와 시간에 따라 정자의 특성에 미치는 영향을 나타낸다(표 3). 대조군(CM 없는)에 비해, CM 4:1은 T3 및 T24에서 정자 특성의 모든 백분율의 감소를 나타낸 반면, CM 1:1은 T24에서 운동성, 활력, 산화 스트레스 및 막 잠재력에 대한 높은 효과를 나타낸다.
표 3: hUCESC 조건 배지 농도에 따른 정자 특성.
대조군 (w/o CM) CM 1:1인 정액 CM 4:1인 정액
T 0
운동성 진전(Motility progression) (%) 37 35 36
총 운동성(Total motility) (%) 51 53 53
정자 활력(Sperm vitality) (%) 79 79 77
산화 스트레스(Oxidative stress) (%) 18 15 17
미토콘드리아 내막 전위(Mitochondrial membrane potential) (%) 57 53 58
T 3
운동성 진전(Motility progression) (%) 39 21 3
총 운동성(Total motility) (%) 56 51 8
정자 활력(Sperm vitality) (%) 67 62 10
산화 스트레스(Oxidative stress) (%) 19 19 34
미토콘드리아 내막 전위(Mitochondrial membrane potential) (%) 29 32 15
T 24
운동성 진전(Motility progression) (%) 30 3 1
총 운동성(Total motility) (%) 42 8 4
정자 활력(Sperm vitality) (%) 61 10 6
산화 스트레스(Oxidative stress) (%) 27 48 52
미토콘드리아 내막 전위(Mitochondrial membrane potential) (%) 26 8 4
표 4에서 hUCESC CM 1:1은 신선한 정액 및 수정능획득 정자(capacitated spermatozoa)의 정자 특성에 있어 hUCESC CM 0.5:1보다 높은 효과를 나타낸다. hUCESC CM은 수정능획득 정자보다 신선한 정자에서 높은 효과를 나타내고, 이는 고급 정자를 선별하는데 도움이 된다.
표 4:
농도 0,5:1 농도 1:1
신선한 수정능획득 신선한 수정능획득
1 2 1 2 1 2 1 2
T 0
운동성 진전(Motility progression) (%) 61 71 85 78 61 71 85 78
총 운동성(Total motility) (%) 67 82 90 88 67 82 90 88
정자 활력(Sperm vitality) (%) 71 77 94 89 71 77 94 89
산화 스트레스(Oxidative stress) (%) 35 24 13 21 35 24 13 21
미토콘드리아 내막 전위(Mitochondrial membrane potential) (%) 64 60 68 59 64 60 68 59
T 3
운동성 진전(Motility progression) (%) 57 71 76 68 41 58 80 60
총 운동성(Total motility) (%) 63 80 89 76 59 70 88 68
정자 활력(Sperm vitality) (%) 64 65 77 74 42 41 52 55
산화 스트레스(Oxidative stress) (%) 40 25 14 14 17 30 38 28
미토콘드리아 내막 전위(Mitochondrial membrane potential) (%) 61 68 79 78 74 62 32 64
T 4
운동성 진전(Motility progression) (%) 4 7 26 12 3 1 5 2
총 운동성(Total motility) (%) 9 9 45 27 15 2 24 10
정자 활력(Sperm vitality) (%) 22 19 25 27 27 24 19 12
산화 스트레스(Oxidative stress) (%) 51 47 21 44 36 69 58 68
미토콘드리아 내막 전위(Mitochondrial membrane potential) (%) 45 41 61 39 51 23 31 20
<110> FUNDACION PARA LA INVESTIGACION CON CELULAS MADRE UTERINAS <120> HUMAN UTERINE CERVICAL STEM CELL POPULATION AND USES THEREOF <130> PCT2815.3 <150> EP13156348.8 <151> 2013-02-22 <160> 8 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIP-1 Forward primer <220> <221> source <222> (1)..(20) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="MIP-1 Forward primer (5'-3')" /organism="Artificial Sequence" <400> 1 atgaaggtct ccaccactgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIP-1 Reverse primer <220> <221> source <222> (1)..(20) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="MIP-1 Reverse primer (5'-3')" /organism="Artificial Sequence" <400> 2 aaaggctgct ggtctcaaaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 Forward primer <220> <221> source <222> (1)..(20) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="MCP-1 Forward primer (5'-3')" /organism="Artificial Sequence" <400> 3 atgcagttaa tgccccactc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 Reverse primer <220> <221> source <222> (1)..(20) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="MCP-1 Reverse primer (5'- 3')" /organism="Artificial Sequence" <400> 4 ttccttattg gggtcagcac 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF- a Forward primer <220> <221> source <222> (1)..(19) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="TNF-a Forward primer (5'-3')" /organism="Artificial Sequence" <400> 5 tcagttccat ggcccagac 19 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF- a Reverse primer <220> <221> source <222> (1)..(24) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="TNF-a Reverse primer (5'-3')" /organism="Artificial Sequence" <400> 6 gttgtctttg agatccatgc catt 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin Forward primer <220> <221> source <222> (1)..(23) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="b-actin Forward primer (5'-3')" /organism="Artificial Sequence" <400> 7 ggagattact gccctggctc cta 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin Reverse primer <220> <221> source <222> (1)..(24) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="b-actin Reverse primer (5'-3')" /organism="Artificial Sequence" <400> 8 gactcatcgt actcctgctt gctg 24

Claims (20)

  1. 다음 단계를 포함하는 자궁 경부 줄기 세포를 분리하는 방법:
    (a) 분리된, 비-월경 상태(non-menstrual phase)의 자궁 경부 조직으로부터 세포 현탁액을 제조하는 단계,
    (b) 상기 세포 현탁액으로부터 세포들을 회수하는 단계,
    (c) 세포들이 증식할 수 있는 적합한 세포 배양 배지 및 조건 하에서 상기 (b) 단계의 세포들을 인큐베이션하는 단계, 및
    (d) 상기 (c) 단계의 세포에 대해 세포 마커를 이용하여, 분리된 비-월경 상태의 자궁 경부 줄기세포를 선별하는 단계로서,
    상기 분리된 비-월경 상태의 자궁 경부 줄기세포는,
    CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, 비멘틴(vimentin), 사이토케라틴(cytokeratin)(CKAE1AE3), Klf4, Oct4 및 Sox-2로 이루어진 군으로부터 선택된 최소 1 종의 세포 마커를 발현하고; 및
    데스민(desmin), 액틴 HHF35, β-카테닌, p63, E-카드헤린(cadherin), CD117, CD133, HLA-DR, TRA1-81, CD45, CD34 및 CD31로 이루어진 군으로부터 선택된 최소 1 종의 세포 마커를 발현하지 않음.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 자궁 경관 점액(cervical mucus)을 효소적으로 분해하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기 세포는 추가적으로 다음과 같이 나타나는 것인 방법:
    (a) 성장 배지에서 24 시간 당 0.4 내지 2.1 세포 분열 증식 속도,
    (b) 섬유 아세포와 같은 형태,
    (c) 최소 10 계대 동안 안정적인 핵형,
    (d) 단층으로 성장하고 기판에 부착할 수 있는 능력,
    (E) 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포 계통으로 분화 될 수 있는 능력,
    (F) 비-종양(non tumorigenic) 생성능 또는
    (g) 구(spheres) 형성 능력.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 자궁 경부 조직은 포유류 자궁 경부 조직인 것인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 자궁 경부 조직은 비-종양성 조직인 것인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 자궁 경부 줄기 세포를 분리하는 방법에 의해 분리된, 비-월경 상태(non-menstrual phase)의 자궁 경부 줄기 세포로서,
    상기 분리된 비-월경 상태(non-menstrual phase)의 자궁 경부 줄기세포는,
    세포 마커 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, 비멘틴(vimentin), 사이토케라틴(cytokeratin)(CKAE1AE3), Klf4, Oct4 및 Sox-2를 발현하고;
    데스민(desmin), 액틴 HHF35, β-카테닌, p63, E-카드헤린(cadherin), CD117, CD133, HLA-DR, TRA1-81, CD45, CD34 및 CD31로 이루어진 군으로부터 선택된 최소 1 종의 세포 마커를 발현하지 않으며;
    상기 자궁 경부 줄기 세포를 분리하는 방법은, 다음 단계를 포함하는 자궁 경부 줄기 세포를 분리하는 방법인 것을 특징으로 하는, 비-월경 상태(non-menstrual phase)의 자궁 경부 줄기 세포:
    (a) 분리된, 비-월경 상태(non-menstrual phase)의 자궁 경부 조직으로부터 세포 현탁액을 제조하는 단계;
    (b) 상기 세포 현탁액으로부터 세포들을 회수하는 단계;
    (c) 세포들이 증식할 수 있는 적합한 세포 배양 배지 및 조건 하에서 상기 (b) 단계의 세포들을 인큐베이션하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계의 세포에 대해 세포 마커를 이용하여, 분리된 비-월경 상태의 자궁 경부 줄기세포를 선별하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 세포는 추가적으로 다음과 같이 나타나는 것인 분리된 줄기 세포:
    (a) 성장 배지에서 24 시간 당 0.4 내지 2.1 세포 분열 증식 속도,
    (b) 섬유 아세포와 같은 형태,
    (c) 최소 10 세포 계대 동안 안정적인 핵형,
    (d) 단층으로 성장하고 기판에 부착할 수 있는 능력,
    (E) 지방 세포, 골 세포, 신경 또는 근세포 세포 계통으로 분화 될 수 있는 능력,
    (F) 비 종양 생성능 또는
    (g) 구(spheres) 형성 능력.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 세포는 비-월경 상태(non-menstrual phase)인 인간 유래의 것인 분리된 비-월경 상태의 자궁 경부 줄기 세포.
  12. 제 9 항에 따른 분리된 비-월경 상태(non-menstrual phase)의 자궁 경부 줄기 세포를 포함하는 세포 집단(population).
  13. 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 조건 배지(conditioned medium):
    (a) 제 9 항에 따른 분리된 비-월경 상태(non-menstrual phase)의 자궁 경부 줄기 세포 또는 이를 포함하는 세포 집단을 인큐베이션하는 단계, 및
    (b) 배양 배지로부터 세포를 제거하는 단계.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 9 항에 따른 분리된 비-월경 상태(non-menstrual phase)의 자궁 경부 줄기 세포, 제 12 항에 따른 세포 집단, 또는 제 13 항에 따른 조건 배지를 포함하는,
    암, 전암 병변(precancerous lesions), 염증성 질환, 자가 면역 질환, 만성 병리 또는 감염성 질환, 조직 손실 관련 질환의 치료 또는 예방, 또는 임신 장애의 진단 또는 치료, 또는 미용 치료용 약학적 조성물.
  17. 제 9 항에 따른 분리된 비-월경 상태(non-menstrual phase)의 자궁 경부 줄기 세포, 제 12 항에 따른 세포 집단, 또는 제 13 항에 따른 조건 배지를 포함하는,
    종양 세포의 증식 또는 전이, 단핵구 분화, 말초 혈액 단핵 세포 증식 또는 병원성 미생물 성장 또는 복제의 억제 또는 감소, 또는 종양 세포의 세포자멸사(apoptosis)의 향상 또는 유도, 조직 재생의 향상 및 생식 세포의 선택용 약학적 조성물.
  18. 삭제
  19. 제 16 항의 약학적 조성물을 포함하는, 암, 전암 병변(precancerous lesions), 염증성 질환, 자가 면역 질환, 만성 병리 또는 감염성 질환, 조직 손실 관련 질환의 치료 또는 예방, 또는 임신 장애의 진단, 예측 또는 치료 또는 미용 치료용 키트.
  20. 제 17 항의 약학적 조성물을 포함하는, 종양 세포의 증식 또는 전이, 단핵구 분화 또는 말초 혈액 단핵 세포 증식 억제 또는 감소, 또는 종양 세포의 세포자멸사(apoptosis)의 향상 또는 유도, 조직 재생의 향상, 또는 생식 세포의 선별용 키트.
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