CN113559124B - 间充质干细胞凋亡小体在制备治疗骨缺损的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了间充质干细胞凋亡小体在制备治疗骨缺损的药物中的应用，属于生物医药技术领域，解决了现有技术中不能从根本上解决受损骨细胞修复和骨组织再生的问题。本发明提供的间充质干细胞凋亡小体在制备治疗骨缺损的药物中的应用。本发明还提供了一种药物制剂，其包括间充质干细胞凋亡小体及药学上可接受的载体。本发明首次发现了间充质干细胞凋亡小体具有促进新骨形成、促进骨再生的作用，将其用于治疗骨缺损具有良好的效果。

Description

间充质干细胞凋亡小体在制备治疗骨缺损的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及间充质干细胞凋亡小体在制备治疗骨缺损的药物中的应用。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新，并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。干细胞是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的始祖细胞。间充质干细胞是干细胞的一个研究分支。间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等多方面，但是间充质干细胞所面临的取材难、免疫排斥反应、伦理问题极大的限制了其在临床上的应用。

细胞凋亡是指由一组基因控制以维持内环境稳定的自发有序的细胞死亡。据估计，人体内每天有超过500亿细胞发生凋亡以维持体内平衡。细胞凋亡是胚胎发育、细胞分化、组织再生等生理过程中的常见现象，也是肿瘤、免疫缺陷、器官萎缩等病理过程中的常见现象。作为正常胚胎发育和组织内环境稳定的一部分，细胞凋亡在平衡细胞死亡和再生中起着关键作用。在细胞凋亡过程中，凋亡细胞分泌大量的胞外囊泡，称为凋亡小体(apoptotic bodies，ABs)。与外泌体和微粒相比，ABs是相对大的囊泡。ABs大小范围为1000-5000nm。ABs中包含核酸，蛋白质和脂质。在ABs形成期间，磷脂酰丝氨酸(PS)外翻，有利于磷脂结合蛋白(Annexin V)识别与结合；此外，一些自身抗原也易位到ABs中，包括组蛋白家族，补体C1qC链(C1QC)和补体成分3B(C3B)，因此成为ABs的特异性标志物。与其他类型的胞外囊泡相比，ABs在再生医学方面的作用及其作用机制知之甚少。新的证据表明，细胞外小泡可以携带有益的物质作为一种新的必不可少的细胞通讯介质。ABs可以被靶细胞(间充质干细胞，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、上皮细胞和内皮细胞)吞噬，并通过转运生物活性分子(如蛋白质、脂质和核酸)促进皮肤、骨骼、肌肉等的再生。越来越多的证据支持ABs在免疫调节和癌症发展环境中的重要性。因此，ABs不仅仅是细胞凋亡的副产物，应被视为凋亡细胞与周围细胞通讯的关键机制。作为相邻细胞之间传递功能物质的天然载体，ABs在细胞间相互作用微环境中受到越来越广泛的重视，同时发现它们能够将有用的物质输送到健康的受体细胞，从而调节受体细胞的功能。所以，近年来关于细胞凋亡的研究已经逐渐拓展到其凋亡释放的ABs功能的研究。此外ABs的易获性、可塑性、稳定性、高产量、不具有免疫排斥反应、无伦理问题，有望成为再生医学中一种较为理想的治疗手段。

骨缺损是骨科疾病中的一种，是指骨的结构完整性被破坏，是临床常见病。在生活中很多人都在忍受骨缺损带来的病痛，目前现有治疗方法不能从根本上解决受损骨细胞修复和骨组织再生的问题。寻找更有效的治疗手段，开辟新的治疗途径成为必然。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供间充质干细胞凋亡小体在制备治疗骨缺损的药物中的应用，解决现有技术中不能从根本上解决受损骨细胞修复和骨组织再生的问题。

本发明的目的之二在于，提供一种包含间充质干细胞凋亡小体的药物制剂。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的间充质干细胞凋亡小体在制备治疗骨缺损的药物中的应用。

本发明发现，间充质干细胞凋亡小体中含有遗传物质，具有良好的促进骨组织再生和促进骨缺损修复方面的作用。

本发明的部分实施方案中，所述间充质干细胞凋亡小体包括骨髓、脐带、脂肪、脐带血、羊膜、胎盘、牙髓、外周血骨髓、牙、脂肪等来源间充质干细胞凋亡小体。

本发明的部分实施方案中，所述治疗骨缺损的药物包括促进骨形成、或/和促进骨再生的药物。

本发明的部分实施方案中，所述骨缺损包括因创伤、手术或疾病所致的骨缺损。

本发明的部分实施方案中，所述疾病所致的骨缺损包括因糖尿病、类风湿性关节炎、自身免疫性脑脊髓炎、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、牙周炎、炎性肠病、粘膜炎、结肠炎或败血症引起的骨相关疾病。

本发明的部分实施方案中，所述间充质干细胞凋亡小体的制备方法包括以下步骤：取间充质干细胞传代培养后，再诱导间充质干细胞凋亡，收集上清液，离心，收集离心沉淀，得到所述间充质干细胞凋亡小体。

本发明提供的间充质干细胞凋亡小体是通过在体外对间充质干细胞增殖培养，诱导、分离、纯化后得到的，通过本发明的制备方法能有效提供质量稳定、较大规模的间充质干细胞凋亡小体，为间充质干细胞凋亡小体药物制剂的开发提供了条件。

本发明的部分实施方案中，所述间充质干细胞凋亡小体直径为1～5μm。

本发明的部分实施方案中，取间充质干细胞传代培养，收集第2～10代中的任意一代间充质干细胞，再加入诱导剂诱导间充质干细胞凋亡；优选地，收集第3～5代中的任意一代间充质干细胞。

本发明发现，第2～10的间充质干细胞均具有良好的生物活性，其中以第3～5代为较优。

本发明的部分实施方案中，用于间充质干细胞传代培养的培养液组分为：α-MEM基础培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素。

优选地，所述培养液包括500份体积份数的α-MEM基础培养基、55.5份体积份数的胎牛血清、浓度为100U/mL的青霉素和浓度为100U/mL的链霉素。

优选地，所述间充质干细胞的培养环境为：37℃、5％CO₂；培养密度为：按1.5×10⁶个/皿的密度接种培养；培养后的细胞融合度为80％-85％。

本发明的部分实施方案中，充质干细胞传代培养后，加入星形孢菌素溶液进行诱导培养，以诱导细胞凋亡。

本发明的部分实施方案中，所述星形孢菌素溶液的溶剂选自乙醇或二甲基亚砜中的至少一种，更优选地，所述溶剂选自二甲基亚砜。所述星形孢菌素在培养液中的浓度为1μm-10μm，更优选地，所述星形孢菌素在培养液中的浓度为5μm。

本发明的部分实施方案中，加入星形孢菌素溶液进行诱导培养的时间2–24h，优选为2h、4h、6h、12h或24h。

本发明的部分实施方案中，所述离心为差速离心，优选地，差速离心包括以下步骤：将上清液低速离心去除细胞碎片后；再高速离心，收集沉淀，PBS重悬；将重悬液高速离心，获得作为沉淀的凋亡小体。

本发明的部分实施方案中，所述差速离心在低温条件下进行，优选地，于4℃条件下差速离心。

本发明的部分实施方案中，所述差速离心的步骤为：将诱导培养后的上清液于4℃、800×g条件下离心10min，转移上清液、除去细胞碎片；再将离心所得上清液于4℃、16000×g条件下离心30min，废弃上清液、收集沉淀，PBS重悬；将重悬液在4℃、16000×g条件下离心30min，获得作为沉淀的凋亡小体。

本发明提供的药物制剂，包括上述的间充质干细胞凋亡小体、及药学上可接受的载体。

所述“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现了间充质干细胞凋亡小体具有促进新骨形成、促进骨再生的作用，将其用于治疗骨缺损具有良好的效果。

本发明的间充质干细胞凋亡小体制备方法操作简单、方便，能有效提供质量稳定、较大规模的间充质干细胞凋亡小体，为凋亡小体药物制剂的开发提供了条件。

附图说明

图1A为本发明实施例2扫描电镜下观察的间充质干细胞来源的凋亡小体的形态图；

图1B为本发明实施例2流式细胞仪检测间充质干细胞来源的凋亡小体标志物的鉴定图；

图2为本发明实施例3对照组与实验组的micro CT 3D重建图；其中左侧为对照组，右侧为实验组。

图3A为本发明实施例4对照组钙黄绿素标记图；

图3B为本发明实施例4实验组钙黄绿素标记图；

图4A为本发明实施例4对照组钙HE染色图；

图4B为本发明实施例4实验组钙HE染色图；

图5A为本发明实施例4对照组钙OPN形成图；

图5B为本发明实施例4实验组钙OPN形成图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的保护范围进行举例说明，但不能认为是对本发明保护范围的限制。

实施例1：体外诱导骨髓间充质干细胞凋亡

取培养至第3代的骨髓间充质干细胞按1.5×10⁶个/皿的密度接种至10cm培养皿，置于37℃、5％CO₂条件下持续培养，待细胞融合度达到80％-85％时，加入星形孢菌素的二甲基亚砜溶液进行诱导，诱导时间为4h。

其中，间充质干细胞传代培养的培养液包括500份体积份数的α-MEM基础培养基、55.5份体积份数的胎牛血清、浓度为100U/mL的青霉素和浓度为100U/mL的链霉素。

星形孢菌素溶液的溶剂为二甲基亚砜，5mg星形孢菌素溶于2.1435mL的二甲基亚砜溶液中，配的浓度为5mm储存液，星形孢菌素在培养液中的工作浓度稀释为5μm。

实施例2：间充质干细胞凋亡小体的制备

将实施例1的来自诱导的凋亡细胞的上清液收集在无菌离心管中(在约50ml管中约10ml)，将上清液于4℃、800×g条件下离心10min，转移上清液、除去细胞碎片；再于4℃、16000×g条件下离心30min，废弃上清液、收集沉淀，PBS重悬；为去除培养基中的试剂或血清的作用，将重悬液于4℃、16000×g条件下再次离心30min以获得作为沉淀的纯度较高的凋亡小体。

沉淀的凋亡小体的直径为1～5μm。凋亡小体的沉淀再用200μL-400μL PBS重悬，分装于无菌离心管中，-80℃保存备用，同时进行凋亡小体基本形态与标记物的鉴定。结果见图1，图1A为扫描电镜下观察的间充质干细胞来源的凋亡小体的基本形态；图1B为流式细胞仪检测的间充质干细胞来源的凋亡小体的大小分布及Annexin V标记物，发现超过80％的凋亡小体含有遗传物质。

实施例3：SD大鼠颅骨缺损模型的建立、治疗与microCT检测

选取4周左右的SD雌性大鼠，用1％戊巴比妥钠(40mg/kg)进行腹腔注射麻醉后，俯卧固定于实验台上，连接动物人工呼吸机，呼吸频率86次/分左右，潮气量15ml，呼吸比设定为1：1。头颅部分去毛备皮，消毒铺巾，于颅骨中央约颅中缝处切开皮肤，钝性分离皮下组织使颅骨可视化。连接打磨机，用5mm环钻在1500r.p.m.或更低的速度下对颅骨进行切割，使得直径为5mm的圆形颅骨片能完整取下。手术期间用无菌生理盐水每2秒滴注1滴，冲洗环钻和颅骨(缓慢的冲洗速度是防止热损伤的关键)，然后从内向外依次缝合缺损区，最后进行造模大鼠的术后护理。手术后连续三天注射青霉素钠以预防术区感染。大鼠颅骨模型建立1-2周后，利用micro CT扫描颅骨，可以看到颅骨处有明显的5mm大小均一的圆形缺损，即可确定模型成功。

对经过micro CT检测确定颅骨缺损模型造模成功的大鼠进行凋亡小体注射。用1％戊巴比妥钠(40mg/kg)进行腹腔注射麻醉后，俯卧固定于实验台上，连接动物人工呼吸机，呼吸频率86次/分左右，潮气量15ml，呼吸比设定为1：1。头颅部分去毛备皮，消毒铺巾，于颅骨中央约颅中缝处切开皮肤，钝性分离皮下组织使颅骨可视化。连接打磨机，用5mm环钻在1500r.p.m.或更低的速度下对颅骨进行切割使得直径为5mm的圆形颅骨片能完整取下。为减少误差，在同一只大鼠颅骨上造左右两个大小均为5mm的缺损，分别位于颅中缝两侧，左侧缺损处行PBS局部注射作为对照组，右侧进行凋亡小体局部注射作为实验组，每只大鼠凋亡小体的计量为4×10⁶个。然后从内向外依次缝合缺损区，最后进行造模大鼠的术后护理，于两个月之后取材收样。

整个治疗周期结束后，将大鼠颅骨进行取材后固定于4％多聚甲醛溶液中固定24-48h后，置于PBS中反复洗涤，洗去组织中的甲醛溶液后，进行micro CT扫描。通过micro CT对对照组和实验组大鼠颅骨进行3D扫描重建。检测结果见图2，图2(左)为对照组大鼠颅骨3D重建图；图2(右)为实验组大鼠颅骨3D重建图；由图可知，与对照组相比，实验组治疗的颅骨缺损大鼠缺损区域有明显的新骨形成。

实施例4：SD大鼠颅骨钙黄绿素、组织化学检测

为检测凋亡小体促进新骨形成速率，在收样前10天与前3天分别对大鼠进行钙黄绿素腹腔注射。取材后，通过硬组织切片对对照组和实验组大鼠颅骨进行激光共聚焦拍摄。检测结果见图3A-3B，图3A为对照组大鼠颅骨钙黄绿素标记图；图3B为实验组大鼠颅骨钙黄绿素标记图；由图可知，实验组治疗的颅骨缺损大鼠缺损区域新骨形成速率明显快于对照组。

为进一步观察新骨形成，用17％乙二胺四乙酸(EDTA)对对照组和实验组大鼠颅骨脱矿3个月。脱矿后的组织置于PBS中反复洗涤，洗去脱矿液，梯度酒精脱水后进行石蜡包埋。对包埋好的组织进行切片，烤片，梯度酒精复水，二甲苯脱蜡，苏木素伊红(HE)染色，封片，倒置显微镜下观察对照组和实验组大鼠颅骨新骨形成。检测结果见图4A-4B，图4A为对照组大鼠颅骨HE染色图；图4B为实验组大鼠颅骨HE染色图；由图可知，实验组治疗的颅骨缺损大鼠缺损区域有明显的新骨形成且新骨与旧骨分界明显。

更进一步，对对照组和实验组大鼠颅骨进行免疫组织化学染色。对包埋好的组织进行切片，烤片，梯度酒精复水，二甲苯脱蜡，PBS置于摇床上洗涤3×5min。洗涤结束将切片上的水分稍微甩干，加正常羊血清工作液室温封闭1-2h，弃封闭液。加稀释好的Anti-OPNantibody溶液置于湿盒中，4℃孵育过夜。用PBS缓冲液洗3×5min后，加稀释好Goat Anti-Mouse IgG溶液室温孵育1-2h，用PBS缓冲液洗涤3×5min后，显色液显色，用80％甘油封片，最后用倒置显微镜采集结果，观察对照组和实验组大鼠颅骨OPN形成量。检测结果见图5A-5B，图5A为对照组大鼠颅骨OPN形成图；图5B为实验组大鼠颅骨OPN形成图；由图可知，与对照组相比，实验组治疗的颅骨缺损大鼠缺损区域有明显的OPN富集。

上述OPN又称骨桥蛋白(Osteopontin)，分子量为60kDa，是一种糖基化蛋白,广泛存在于细胞外基质中.现认为OPN是一种重要的骨基质蛋白,与骨的形成和发展密切相关。

由图5A-5B可以看出，与对照组相比，实验组的新骨形成与骨再生能力明显高于对照组，实验组的新生骨明显增多。

综上所述，本发明提供的间充质干细胞凋亡小体可以有效促进颅骨缺损大鼠的骨修复和骨组织再生。

已有研究表明，同骨髓间充质干细胞类似，脐带、脂肪、脐带血、羊膜、胎盘、牙髓、外周血骨髓、牙、脂肪等来源的间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能，在体外特定诱导条件下具有成骨、成软骨、成血管、成神经分化潜能。凋亡小体作为其亲体细胞携带遗传信息的天然载体，可以促进细胞间信息交流。现已有研究报道，间充质干细胞来源的凋亡小体可以改善心肌梗死；间充质干细胞来源凋亡小体可以促进通过促进肾内皮细胞的增殖而修复肾损伤，破骨细胞来源的凋亡小体在骨重建与新骨形成中具有重要作用。凋亡小体通过携带其亲体细胞的遗传物质促进受体干细胞的增殖并朝神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞以及肌细胞分化。因此，可以推测凋亡小体可以通过携带牙源性间充质干细胞的遗传物质促使其朝成血管、成骨方向分化，从而具有促进牙周骨组织再生的作用。总之，间充质干细胞来源的凋亡小体在骨缺损中的促进骨修复与骨再生具有重要研究意义。

以上实施例和实施方式仅用于帮助理解本发明技术方案，不应作为限制本发明保护范围的依据。本领域技术人员在本发明基础上作出的无需付出创造性劳动的改进和替换，均落入本发明的保护范围。

Claims (1)

1.间充质干细胞凋亡小体在制备直接促进骨缺损区骨组织再生的药物中的应用，其特征在于，所述药物由间充质干细胞凋亡小体及药学上可接受的载体制成；

所述间充质干细胞凋亡小体的直径为1~5μm，其中超过80%的凋亡小体含有遗传物质；

所述间充质干细胞凋亡小体的制备方法包括以下步骤：取间充质干细胞传代培养后，再加入星形孢菌素的二甲基亚砜溶液进行诱导培养，诱导时间为4h，以诱导间充质干细胞凋亡，收集上清液，差速离心，收集离心沉淀，得到所述间充质干细胞凋亡小体；所述星形孢菌素在培养液中的浓度为5μM；

差速离心包括以下步骤：将上清液于4℃、800×g条件下离心10min去除细胞碎片后；再于4℃、16000×g条件下离心30min，收集沉淀，PBS重悬；将重悬液于4℃、16000×g条件下再次离心30min去除杂蛋白，获得作为沉淀的凋亡小体；所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。

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