CN113679741A - 人羊膜上皮干细胞在制备治疗顺铂诱导的急性肾损伤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人羊膜上皮干细胞在制备治疗顺铂诱导的急性肾损伤的药物中的应用。该人羊膜上皮干细胞CD324表达阳性，而CD45、CD34表达阴性；无端粒酶活性；且是多潜能的或多能的。本发明首次将hAESCs应用于顺铂诱导的急性肾损伤的治疗中，充分发挥了hAESCs的优势。此外本发明通过构建顺铂‑AKI小鼠模型和A549肺癌裸鼠模型证明了hAESCs可以有效减轻肾损伤并增强顺铂的抗肿瘤作用，具有良好的效果，为当前该类疾病的治疗提供了一种安全可行的策略。

Description

人羊膜上皮干细胞在制备治疗顺铂诱导的急性肾损伤的药物 中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉人羊膜上皮干细胞在制备治疗顺铂诱导的急性肾损伤的药物中的应用。

背景技术

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是指由多种病因引起的肾功能快速下降而出现的临床综合征。AKI发病率高、并发症多、死亡率高，并且医疗消耗巨大。有研究报道全球每年罹患AKI的患者约有1300万人之多，AKI已经成为全球关注的医疗问题之一，但目前针对AKI仍无特异治疗方法，因此针对AKI的发病机制与临床诊疗研究已经成为近年来新的医学热点之一。AKI病因多样，根据病因发生的解剖部位不同可分为三大类：肾前性、肾性和肾后性。肾性AKI有肾实质损伤，包括肾小管、肾间质、肾血管和肾小球性疾病导致的损伤。肾小管性AKI的常见病因是肾缺血或肾毒性物质损伤肾小管上皮细胞，可引起急性肾小管坏死(acute tubular necrosis，ATN)。我们在2020年申请的发明专利(名称：人羊膜上皮干细胞在制备治疗急性肾损伤药物中的应用，申请号：202010289665.4)中本发明人在先研究了人羊膜上皮干细胞对缺血型急性肾损伤的保护作用，但临床中有相当一部分AKI患者的肾小管损伤是由肾毒性物质损害肾小管上皮细胞引起的，其中以化疗药物所致的急性肾损伤最为常见。肿瘤患者是AKI的高危人群，肿瘤患者一旦出现AKI，院内死亡的风险显著增加。国内一项大型队列研究显示，合并AKI的肿瘤患者住院死亡率为12.0％，远远高于未合并AKI的肿瘤患者(0.9％)。肿瘤患者发生AKI的原因包括药物肾毒性、合并感染、肿瘤肾脏浸润、溶瘤综合征，以及剧烈恶心呕吐导致血容量下降等。近年来，随着肿瘤发病率的增加、抗肿瘤治疗的进展以及肿瘤患者生存期的延长，由化疗药物的肾毒性以及其他药物和患者相关因素导致的化疗相关AKI变得越来越普遍。

顺铂是最有效的化疗药物之一，同时也是最常见的肾毒性化疗药物。顺铂，化学式为顺式-二氯二氨合铂(II)，在1978年经FDA批准首次用于肿瘤治疗，此后广泛用于各种实体肿瘤，包括头部和颈部肿瘤、食管癌、膀胱睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)以及小细胞肺癌等。顺铂目前仍然是多种恶性肿瘤的一线化疗药物，如NSCLC、头颈癌、膀胱癌、晚期胃癌、转移性三阴性乳腺癌等。据报道，肿瘤患者接受顺铂化疗后AKI的发生率约20％-40％，约13％的患者在接受顺铂化疗的第一个疗程后发生AKI。顺铂所致的AKI(顺铂-AKI)严重限制了顺铂的临床应用和疗效发挥。肾脏是顺铂的代谢器官，肾脏对顺铂的蓄积程度远高于其他器官，近端肾小管上皮细胞中顺铂的浓度约为血清浓度的5倍，这是因为近端肾小管细胞表面基底侧有主动摄取顺铂的转运蛋白，如铜转运蛋白(CTR1)、有机阳离子转运体(OCTs)，此外管腔侧的多药和毒素挤压蛋白1(MATE1)介导顺铂的排出。肾小管上皮细胞凋亡坏死是顺铂-AKI的主要机制，大致可以分为(1)TNF通路的活化、(2)氧化应激、(3)线粒体损伤、以及(4)DNA损伤等。

针对顺铂-AKI，临床上以预防为主，尚缺乏有效治疗方法。关于顺铂-AKI的预防，除了调整顺铂剂量和密切监测肾功能外，主要的预防措施包括以下几种：静脉水化、应用改善血流动力学药物如氨磷汀、抗氧化剂如谷胱甘肽、利尿剂如甘露醇、OCT2抑制剂如西咪替丁或镁剂补充。根据欧洲指南，目前唯一提倡的顺铂-AKI的预防方法是使用等渗盐水进行静脉水化，必要时补充镁剂。顺铂-AKI的预防治疗已有近40年的临床经验，然而大多数常用的措施并没有显示出令人信服的效果。结合顺铂-AKI的高发生率以及对患者结局的重要影响，探索更多安全有效的顺铂-AKI治疗措施是非常必要的。

过去三十年里，干细胞研究取得了显著的成果，有望彻底改变很多疾病或损伤的治疗。干细胞是体内尚未分化或未分化完全，并具有自我更新的能力的一类细胞，存在于胚胎细胞和成体细胞中。按照分化潜能，干细胞可以分为：1.全能干细胞，如受精卵，能够分裂和分化成整个有机体；2.多能干细胞，如胚胎干细胞、诱导PSCs(induced multipotentialstem cells，iPSC)、以及间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，可分化为所有胚层的细胞，除了胚胎外结构，如胎盘；3.专能干细胞，可以特化于特定细胞谱系的离散细胞，如造血干细胞；4.寡能干细胞，如髓系干细胞就是一个例子，它可以分裂成白细胞，但不能分裂成红细胞；5.单能干细胞，只能形成一种细胞类型，如皮肤细胞。干细胞治疗顺铂-AKI的领域内，以MSCs研究最为深入，同种异体或异种移植不同来源的MSCs(如骨髓、脂肪、脐带血等)均被报道对顺铂-AKI具有良好的治疗作用。尽管有上述研究的支持，但MSCs用于顺铂-AKI仍存在致瘤性以及促进肿瘤增殖的风险，据报道，动物实验中MSCs输注引起小鼠的免疫反应并导致肺部肿瘤形成，而且在部分MSCs用于荷瘤小鼠的研究中，MSCs显示了促肿瘤增殖的作用(

CERAR A，

M.(Mesenchymal)Stem Cell-BasedTherapy in Cisplatin-Induced Acute KidneyInjury Animal Model：Risk ofImmunogenicity and Tumorigenicity.Stem Cells International，2017，2017：7304643.)。除MSCs外，很多不同类型的成体干细胞相继在顺铂-AKI中被证明具有保护作用。有研究发现羊水干细胞可通过抑制肾脏细胞凋亡并激活自噬改善顺铂-AKI(MINOCHAE，SINHA RA，JAIN M，et a1.Amniotic fluid stem cells ameliorate cisplatin-inducedacute renal failure through induction of autophagy and inhibitionofapoptosis.Stem Cell Res Ther.2019Dec 4；10(1)：370.)。此外，人脐带血单核细胞也可以改善顺铂-AKI导致的细胞凋亡和炎症反应(LI XW，FENG LX，ZHU XJ，et al.Humanumbilical cord blood mononuclear cells protect against renaltubulointerstitial fibrosis in cisplatin-treated rats.BiomedPharmacother.2020Jan；121：109310.)。Santeramo等报道，将人肾来源干细胞用于免疫缺陷大鼠顺铂-AKI模型可改善肾功能并促进肾脏细胞增殖(SANTERAMO I，HERRERA PEREZ Z，ILLERA A，et al.Human Kidney-Derived Cells Ameliorate Acute Kidney InjuryWithout Engrafting into Renal Tissue.Stem Cells Transl Med.2017May；6(5)：1373-1384.)。

虽然干细胞在顺铂-AKI的应用中极具潜力，然而迄今为止，上述所有干细胞对肿瘤增殖以及顺铂化疗效果的影响并未得到评估。关于干细胞用于顺铂-AKI的临床探索，仅有一项MSCs用于治疗实体瘤顺铂化疗AKI的临床试验注册(NCT01275612)，但由于未达到有效招募病人数目前已被撤销。因此综合评价干细胞在荷瘤动物模型的安全性及有效性显得非常必要。

结合既往研究，干细胞在顺铂-AKI领域进行临床转化大有希望。然而，在临床应用之前，需要寻找理想的干细胞类型并充分评估其安全性和有效性，在荷瘤动物模型中验证其对肿瘤增殖的影响以及对顺铂化疗的干扰。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了人羊膜上皮干细胞(human amnioticepithelial stem cells，hAESCs)，又称人羊膜上皮细胞(human amnioticepithelialcells，hAECs)在制备治疗顺铂诱导的急性肾损伤(顺铂-AKI)的药物中的应用。hAESCs是从胎盘上最靠近胎儿一侧的羊膜上分离而来的细胞。胎盘属于孕妇生产后的废弃物，故此来源的细胞不存在伦理问题。hAESCs起源于多能外胚层并在整个孕期均保留多向分化的潜能，是具有类似于胚胎干细胞分化特性和成人干细胞免疫调节特性的一种围产期干细胞，可以表达多种细胞因子、免疫调控因子和神经营养因子。此外，hAECs表面缺乏主要组织相容性复合体(MHC)I类分子(HLA-A、-B、-C和β2微球蛋白)和一种MHC-II类分子(HLA-DR)表达，因此其免疫原性极低。既往研究将免疫类型不匹配的人羊膜移植到志愿者皮肤下时不会引发宿主免疫应答，且hAECs不表达端粒酶，将hAECs移植到免疫缺陷小鼠或正常小鼠，结果均证实hAECs没有致瘤性。综上所述，hAESCs是再生医学和细胞治疗临床应用中目前比较适合的种子细胞，应用于顺铂-AKI的治疗具备较好的发展前景。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供人羊膜上皮干细胞在制备治疗顺铂诱导的急性肾损伤的药物中的应用。

进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或稀释剂；该载体为人工支架，该稀释剂为生理盐水、磷酸缓冲液、人工脑脊液、全血清或脐带血清。

进一步地，上述人工支架可为明胶海绵、聚乙醇酸、聚乳酸及它们的共聚物中之一或任何组合。

进一步地，上述药物的给药方式为静脉注射、肾脏局部给药和/或以人羊膜上皮干细胞种植在生物可吸收材料的形式植入所需的部位。

进一步地，上述药物的给药剂量使得每次的人羊膜上皮干细胞数量为10³-10⁹；优选为10⁶-10⁷。

进一步地，上述人羊膜上皮干细胞的状态可以选自以下状态中的一种：未经任何处理的收集的细胞(粗提部分)，部分纯化的细胞和纯化的细胞然后经培养扩增而得的细胞。

进一步地，上述人羊膜上皮干细胞为经过传代培养得到的P1-P3代细胞；优选P1代细胞。

进一步地，上述人羊膜上皮干细胞无端粒酶活性，CD324表达阳性，CD45、CD34表达阴性。

进一步地，上述人羊膜上皮干细胞的获取方法包括如下步骤：

(1)从胎盘组织通过机械分离得到羊膜；

(2)清洗后的羊膜用消化酶进行消化，将消化后的液体进行离心，即可获得人羊膜上皮干细胞；

(3)将步骤(2)中人羊膜上皮干细胞扩增培养至P1～P3代。

本发明的第二方面是提供一种预防或治疗肿瘤合并急性肾损伤的药物组合物，其包括铂类化疗药和人羊膜上皮干细胞制剂。

进一步地，上述铂类化疗药为顺铂。

进一步地，上述人羊膜上皮干细胞制剂包括活性成分hAESCs和药学可接受的载体。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明首次将hAESCs应用于顺铂-AKI的治疗中，充分发挥了hAESCs的如下优点：

(1)能长期保持多潜能性并具有胚胎干细胞所特有的向三个胚层组织分化的潜能；

(2)细胞表面低表达MHC-I型分子(HLA-A、-B、-C和β2微球蛋白)，几乎不表达MHC-II型分子(HLA-DR)，因此不会引起炎症、过敏和免疫反应，移植配型要求也相应降低；

(3)具有调节体内和体外免疫反应的能力，在体外培养时能分泌多种免疫调节因子、抗血管生成蛋白或抗炎因子相关蛋白；

(4)具有低免疫原性，可以看作是免疫赦免细胞，无抗原呈递的功能，移植后可减少免疫细胞来源，避免免疫排斥反应的发生；

(5)不表达端粒酶逆转录酶，没有致瘤性(包括良性瘤、肉瘤和癌)；

(6)具有较强的增殖能力，并能在前代次(约10代内)保持旺盛的增殖能力；

(7)来源广泛，取材容易，没有应用限制，不存在伦理问题。

本发明通过构建顺铂-AKI小鼠模型和A549肺癌裸鼠模型证明了hAESCs可以有效减轻肾损伤并增强顺铂的抗肿瘤作用，具有良好的效果，为当前该类疾病的治疗提供了一种方案。

附图说明

图1显示了本发明一实施例中hAESCs对重度顺铂-AKI小鼠生存率的影响；

图2显示了本发明一实施例中hAESCs对中度顺铂-AKI肾功能的影响；其中，图A为血清肌酐(sCr)值曲线；图B显示了肾脏病理急性损伤的半定量评分结果，↑表示肾小管坏死病变，★表示肾小管刷状缘脱落，▲表示肾小管管型形成；图C显示了肾脏损伤分子KIM-1表达水平；

图3显示了本发明一实施例中hAESCs对顺铂-AKI小鼠肾组织细胞凋亡情况的影响；

图4显示了本发明一实施例中hAESCs对顺铂-AKI小鼠肾小管上皮细胞增殖修复情况的影响；

图5显示了本发明一实施例中hAESCs对顺铂-AKI小鼠肾组织炎症因子转录情况的影响；

图6显示了本发明一实施例中hAESCs单独或与顺铂联合应用对A549肺癌裸鼠的肿瘤体积的影响；

图7显示了本发明一实施例中hAESCs单独或与顺铂联合应用对A549肺癌裸鼠的肿瘤重量的影响；其中，图A为各个处理组的肿瘤的实物图；图B为各个处理组的肿瘤的重量统计图；

以上图中所采用的标尺为100μm，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

具体实施方式

基于顺铂-AKI目前缺乏有效的治疗手段，严重限制了顺铂的临床使用，对肿瘤患者的生存率和生存时间具有重要影响，本发明提供了hAESCs在制备治疗顺铂-AKI的药物中的应用，该hAESCs CD324表达阳性，而CD45、CD34表达阴性；无端粒酶活性；且是多潜能的或多能的。

本发明采用的hAESCs来源于人类。可从离体的人胎盘分离羊膜，采用生理缓冲液冲洗除去血细胞，机械剔除残留绒毛膜和血管。分离指的是从组织样品中移出细胞且与另外的组织分开。使用任何常规技术或方法从完整人羊膜上皮层组织分离出单细胞，这些技术或方法包括机械力(切碎力或剪切力)，用一种或组合的蛋白酶例如胶原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、释放酶(liberase)和胃蛋白酶进行酶消化或机械和酶方法的组合。

在发明的一个优选实施方案中，提供了一种从羊膜组织中分离hAESCs的方法，该方法包括以下步骤：

(1)从胎盘组织通过机械分离得到羊膜；

(2)清洗后的羊膜用消化酶进行消化，将消化后的液体进行离心，即可获得人羊膜上皮干细胞。

在本发明一个优选的实施方案中，人羊膜的获取应经产妇授权同意后，取健康产妇剖腹产后的胎盘组织，十字刀切割胎盘，通过机械分离得到整张羊膜。

在本发明另一个优选的实施方案中，可对步骤(2)中获得hAESCs继续培养，优选的培养条件为：以6～9×10⁴/cm²的密度将细胞接种于培养皿中，放置于二氧化碳培养箱中培养，待hAESCs贴壁后换培养液，待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存。

本领域技术人员可用已知的其它方法将活性细胞群体浓缩。这些加工后洗涤/浓缩步骤可单独或同时施行。除了上述方法以外，还可在细胞洗涤后或培养后，进一步纯化或富集活性细胞群体，减少杂细胞和死细胞。分离悬浮液中的细胞可通过以下技术来实现：浮力密度沉降离心、有差别的与固相的粘着和从固相上洗脱、免疫磁性珠、荧光激光细胞分选(FACS)或其它技术。这些不同技术以及进行这些技术的装置的实例可参见现有技术和上市商品。

对本发明使用的基础培养基的类型没有限制，只要可用于细胞培养的培养基即可。优选的培养基包括DMEM培养基和NPBM培养基。对上面提到的基础培养基中可能含有的其他组份类型没有限制，优选的成分包括F-12、FCS和神经存活因子等。

在本发明的另一个优选实施方案中，向上面提到的基础培养基中添加bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)或EGF(表皮生长因子)。在这种情况下，可以加入一种或者两者都加入。上面提到的bFGF或EGF的举例浓度是1ng/ml至100ng/ml，优选的浓度为10ng/ml。对添加的时间和方法没有限制。优选地，在将上面提到的hAESCs在基础培养基中培养时每天加入试剂。

在本发明一优选的实施方式中，上述药物还包括药学上可接受的载体或稀释剂。本发明所述的药学可接受的载体是指适合用于人和/或动物，无过度的不良副作用(如毒性、刺激性和过敏反应)的具有合适的有益/风险率的物质，例如药学可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂，有利于细胞存活，能递送所配制的细胞到人或动物。载体依合适地计划的给药方式而选择。本发明的载体包括但不限于各种生理缓冲液，如生理盐水、磷酸缓冲液、人工脑脊液；或是全血清、脐带血清；还可包括各种人工支架，其材料包括但不限于明胶海绵、聚乙醇酸、聚乳酸及它们的共聚物。

在本发明一优选的实施方式中，上述hAESCs混悬于生理盐水中，制备得到hAESCs注射液。

在本发明一优选的实施方式中，可以采用任意适合的方法将hAESCs给予患者，例如静脉注射或者肾脏局部等。通常这些细胞是包含在药学上可接受的液体培养基中。细胞给予可以重复或连续进行(例如，通过连续灌输注入脑脊液中)。一般而言，多重给药方式通常要间隔至少7-10天分别使用。另外一种方法为将细胞种植在生物可吸收材料如明胶海绵里，采用手术将种有细胞的生物可吸收材料植入所需的部位。上述两种方法可结合应用，可取得更好的疗效。

hAESCs的适合用量将根据患者的年龄、性别、体重、健康状况以及其它因素而改变。在本发明一优选的实施方式中，每次给予的剂量范围为大约10³-10⁹细胞，更优选的是大约10⁶-10⁷细胞。

在本发明一优选的实施方式中，考虑到要治疗的疾病的类型，本领域的技术人员可以适当选择hAESCs的合适状态：未经任何处理的收集的细胞(粗提部分)；部分纯化的细胞；纯化的细胞然后经培养扩增的细胞。hAESCs本身不表达端粒酶，细胞周期研究显示，大多数细胞处于G0/G1，只有少数细胞处于活跃的复制期，其增殖能力和扩增代数有限。而且研究发现，当P4-5代细胞的上皮形态变为间充质样细胞，上皮细胞标记CK7、CD49f、EpCAM和E-钙粘蛋白的下调，间质细胞标记CD44、CD105、CD146和波形蛋白上调。6代以后的少数细胞形态发生变化，细胞呈梭形，细胞增殖减慢，传至第8代细胞胞浆内出现空泡和黑色颗粒，逐渐停滞生长，出现凋亡(Pratama G，Vaghjiani V，Tee JY，Liu YH，Chan J，et al.(2011)Changes in Culture Expanded Human Amniotic Epithelial Cells：Implications forPotential Therapeutic Applications.PLoS ONE 6(11)：e26136.)。因此，本发明可以使用P1-3代，再综合考虑培养时间和经济成本，优选P1代细胞。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例提供原代人羊膜上皮干细胞的分离及培养方法，具体的材料和过程如下：

1.人羊膜的来源

为了避免产道微生物污染，选用了剖宫产胎儿胎盘。由于足月后分娩信号刺激，羊膜会发生凋亡，因此宜用早产胎儿胎盘(38周以前)。经产妇签署知情同意书后，取健康产妇(HIV、梅毒、甲肝、乙肝、丙肝等血清学反应均显示为阴性)剖宫产后的胎盘组织，十字刀切割胎盘，通过机械分离得到整张羊膜。

2.hAESCs的分离(全程要求无菌操作)

(1)获取39周以前剖宫产婴儿胎盘，从胎盘内面剥离羊膜，将之浸入含有F12/DMEM(含1×青霉素-链霉素和两性霉素)基础培养基的离心管中。4℃冷链运送至实验室细胞间。

(2)将羊膜取出，并将每张羊膜置于40ml CMF-HBSS中清洗去粘液，并用镊子刮去贴近绒毛膜层的间充质层及粘液，重复3次，每次洗涤均换新容器和新HBSS液。

(3)将洗净的羊膜转入新容器，加10ml 0.05％胰酶/EDTA，颠倒30s，弃液。

(4)将羊膜转入新容器，加20ml 0.05％胰酶/EDTA，37℃水浴孵育10min弃液。

(5)将羊膜转入新容器，25ml胰酶/EDTA37℃水浴孵育40min，保存消化液。

(6)初次消化后羊膜转入新容器，25ml胰酶/EDTA 37℃水浴孵育40min，保存消化液。

(7)加入等体积消化终止液(F12/DMEM含5％FBS，1×L-谷氨酸，1×丙酮酸)，400g离心10min。弃液，用羊膜完全培养基(F12/DMEM含5％KSR(KnockOut Serum Replacement)，1×L-谷氨酰胺，1×丙酮酸)重悬沉淀。

(8)加入等体积消化终止液，400g离心10min。弃液，完全培养基重悬沉淀。

(9)过100μm筛，计数，以1×10⁵cells/cm²接种至培养皿或置于冻存液(90％FBS，10％DMSO)中液氮冻存备用。

3hAESCs的接种培养及冻存

(1)细胞培养：接种1×10⁷个细胞后，待hAESCs贴壁后换培养液，之后三天换一次培养液。

(2)待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存：15cm培养皿加5ml胰酶，10min后镜下观察，细胞变圆且平面晃动平皿时细胞全变为悬浮状态时加等量消化终止液终止消化。用微量移液器按同一方向将培养皿上的细胞吹下，移入15ml离心管，300g离心3min后收集细胞然后进行细胞计数。在冻存管内加入冻存液，标明冻存日期、批次及细胞数量之后将细胞放入冻存管，然后立刻将冻存管放入冻存盒中并将冻存盒放进-80℃冰箱，12h后取出冻存盒，将细胞移入液氮罐中保存。经检测，细胞纯度高，上皮细胞标记物CD324阳性率＞95％；无血细胞污染，血细胞标志物CD34、CD45均＜2％。

实施例2

本实施例构建顺铂-AKI小鼠模型并进行分组处理，具体的过程如下：

1.顺铂溶液配制：用生理盐水溶解顺铂粉剂，配置浓度为1mg/ml的顺铂溶液，并于-20℃保存，实验开始前将顺铂溶液于室温下避光融化至澄清透明。

2.小鼠准备及分组：8周龄C57BL/6j雄性小鼠经购买后在屏障环境内适应性饲养一周后根据体重随机分组：正常对照组、顺铂处理组(20mg/kg或15mg/kg顺铂腹腔注射)和hAESCs治疗组(顺铂处理后次日予以hAESCs治疗)。每组9-10只小鼠。

3.顺铂注射：经腹腔予以顺铂溶液注射制备顺铂-AKI模型。顺铂注射剂量20mg/kg为重度AKI模型，15mg/kg为中度AKI模型。

4.干细胞注射：顺铂处理后的第1天，将小鼠固定，用温水浸泡小鼠尾部稍加热；采用一次性无菌的1ml注射器抽取浓度为1×10⁷个/ml的hAESCs悬液100μl(即1×10⁶个干细胞)，针面向上与小鼠尾静脉基本平行刺入静脉，回抽见血后将hAESCs缓慢推入，顺铂损伤组予以等量的hAESCs细胞保存液尾静脉注射。

5.标本采集：每日监测小鼠体重并记录一般情况，腹腔注射0.7-1ml温生理盐水补充体液。顺铂注射后第1、2、3、4及6天，按实验计划留取血标本和肾组织样本。

实施例3

本实施例验证了hAESCs提高顺铂-AKI小鼠生存率，具体的结果如下：

如图1所示，未接受治疗的小鼠6天死亡率为100％，采用重度顺铂-AKI小鼠模型(20mg/kg顺铂腹腔注射)在顺铂注射后第1天给与hAESCs可以使顺铂-AKI小鼠的死亡率降低到约50％(P＜0.05)。

实施例4

本实施例验证了hAESCs改善顺铂-AKI小鼠的肾脏功能，具体的结果如下：

如图2A，与正常对照组相比，在顺铂注射后第4天，中度顺铂损伤组(15mg/kg顺铂腹腔注射)小鼠的血肌酐水平(代表肾脏功能损伤程度)显著升高，此时hAESCs治疗组小鼠血肌酐水平则较顺铂损伤组程度显著降低(P＜0.05)。通过PAS染色可见(图2B)，顺铂-AKI小鼠的肾组织切片上肾小管弥漫性空泡样改变、肾小管坏死和管型形成明显，并伴有肾小管刷状缘脱落，经过hAESCs治疗后，上述病变明显较轻(P＜0.05)。通过蛋白印迹检测肾损伤标志物KIM-1的表达水平，如图2C，顺铂损伤后小鼠肾组织KIM-1表达显著升高，而hAESCs治疗后KIM-1的表达水平亦显著降低(P＜0.05)。

实施例5

本实施例通过TUNEL荧光染色法对小鼠肾组织切片进行细胞凋亡检测进而验证了hAESCs降低顺铂-AKI小鼠的肾脏细胞凋亡水平，具体的结果如下：

顺铂-AKI导致肾小管上皮细胞发生坏死与凋亡。如图3，顺铂损伤组小鼠肾组织中可见大量的TUNEL阳性(绿色荧光)细胞，hAESCs治疗组小鼠肾脏组织中细胞凋亡数量明显少于顺铂损伤组(P＜0.05)，提示hAESCs可以减轻顺铂导致的肾脏细胞凋亡。

实施例6

本实施例验证了hAESCs促进顺铂-AKI小鼠肾小管上皮细胞增殖修复，具体的结果如下：

顺铂-AKI发生时，健存的肾小管上皮细胞发生增殖，修复损伤的肾组织。为明确hAESCs对顺铂-AKI小鼠肾小管上皮细胞增殖修复情况的影响，在实施例2的基础上，在小鼠肾组织切片上对上皮细胞紧密连接的标志物Ecadherin(绿色荧光)以及细胞增殖标志物Ki67(红色荧光)进行免疫荧光共染。如图4所示，与正常对照组小鼠相比，顺铂损伤组小鼠肾小管上皮细胞Ecadherin表达显著下降；与顺铂损伤组相比，hAESCs治疗组小鼠的肾小管上皮细胞Ecadherin及Ki67的表达则显著增加，且Ki67阳性位置大多位于肾小管上皮细胞内，提示hAESCs促进了顺铂损伤后肾小管上皮细胞的修复与增殖。

实施例7

本实施例验证了hAESCs调控顺铂-AKI小鼠肾脏炎症因子的转录水平，具体的结果如下：

在实施例2的基础上，通过RT-PCR方法对肾组织中炎症因子Cxcl1、Cxcl2、Ccl2、Il-1β以及Il-6的转录水平进行了检测。如图5所示，顺铂损伤组小鼠的肾组织中上述炎症因子的转录表达水平较正常对照组小鼠显著升高，而hAESCs治疗组小鼠则较顺铂损伤组明显降低(p＜0.05)，提示hAESCs可以减轻顺铂导致的肾脏炎症反应。

实施例8

在明确hAESCs对顺铂-AKI小鼠的影响后，本实施例进一步制备了A549(一种人源非小细胞肺癌的细胞系)肺癌裸鼠模型，了解hAESCs对顺铂抗肿瘤作用的影响，模型的构建及处理分组如下：

1.裸鼠肿瘤接种：4周龄BALB/c雄性裸鼠经购买后在屏障环境内适应性饲养一周后予以A549肿瘤细胞接种，操作在小鼠屏障饲养环境的超净台内进行，每只裸鼠的细胞注射量为1×10⁶/100μl。将待接种的细胞用1ml注射器注射于裸鼠右侧腋下皮下；注射结束后针头缓慢拔出，棉签压迫约1min，避免细胞从针孔处流出。

2.裸鼠分组：待裸鼠皮下肿瘤长至肉眼可见后，每隔3天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，按照公式：体积(mm³)＝0.5×长径(mm)×短径(mm)²，计算肿瘤体积。待裸鼠皮下肿瘤长到约100mm³时，按肿瘤体积大小随机分组，每组6-10只，分组情况为：肿瘤对照组、hAESCs干预组、顺铂干预组、顺铂联合hAESCs干预组。

3.顺铂及hAESCs干预：分组当天给小鼠腹腔注射顺铂10mg/kg，该剂量为荷瘤小鼠模型中常用的顺铂化疗剂量；在顺铂注射后第1天，给小鼠尾静脉注射hAESCs(1×10⁶/100μl)。操作过程如前述(实施例2)。

4.标本采集：监测测裸鼠肿瘤体积变化，并于顺铂注射的第12天处死裸鼠，留取肿瘤标本用于后续实验。

实施例9

本实施例在实施例8的基础上，验证hAESCs增强顺铂对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用，具体的结果如下：

通过肺癌A549裸鼠的肿瘤体积曲线(图6)可以看出，在顺铂注射后的12天内，对照组荷瘤裸鼠的肿瘤体积呈逐渐增加的趋势，而hAESCs干预组裸鼠的肿瘤体积增殖幅度较对照组荷瘤裸鼠稍低，统计学无明显差异，提示hAESCs对A549肺癌的增殖无影响；顺铂干预组裸鼠的肿瘤在顺铂注射后第4天体积明显缩小，随后的第8天和第12天则开始逐渐增大，提示顺铂单独应用的肿瘤抑制效果在早期最显著，随后逐渐减弱；而顺铂联合hAESCs干预组裸鼠的肿瘤体积在顺铂注射第4天时与顺铂干预组无明显差别，此后至第8天和第12天时肿瘤体积则逐渐小于顺铂干预组，且在第12天达到统计学差异(P＜0.05)，该结果反映在顺铂注射第4天时，hAESCs与顺铂联合应用的肿瘤抑制效果与单纯顺铂使用无差别，在第12天则显著优于单纯顺铂使用，提示hAESCs可增强顺铂的肿瘤抑制效果，且该作用在顺铂应用的后期更明显。

在顺铂注射第12天时，取A549肺癌裸鼠的皮下肿瘤拍照并称重，如图7所示，hAESCs干预组裸鼠的肿瘤大小和重量与对照组荷瘤裸鼠无差异，顺铂干预组裸鼠的肿瘤重量低于对照组荷瘤裸鼠，但未达统计学差异；与顺铂干预组裸鼠相比，顺铂联合hAESCs干预组裸鼠的肿瘤重量显著较低(P＜0.05)。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.人羊膜上皮干细胞在制备治疗顺铂诱导的急性肾损伤的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或稀释剂；所述载体为人工支架，所述稀释剂为生理盐水、磷酸缓冲液、人工脑脊液、全血清或脐带血清。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述人工支架可为明胶海绵、聚乙醇酸、聚乳酸及它们的共聚物中之一或任何组合。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为静脉注射、肾脏局部给药和/或以人羊膜上皮干细胞种植在生物可吸收材料的形式植入所需的部位。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的给药剂量使得每次的人羊膜上皮干细胞数量为10³-10⁹；优选为10⁶-10⁷。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人羊膜上皮干细胞为经过传代培养得到的P1-P3代细胞；优选P1代细胞。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人羊膜上皮干细胞的获取方法包括如下步骤：

(1)从胎盘组织通过机械分离得到羊膜；

(2)清洗后的羊膜用消化酶进行消化，将消化后的液体进行离心，即可获得人羊膜上皮干细胞；

(3)将步骤(2)中人羊膜上皮干细胞扩增培养至P1～P3代。

8.一种预防或治疗肿瘤合并急性肾损伤的药物组合物，其特征在于，包括铂类化疗药和人羊膜上皮干细胞制剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述铂类化疗药为顺铂。

10.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述人羊膜上皮干细胞制剂包括活性成分hAESCs和药学可接受的载体。

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