JP2016093181A - 尿由来の前駆細胞およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】泌尿器組織工学及び細胞療法のため、尿中前駆細胞、および尿サンプルからの尿中前駆細胞の培養を生産する方法の提供。【解決手段】細胞は、選択細胞培地の使用に基づいた選別、形態学に基づいた選別、及び／又は細胞特異的マーカーによる選別を行い、ｃ−ｋｉｔ陽性であり、尿路上皮細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、または間質細胞に分化可能である、分離された尿中前駆細胞。尿中前駆細胞の使用方法であって、細胞が組織足場上に播種され、治療を必要とする被験体の治療方法であって、分化したＵＰＣを含む膀胱組織基質を提供するステップと、およびその基質を患者の体内に移植するステップとを含む方法。最後に、尿サンプルの輸送に適した容器と、培地と、１種類以上の抗生物質と、前記容器、培地、および抗生物質を保持するための包装材料と、場合により使用説明書とを含むキット。【選択図】図１

Description

＜関連出願＞
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００７年５月２１日に出願された
米国仮特許出願第６０／９３９，２４７号明細書、および２００７年６月１１日に出願さ
れた米国仮特許出願第６０／９４３，２１５号明細書の利益を主張し、これら各文献の開
示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は概して、尿由来の細胞の分離、分離された細胞、およびその使用方法に関する
。

再生医療は、身体の外傷組織の再生に焦点を当てた組織工学の応用分野の１つである。
再生医療の用途としては、膀胱などの器官の再建または置換が挙げられる。

多くの疾患および外傷により、膀胱の損傷または損失が生じることがあり、その器官の
修復または置換が必要となる。膀胱外反症、後部尿道弁、または脊髄髄膜瘤（一般には二
分脊椎として知られている）などの先天性異常を有する小児は、高圧膀胱および過緊張低
コンプライアンス膀胱を発症することがある。成人集団では、米国において、膀胱がんは
、男性では悪性腫瘍と通常診断されるものの第４位であり、女性では悪性腫瘍と通常診断
されるものの第９位である。

膀胱の基本的な機能は、低圧下で尿をたくわえることができ意志コントロール下で空に
することができる、容量の大きな貯留槽を提供することである。膀胱機能を失ったことに
苦しむ患者は、生活の質が劇的に悪化し、水腎症および腎不全になる危険性がある。

膀胱再建、または膀胱形成術は、薬物療法が不十分な場合に指示されることが多い。現
在、膀胱拡大術が、腸の開放セグメント（ｄｅｔｕｂｕｌａｒｉｚｅｄ ｓｅｇｍｅｎｔ
）を膀胱上に配置することによって通常行われている。腸セグメントまたは胃弁を泌尿器
再建に使用することは有効であるが、いくつかの問題が発生し得る。有害な副作用として
は、感染、腸閉塞、粘膜産生、電解質異常、穿孔、および発癌性が挙げられる。したがっ
て、組織工学的再生による膀胱再建のより臨床的に適用可能な方法が必要とされている。

組織工学の発展によって、膀胱再生は、初代培養細胞を播種した生分解性膜を使用する
ことによって可能となることが示されている（（Ｋｒｏｐｐ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）
Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５６：５９９）、（Ａｔａｌａ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｕｒｏ
ｌ．１４８：６５８）、（Ｏｂｅｒｐｅｎｎｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１４９））。この概念の実現性は、ヒトにおいてすでに示
され、膀胱再生および膀胱容量の拡大が実施された（Ａｔａｌａ，ｅｔ ａｌ．（２００
６）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３６７：１２４１−４６）。

膀胱再生を首尾よく実現するために使用されている生体材料の足場としては、無細胞コ
ラーゲンマトリックスおよび合成ポリマーが挙げられる。コラーゲンマトリックスとして
は、ブタ膀胱粘膜下膜（ＢＳＭ）および小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）が挙げられ、これらは
どちらも、正常な細胞増殖、分化、および機能に必要な多数の天然成分、たとえばコラー
ゲン、糖タンパク質、プロテオグリカン、および機能性増殖因子などを含有する（（Ｈｏ
ｄｄｅ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ８：１１）、（Ｖｏｙｔｉ
ｋ−Ｈａｒｂｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：４
７８））。合成ポリマーの足場としては、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬ
Ａ）、および乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）が挙げられる（（Ｏｂｅｒｐｅｎｎ
ｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１４９）、（
Ａｔａｌａ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：６０８））。

自家膀胱細胞は、癌を有さない患者における組織工学的構造物のための細胞源として最
も一般的に使用されている。生体材料の足場上に播種された患者自身の培養細胞は、組織
を再生するための骨組みとして機能することができる。しかし、膀胱細胞を得るためには
、侵襲性組織生検手順が細胞採取のために行われ、これは、医療費を増加させ、出血、感
染、ならびに尿道または膀胱の外傷などの予測される合併症とも関連している。さらに、
膀胱生検により得られた細胞は、生検の前または最中に粘膜組織が破壊されることが原因
で、場合により増殖しないことがある（Ｚｈａｎｇ ＆ Ｆｒｅｙ（２００３）Ａｄｖ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．５３９：９０７）。

胚性幹細胞、胎性幹細胞、および成体幹細胞などの別の細胞源が、泌尿器再建のために
調査されている。幹細胞は、自己再生し、最終分化しないので、様々な種類の細胞を産生
することができる。ヒト胚性幹細胞によって、組織工学の目標に対して期待が生じたが（
（Ｆｒｉｍｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｕｒｏｌｏｇｙ ６５：８２７）、
（Ｌａｋｓｈｍａｎａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｕｒｏｌｏｇｙ ６５：８２１））
、免疫適合性、腫瘍形成、および倫理の問題が残る。胎性幹細胞または成体幹細胞は、宿
主組織中に非常に少ない数でのみ検出され、培養中に十分に数が増えないことがあり、よ
り限定された分化能しか有しないことがある（Ｖｏｇｅｌ（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２９２：１８２０）。したがって、組織工学における幹細胞の現在の臨床用途は限定され
得る。

生検による自己細胞の収穫に対するより好ましい代案が、特に生検のために自己細胞を
採取できない場合に、泌尿器組織工学および細胞療法のために必要とされている。

尿サンプルを提供するステップと、次に尿中前駆細胞を該尿サンプルから分離するステ
ップとを含む、尿中前駆細胞（ＵＰＣ）の培養を生産する方法が、本明細書において提供
される。ある実施形態では、該分離ステップは、（ａ）細胞を尿サンプルから収集して粗
細胞サンプルを得るステップと、（ｂ）尿中前駆細胞を該粗細胞サンプルから選別するス
テップとによって行われる。ある実施形態では該収集ステップは、該尿サンプルの遠心分
離によって行われる。

ある実施形態では、選別は、該細胞を、細胞選択培地を含む組成物中に配置することで
行われる。ある実施形態では、選別は、形態学に基づいて行われる。ある実施形態では、
選別は、尿中前駆細胞に特異的なマーカー、たとえば、Ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＳＳ
ＥＡ−４、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、および／またはＣＤ４４を選
別することによって行われる。ある実施形態では、尿中前駆細胞は、哺乳動物被験体（た
とえばヒト被験者）に由来する。本明細書に開示されるいずれかの方法によって産生され
た尿中前駆細胞は、本発明の別の一態様となる。

ｃ−ｋｉｔ陽性であり、尿路上皮、平滑筋、内皮、および間質細胞からなる群より選択
される２つ以上の系譜に分化することが可能な、分離された尿中前駆細胞も提供される。

ＵＰＣを提供するステップと、ＵＰＣを分化させるステップと、分化させた細胞を生分
解性組織足場上に播種するステップとを含む、細胞を組織足場上に播種する方法が提供さ
れる。組織足場は、コラーゲンマトリックスおよび／または合成ポリマー（たとえばポリ
グリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、または乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬ
ＧＡ）など）を含むことができる。

膀胱組織基質を提供するステップであって、該基質が分化したＵＰＣを含むステップと
、基質を患者に移植するステップとを含む、治療を必要とする被験体の治療方法が提供さ
れる。基質は、コラーゲンマトリックスおよび／または合成ポリマー（たとえばポリグリ
コール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、または乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ
）など）を含むことができる。

尿サンプルの輸送に好適な容器と、培地と、１種類以上の抗生物質と、該容器、培地、
および抗生物質を保持するための包装材料と、場合により使用説明書とを含むことができ
るキットが提供される。

本発明のさらなる一態様は、前述の治療方法を行うための薬物を調製するための前述の
細胞の使用である。

以上およびその他の本発明の目的および態様は、図面および以下に示す明細書において
より詳細に説明される。

尿中前駆細胞（ＵＰＣ）分化の提案される経路の図である。 インビトロで培養した尿由来の前駆細胞の顕微鏡画像。これらの細胞は支持細胞層（ｆｅｅｄｉｎｇ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌ）を使用せずに増殖可能である。 尿細胞培養の細胞増殖曲線。細胞は、１つの細胞が６ｃｍの培養皿中にコンフルエントになるまで１０〜１２日で増殖した。 蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）のグラフが、ＣＤ４４、１０５、７３、９０、および１３３などの前駆細胞マーカーが尿から分離した細胞中に存在することを示している。 膀胱生検により得られたヒト尿路上皮（Ａ〜Ｄ）およびＵＰＣ（Ｅ〜Ｈ）のウロプラキン（ＵＰＩａ）、サイトケラチン７、１３、１９、１７、および核酸を使用した免疫蛍光染色の顕微鏡画像。 核酸および平滑筋に特異的なマーカーで二重染色したＵＰＣの顕微鏡画像。これらの画像は、尿由来の平滑筋前駆細胞が、α平滑筋アクチン（ＡＳＭＡ）（Ａ）、カルポニン（Ｂ）、デスミン（Ｃ）、およびミオシン（Ｄ）などの平滑筋タンパク質マーカーを発現することを示している。 インビボでの埋め込みから１か月後のＵＰＣ−膀胱粘膜下膜（ＢＳＭ）およびＵＰＣ−小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）構造物の組織学的な特徴。Ａ．ＳＩＳ足場上で増殖したＵＰＣのマッソン三色染色および検出。Ｂ．ＳＩＳマトリックス上で同定したＬａｃＺ標識ＵＰＣ。Ｃ．尿細胞を播種したＢＳＭ移植片のヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）された部分。Ｄ．ＵＰＣのヒトＸ／Ｙ染色体がＢＳＭマトリックス中に示された。 培養尿細胞中に観察された４種類の細胞：内皮様細胞、平滑筋様細胞、上皮様細胞、および間質様細胞。 細胞を、ＦＡＣＳによって、細胞特異的マーカーＡＥ１／ＡＥ３、デスミン、ビメンチン、およびエリスロポエチンの場合で分析した。 クローンＵＰＣのギムザバンド核型が、継代６の正常染色体パターンを示している。

本発明は、前駆細胞、ならびに尿由来の前駆細胞の選別および培養を行う方法に関する
。好都合には、尿中に見出された細胞は、組織生検を必要とせずに得ることができ、患者
の不快感および起こり得る合併症をなくすことができる。

記載のすべての米国特許参考文献の開示は、それらが本明細書における開示と一致して
いる限りにおいて参照により本明細書に組み入れられる。本明細書における本発明の説明
および添付の特許請求の範囲に使用される場合、文脈が明確に他のことを示しているので
なければ、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数形も含むことを意図して
いる。さらに、化合物の量、用量、時間、温度などの測定可能な値に言及する場合に本明
細書において使用される用語「約」および「およそ」は、指定の量の２０％、１０％、５
％、１％、０．５％、またはさらには０．１％のばらつきを含むことを意味する。または
、本明細書において使用される場合、「および／または」および「／」は、関連する列挙
品目１つ以上のあらゆるおよびすべての可能な組み合わせ、ならびに代替物（「または」
）の中で解釈される場合はそれらの組み合わせがないことを意味し包含している。

「尿中前駆細胞」または「ＵＰＣ」は、多能性および増殖能の両方を有する、尿から収
集および／または分離された細胞である。ＵＰＣは、１つ以上の系譜の中の様々な細胞種
類を得ることができるという点で「多能性」である。たとえば、ある実施形態によるＵＰ
Ｃは、以下の１つ以上への分化能を有する。膀胱尿路上皮細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、
間質細胞、さらには骨細胞、筋細胞、上皮細胞、およびその他の種類の細胞および組織。
従来の研究では、尿路上皮細胞が成熟軟骨細胞に分化できることが示されている（Ｆｅｒ
ｎａｎｄｅｚ−Ｃｏｎｄｅ，Ｂｏｎｅ（１９９６）１８（３）：２８９−９１）。

尿路内腔から脱落した細胞は、インビトロでの培養および維持が困難な古いまたは損傷
した表層細胞であると一般に考えられている。尿から得られる少数の細胞は、支持細胞層
上で急速に増殖することができる。しかし、支持細胞層は、通常は胚性マウス組織由来の
ものであり、それによって、ヒト細胞がマウスフィーダー細胞を使用して培養される場合
、ウイルスが動物からヒトに移動することがある。この問題を回避するために、最近にな
って本発明者らは、支持細胞層を使用せずに尿由来の細胞を増殖させている。前駆細胞の
性質を有し増殖能および多能性が依然として存在する細胞が得られた。

本発明者らの研究は、尿中に前駆細胞および成熟細胞の混合細胞集団が存在することを
示している。本明細書において開示される場合、尿は、尿路上皮前駆細胞および平滑筋前
駆細胞、ならびに内皮前駆細胞および間質前駆細胞を含有する。尿中に見出される前駆細
胞は、膀胱組織、腎組織などから生じることができる。ある実施形態では、腎由来の細胞
に対してＵＰＣの選択が生じる。これはたとえば、収集した細胞の継代によって行うこと
ができ、その理由は、腎細胞は一般に継代によって生存しないと考えられているからであ
る。ある実施形態ではＵＰＣは、２４〜４８時間の間（たとえば３１．３時間ごと）に十
分に２倍まで増殖するので、これらの細胞を大量に増殖させることができる。さらなる実
施形態では、ＵＰＣは腫瘍形成を誘導せず、ある実施形態ではＵＰＣは、増殖または分化
のためにフィーダー細胞を必要としない。

「分離」は、細胞を、それらの自然環境以外の条件下に置くことを意味する。しかし、
用語「分離」は、これらの細胞を後に他の細胞と組み合わせて使用したり他の細胞との混
合物として使用したりすることを排除するものではない。

「被験体」は一般にヒト被験者であり、「患者」が挙げられるが、これに限定されるも
のではない。被験体は、男性または女性であってよく、限定するものではないが白色人種
、アフリカ系アメリカ人、アフリカ人、アジア人、ラテンアメリカ人、インド人などのあ
らゆる人種または民俗であってよい。被験体は、新生児、生後１か月以内の乳幼児、乳児
、小児、青年、成人、および老人などのあらゆる年齢であってよい。

被験体は、たとえば、獣医学および／または調合薬開発の目的のための動物被験体、特
にイヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、齧歯類（たとえば、ラットおよびマウ
ス）、ウサギ、霊長類（ヒトではない霊長類を含む）などの哺乳動物被験体を含むことも
できる。

＜細胞の収集＞
ＵＰＣは、尿を産生するヒトなどのあらゆる動物から収集することができる。本発明の
ある実施形態では、尿中前駆細胞は、哺乳動物の尿から収集される。たとえば、ＵＰＣは
、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、またはヒトの尿から収集することができる。特
定の実施形態では、尿中前駆細胞は、ヒトの尿から得られる。

ある実施形態では、ＵＰＣは、自然排尿された新鮮尿、あるいは尿道カテーテルまたは
膀胱洗浄により排出された尿のサンプルから収集される。尿サンプルは、４℃において１
５００ＲＰＭで５分間遠心分離して、上澄みを吸引し、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ
）等の好適な溶液で洗浄することができる。場合によりＰＢＳは、それぞれ細菌の外傷お
よび感染の可能性から保護するために、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリ
ン−ストレプトマイシンを含有することができる。

細胞を生体液から分離するための方法および装置のさらなる例は、たとえば、米国特許
第５，９１２，１１６号明細書、米国特許出願公開第２００４００８７０１７号明細書、
米国特許出願公開第２００２００１２９５３号明細書、および国際公開第２００５／０４
７５２９号パンフレットに見ることができる。

＜細胞の選別および増殖＞
ある実施形態では、収集されたＵＰＣは増殖する。「増殖」は、生存細胞数の増加を意
味する。増殖は、たとえば、細胞の少なくとも一部が分裂してさらなる細胞を産生する１
つ以上の細胞周期で細胞が成長することによって実現することができる。

「初代培養」は、収集した細胞を培養容器中に播種した後に確立される最初の培養であ
る。「継代」は、培養の第２の培養容器への移動または継代培養を意味し、通常は、機械
的または酵素的脱凝集、再播種、および多くの場合は増殖速度に依存して２つ以上の娘培
養への分割を含んでいる。集団が特定の遺伝子型または表現型で選別される場合、その培
養は継代培養によって「細胞株」となり、すなわちその培養は均一であり望ましい特性を
有する。「細胞系」の確立は、細胞株とは対照的に、特定の系譜に関連する場合もあるが
、概して未分化の状態である。

「選別」は、ある細胞種類を別の細胞腫類と区別するあらゆる独自の特性に基づくこと
ができ、たとえば、密度、大きさ、独自のマーカー、独自の代謝経路、栄養要求性、タン
パク質の発現、タンパク質の排出などに基づくことができる。たとえば、細胞は、遠心分
離勾配を使用した密度および大きさに基づいて選別することができる。独自のマーカーは
、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、免疫磁気ビーズ選別、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）
、パニングなどを使用して選別することができる。独自の代謝経路および栄養要求性は、
細胞が特に無血清環境中で増殖される培地の栄養成分の構成および／または量を変化させ
ることによって利用することができる。タンパク質の発現および／または排出は、種々の
アッセイ、たとえば、ＥＬＩＳＡを使用して検出することができる。

ある実施形態では、ＵＰＣは、前駆細胞培地などの前駆細胞の増殖を促進する特定の増
殖環境中で尿から分離した細胞を提供することによって選別される。ある実施形態では、
前駆細胞培地は、３／４のＤＭＥＭ、１／４のハムＦ１２、１０％のＦＢＳ、０．４ｍｇ
／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０^−１０Ｍのクロン・トキシン（Ｃｈｒｏｎ Ｔｏｘｉｎ
）、５ｍｇ／ｍｌのインスリン、１．２ｍｇ／ｍｌのアデニン、２．５ｍｇ／ｍｌのトラ
ンスフェリン＋０．１３６ｍｇ／ｍｌの３，３９，５−トリヨード−Ｌ−チロニン、１０
ｍｇ／ｍｌのＥＧＦ、および１％のペニシリン−ストレプトマイシンを含有する（Ｚｈａ
ｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ａｎｉｍａｌ
３７：４１９，２００１）。さらなる実施形態では、分離されたＵＰＣは、前駆細胞の
選択的分化を促進する特定の増殖環境中で得られる。たとえば、ある実施形態では、ケラ
チノサイト無血清培地で増殖させたＵＰＣは尿路上皮になる。さらなる実施形態では、１
０％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭ中で増殖させたＵＰＣは平滑筋様細胞になる。ある実
施形態では、内皮様細胞は、２０％のＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミン、ＥＧＦ
（５ｎｌ／ｍｌ）１％ピルビン酸ナトリウム、および１％のペニシリン−ストレプトマイ
シンを有するＭ１９９中で培養することができる。ある実施形態では、間質様細胞は、１
０％のＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミン、および１％のペニシリン−ストレプト
マイシンを有するＤＭＥＭ中で培養することができる。

別の実施形態では、ＵＰＣは形態学によって選別される。たとえば、尿から分離された
細胞は、１つの細胞に分離できる濃度に希釈して（たとえば、細胞は、マルチウェルプレ
ート中約０．５細胞／ウェルの濃度に希釈することができる）、顕微鏡下で観察すること
ができる。１種類の細胞が入ったウェルは、保持して増殖され、観察される形態学によっ
て、たとえば、尿路上皮細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、および／または間質細胞に選別す
ることができる（図６Ａ参照）。

本発明のある実施形態による尿中前駆細胞は、同定、選別、および／または分離を１つ
以上の「マーカー」に基づいて行うことができる。このようなマーカーとしては、特異的
な遺伝子発現、このような細胞の表面上に見出される抗原分子などが挙げられる。特定の
実施形態では、尿中前駆細胞の選別および分離は、少なくとも１つの特異的マーカーの発
現に基づいて行われる。ある実施形態では、ＵＰＣは、ＣＤ１１７（Ｃ−ｋｉｔ）、ＳＳ
ＥＡ−４、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４などの１つ以
上のマーカーを有し、ＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＣＤ４５の１つ以上のマーカーは測定
可能な量では有さない。したがって、ある実施形態は、ＣＤ１１７、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ
１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４の１つ以上を発現し、および
／またはＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＣＤ４５の１つ以上を発現しない尿中前駆細胞の選
別および分離を含んでいる。たとえば、ある実施形態では本発明の尿中前駆細胞の同定、
選別、および／または分離はＣＤ１１７の発現に基づいて行われる。

ある実施形態では、ＵＰＣは、本明細書において開示される場合、たとえば遠心分離に
よって細胞を尿サンプルから収集することによって、および／または細胞を好適な培地中
または培地上に直接配置することによって、および／または前駆細胞特異的細胞マーカー
の発現に基づいた尿中前駆細胞の選別および分離によって（たとえば、免疫組織化学また
はウエスタンブロット解析によって）得ることができる。あるいは、尿中前駆細胞は、細
胞の収集および選別を、たとえばフルオロフォア（たとえば、ＡＰＣ、フィコエリトリン
、アロフィコシアニン類、フルオレセイン、テキサスレッド（ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ）など
）に結合したマーカー特異的抗体（たとえば抗ＣＤ１１７抗体）を使用した蛍光標示式細
胞分取、または磁性粒子に結合したマーカー特異的抗体を使用した磁気選別によって行う
ことで得ることができる。例として、細胞は、ＣＤ１１７受容体タンパク質の細胞外ドメ
イン（アミノ酸２３〜３２２）に特異的に結合するウサギポリクローナル抗体とともに温
置することができる（Ｄｅ Ｃｏｐｐｉ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．２５：１００）。ＣＤ１１７陽性細胞は、磁性ヤギ抗ウサギＩｇＧマイクロ
ビーズ（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ）とともに温
置して精製し、Ｍｉｎｉ−ＭＡＣＳ装置上で選別することができる。尿中前駆細胞は、マ
イクロビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄ）に直接結合したモノクローナル抗ＣＤ１１７抗体を
使用して選別することもできる。固相に取り付け取り外すことを含むあらゆる好適な選別
方法が本発明の範囲内と考えられる。

本発明のある実施形態による尿中前駆細胞は、たとえば１：４希釈によって、慣例的に
継代または継代培養することができ、約５０〜７０％の集密度まで増殖させることができ
る。尿中前駆細胞の分離された集団は、慣例的に増殖させることができ、通常の培養条件
下、たとえば５％ＣＯ_２で３７℃の加湿雰囲気下に維持することができる。本発明の細胞
はＫＦＳＭ−前駆細胞培地（１：１）を有する複合培地中で増殖可能であるが（Ｚｈａｎ
ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ａｎｉｍａｌ
３７：４１９，２００１）、前駆細胞の所望の細胞への分化をより厳密に制御するために
は、尿路上皮前駆細胞の場合はＫＳＦＭなどの単純な無血清培地中、あるいは平滑筋前駆
細胞または間質前駆細胞の場合は、ダルベッコ最少必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍ
ｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ）（ＤＭＥＭ）、ハンクス塩基性塩溶液
（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｓｉｃ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ）、ダルベッコ
リン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）、ＲＰＭＩ、またはイスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃ
ｏｖｅ’ｓ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ）な
どの１０％ＦＢＳを有する培地中で細胞を維持することが一般に好ましい。クローン尿中
前駆細胞系は、９６ウェルプレート中または２４ウェルプレート中のいずれかでの従来の
限界希釈法によって産生することもできる。細胞コロニーの形成後、細胞が取り出され、
マルチウェルディッシュ中に移される。

ある実施形態では、明確な細胞集団の増殖および分化を促進するために、増殖因子また
は他の分裂促進剤が培地中に含まれる。これに関して、本発明の特定の実施形態は、尿中
前駆細胞の尿路上皮細胞、平滑筋細胞、間質細胞などへの増殖および分化を支援する選択
培地を使用した尿中前駆細胞の培養を含んでいる。本文脈における場合の分化は、細胞が
特定の形態学的または機能的性質を得る細胞の状態を意味する。例として、０．０９ｍＭ
のカルシウムを補充したケラチノサイト無血清培地（ＫＳＦＭ）中で尿中前駆細胞を増殖
させると、これらの細胞は尿路上皮に分化する。同様に、血清、たとえば、１０％ウシ胎
児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した尿中前駆細胞は、平滑筋細胞の分化を
促進する。したがって、本発明は、分化して、少なくとも１つの尿路上皮特異的マーカー
、または少なくとも１つの平滑筋特異的マーカー、または少なくとも１つの他の組織特異
的マーカー（たとえば、間質特異的）を発現する、尿中前駆細胞集団も包含する。

ＵＰＣが特定の細胞腫類に分化しているかどうかの決定は、これらの細胞種類に特異的
なマーカーの検出によって行うことができる。たとえば、尿路上皮細胞は、たとえば、ウ
ロプラキン、サイトケラチン７、サイトケラチン１３、サイトケラチン１７、およびサイ
トケラチン１９、およびサイトケラチン２０などの１つ以上の尿路上皮の特異的マーカー
の存在によって同定することができ、一方、平滑筋細胞は、たとえば、α平滑筋アクチン
、デスミン、カルポニン、およびミオシンなどの１つ以上の平滑筋特異的マーカーの存在
によって同定することができる。細胞種類特異的マーカーの発現は、あらゆる好適な従来
方法を使用して測定することができ、そのような方法としては、たとえば、免疫組織化学
および／またはウエスタンブロット解析が挙げられる。

さらに、所望であれば、本発明の細胞は使用前に凍結または凍結保存することができ、
その後解凍して生存形態にすることができる。細胞の凍結または凍結保存（後に生存形態
に戻すための）方法は当分野において周知である。たとえば、細胞の凍結保存は、増殖培
地と、水が氷の結晶を形成するのを防止する他の液体との混合物中で凍結させ、続いて液
体窒素温度（たとえば約−８０〜約−１９６℃）で細胞を保管することを含むことができ
る。たとえば、米国特許第６，７８３，９６４号明細書を参照されたい。

＜治療方法＞
本明細書に開示される方法を使用して治療できる疾患は、尿路組織の増加または置換を
含むが、これらに限定されるものではない。本明細書において使用される場合、「治療」
は、患者、たとえば、疾患に苦しむまたは疾患の発症の危険性のある患者に利益を付与す
るあらゆる種類の治療を意味する。治療としては、患者の状態を改善する（たとえば１つ
以上の症候の軽減）、発病または疾患の進行を遅らせることなどの目的で行われる行為ま
たは控えられる行為が挙げられる。

本発明のある実施形態による尿中前駆細胞は、種々の機能性細胞型に分化できることが
示され、本発明の尿中前駆細胞は、たとえば、膀胱外反症、膀胱容量不足、膀胱の部分ま
たは全摘出術後の膀胱の再掲、外傷により損傷した膀胱、腎臓、または尿管の修復などの
尿路の疾患および症状の治療において用途が見いだされている。ある実施形態による治療
は、先天性異常、癌、外傷、放射線、感染、医原性損傷、神経損傷、またはその他の原因
などの尿路の疾患および症状が関与している。一般に、治療は、尿路機能の修正、尿路機
能の改善、あるいは尿路の疾患または症状を防止または治療するための、損傷した尿路細
胞または全組織または器官の再建、修復、増大、または置換を伴う。これに関して、尿中
前駆細胞は、尿管、膀胱、尿道、腎盂、腎臓、骨、軟骨、筋肉、皮膚などの尿路構造の組
織工学に使用することができる。

さらに、尿中前駆細胞は、下部尿路の薬理学、および尿路疾患の診断において用途を見
いだすこともできる。本発明のある実施形態による細胞は、血尿または尿路系の腫瘍、た
とえば、膀胱、腎盂、腎臓、尿管、前立腺、および尿道の腫瘍、腎性糖尿病、尿細管ネク
ローシス、急性または慢性腎不全、ならびに腎移植後の腎拒絶反応などの腎疾患、ならび
に間質膀胱炎、神経因性膀胱、照射膀胱（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｂｌａｄｄｅｒ）、な
らびに膀胱尿管逆流または逆流性腎症などの他の疾患などの疾患の診断に使用することが
できる。たとえば、米国特許第５，７３３，７３９号明細書、第５，３２５，１６９号明
細書、および第５，７４１，６４８号明細書を参照されたい。

本発明によると、ある実施形態では治療は、たとえば、未分化、分化、またはそれらの
混合物の尿中前駆細胞の有効量を、治療を必要とする被験体に投与することによって、疾
患の少なくとも１つの徴候または症状、あるいは被験体の状態を回復または緩和すること
を含む。

組織が埋め込まれる用途において、ある実施形態では細胞は、組織が中に埋め込まれる
被験体と同じ種である。ある実施形態では細胞は、自己（すなわち、治療される被験体に
由来する）、同遺伝子系（すなわち、遺伝学的には同じであるが異なる被験体、たとえば
一卵性双生児由来）、同種異系（すなわち、同じ種の遺伝学的には異なる個体に由来）、
または異種（すなわち、異なる種の個体に由来）によるものである。

ある実施形態では、本発明の細胞が被験体の治療に使用される場合、細胞から、薬学的
に許容される賦形剤または担体と混合された細胞を含有する医薬組成物が配合される。こ
のような製剤は、当分野において周知の技術を使用して調製することができる。たとえば
、米国特許出願公開第２００３／０１８０２８９号明細書、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｌｆｏｎｓ
ｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄｉｔｏｒ，２０ｔｈ ｅｄ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２０００を参照
されたい。本発明による医薬製剤の製造においては、典型的には細胞は、特に許容される
担体と混合される。当然ながら担体は、製剤中のすべての他の成分に対して適合性となる
意味において許容されるべきであり、患者に対して有害となるべきではない。担体は、固
体または液体、またはその両方（たとえばヒドロゲル）であってよく、本発明の細胞とと
もに単位用量製剤として配合することができる。一実施形態では、本発明の細胞は、細胞
の凝集を軽減するために担体中の懸濁液として提供される。

別の一実施形態では、本発明の細胞は、カプセル化された形態で配合される（たとえば
、インビボで細胞の生存能を維持するために栄養素および酸素が透過性であるカプセル中
に封入される）。細胞を透過性カプセル中に封入するための材料および方法は周知であり
、たとえば米国特許第６，７８３，９６４号明細書に記載されている。たとえば、細胞は
、半透膜で取り囲まれた多糖類ガムの内部細胞含有コアを含む５０または１００μｍ〜１
または２ｍｍの直径のマイクロカプセル、アルギネートをポリリジン、ポリオルニチン、
およびそれらの組み合わせと共に含むマイクロカプセルの中に封入することができる。他
の好適なカプセル化材料としては、米国特許第５，７０２，４４４号明細書に記載のもの
が挙げられるが、これに限定されるものではない。

特定の一実施形態では、本発明の細胞は、生分解性の足場またはマトリックスとともに
投与される。膀胱細胞は、インビトロでの共培養をコラーゲンに富んだ足場上で行った後
、平滑筋細胞の表面上に増殖する尿路上皮の明確な層を有する正常な膀胱構造を形成する
ことが可能であることが示されている（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｕｒ
ｏｌ．１６４：９２８）。さらに、膀胱細胞を播種した足場構造物は、部分膀胱瘻造設術
モデル中の組織再構築の再生過程に用いられることが示されている（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ
ａｌ．（２００５）ＢＪＵ Ｉｎｔ．９６：１１２０）。したがって、前駆細胞の実施形
態は、膀胱を完全に再生するための後のインビボ埋め込みのための、インビトロの細胞工
学的足場構造物において用途が見いだされる。

生分解性の足場またはマトリックスは、生物学的機能に対して毒性および障害作用を有
さないあらゆる物質であり、宿主の構成成分になることができる。望ましくは、足場また
はマトリックスは、マトリックスの孔隙上および孔隙中の両方に細胞が堆積できるようす
るため多孔質であり、ある実施形態では成形される。このような製剤は、少なくとも１つ
の細胞集団を生分解性足場に供給して、細胞集団を足場の上および／または中に播種する
ことによって調製される。ある実施形態では、次に、播種された足場が被移植者である被
験体の体内に埋め込まれ、そこで独立に層状に組織化した細胞集団が、新しい器官または
組織構造の形成を促進する。

使用可能な生分解性足場としては、たとえば、天然または合成のポリマー、たとえば、
コラーゲン（たとえば、ＳＩＳおよびＢＳＭ）、ポリ（ラクテート酸）、ポリ（グリコー
ル酸）、ポリオルトエステル、およびポリ無水物などのポリ（αエステル）、ならびにそ
れらのコポリマーなどが挙げられ、制御された速度で加水分解されることで分解すること
ができ、再吸収される。他の好適な材料の例は米国特許第７，１８６，５５４号明細書中
に提供されている。

生分解性足場は、たとえば、溶媒キャスティング、圧縮成形、フィラメント延伸、メッ
シュ化、リーチング、ウィービング、およびコーティングなどの方法を使用して「成形」
することができる。溶媒キャスティングでは、塩化メチレンなどの適切な溶媒中の１種類
以上のポリマーの溶液を分岐パターンの凹凸構造としてキャストする。溶媒を蒸発させた
後、薄いフィルムが得られる。圧縮成形では、ポリマーを最大３０，０００ポンド／平方
インチの圧力で適切なパターンにプレス成形する。フィラメント延伸は溶融ポリマーから
延伸することを含み、メッシュ化は繊維を圧縮してフェルト状材料にすることによってメ
ッシュを形成することを含む。リーチングでは、２種類の材料を含有する溶液を最終形態
に類似した形状に広げる。次に溶媒を使用して一方の成分を溶解させて除去することで、
孔隙が形成される（米国特許第５，５１４，３７８号明細書参照）。核形成では、再建尿
路上皮移植片の形状の薄いフィルムを、放射性核分裂生成物に曝露して、放射線で損傷し
た材料のトラックを形成する。次にこのポリカーボネートシートを酸または塩基でエッチ
ングし、放射線で損傷した材料のトラックを孔隙に変える。最後に、レーザーを使用して
、多くの材料が通過する個別の孔の成形および焼失を行うことで、均一な孔径を有する再
建尿路上皮移植片構造を形成することができる。これらの複数の成形技術は組み合わせて
使用することができる。たとえば、生分解性マトリックスを織成し、圧縮成形し、接着剤
を使用することができる。さらに、異なる方法で成形した異なるポリマー材料を互いに接
合して複合構造を形成することができる。この複合構造は層状構造であってよい。たとえ
ば、１つのポリマーマトリックスを１つ以上のポリマーマトリックスに取り付けて多層ポ
リマーマトリックス構造を形成することができる。この取り付けは、液体ポリマーを使用
した接着、または縫合によって行うことができる。さらに、このポリマーマトリックスは
、中実ブロックとして形成し、レーザーまたはその他の標準的な機械加工技術によって所
望の最終形態に成形することができる。レーザー成形は、レーザーを使用して材料を除去
する方法を意味する。

生分解性足場は、たとえば埋め込み後の新組織の形成を促進するために、埋め込みの前
（細胞を播種する前または後）に添加剤または薬物で処理することができる。したがって
、たとえば、増殖因子、サイトカイン、細胞外マトリックス成分、および／またはその他
の生物活性材料を生分解性足場に加えて、移植片の治癒および新組織の形成を促進するこ
とができる。このような添加剤は、一般に、適切な新組織が移植された器官または組織中
に形成されるように、再建または拡大される組織または器官により選択される。骨の治癒
を促進するために使用されるこのような添加剤の例としては、たとえば、Ｋｉｒｋｅｒ−
Ｈｅａｄ（１９９５）Ｖｅｔ．Ｓｕｒｇ．２４（５）：４０８−１９が参照される。

生分解性足場上への細胞の播種は、標準的な方法により行うことができる。たとえば、
組織修復に使用されるポリマー基質上への細胞の播種が報告されている（たとえば、参照
により本明細書に組み入れられるＡｔａｌａに付与された米国特許第６，１７１，３４４
号明細書、Ａｔａｌａ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１４８：６５８−６２
、Ａｔａｌａ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：６０８−１２）。例と
して、培養中で増殖した細胞は、トリプシン処理により細胞を分離することができ、分離
した細胞を生分解性足場に播種することができる。あるいは、細胞培養で得られた細胞は
培養皿から細胞層として持ち上げることができ、その細胞層は、細胞をあらかじめ分離す
ることなく、生分解性足場上に直接播種することができる。

生分解性足場上に播種される細胞の密度は変化させることができる。たとえば、ある実
施形態では細胞密度が高いと、播種された細胞による組織形成がより促進され、密度が低
いと宿主から移植片に細胞が浸潤することによって比較的大きな組織を形成することがで
きる。生分解性足場および細胞に依存して他の播種技術を使用することもできる。たとえ
ば、減圧濾過によって細胞を生分解性足場に適用することができる。細胞種類の選別、お
よび生分解性足場上への細胞の播種は、本明細書の教示を考慮すれば、当業者の日常的な
作業となる。

さらなる実施形態では、本発明の製剤は、非経口投与（たとえば、皮下、筋肉内、皮内
、静脈内、動脈内、腹腔内への注射）または埋め込みのための製剤を含む。ある実施形態
では、投与は、単純な注射、または腎動脈などの好適な血管中に配置されたカテーテルに
よる注入のいずれかによって、血管内に行われる。別の一実施形態では、投与は、前述の
ように増大すべき器官または組織への移植片として行われる。

非経口投与に適した本発明の製剤としては、好ましくは水性である滅菌液体、細胞注入
組成物が挙げられ、これらの製剤は、意図する受容者の血液と等張にすることができる。
これらの製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および意図する受容者の血液と等張にす
るための溶質を含有することもできる。これらの製剤は、投与される細胞は別にすると、
細菌およびウイルスなどの汚染微生物が存在しないという意味で滅菌されている。本発明
の製剤は、注入可能（ｓｙｎｒｉｎｇｅａｂｌｅ）かつ注射可能な形態であってよいし、
たとえば被験体の膀胱、尿道、尿管、または腎臓の中に外科的に移植するのに適した形態
であってよいし、被験体への投与に適した他のあらゆる形態であってもよい。

ある実施形態によると、被験体に投与される細胞は、カプセル化などの他のステップの
存在または非存在、あるいは細胞の免疫抑制療法の実施に依存して、治療される被験体に
対して同系（すなわち、同遺伝子系および自己などの同族）、同種異系（すなわち同種）
、または異種（すなわち、異種性）であってよい。

細胞の治療有効用量は、被験体間である程度変動し、被験体の年齢、体重、および症状
、ならびに送達経路などの要因に依存する。このような用量は、当業者に公知の手順によ
り決定することができる。一般に、ある実施形態では、被験体当たり１×１０^５、１×１
０^６、または５×１０^６から１×１０^７、１×１０^８、または１×１０^９細胞以上の用量
を１回で投与したり、数回に分割して投与したりすることができる。別の実施形態では、
被験体の体重１ｋｇ当たり１〜１００×１０^８細胞の値の用量を１回で投与したり、数回
に分割して投与したりすることができる。当然ながら、必要であれば追跡投与を行うこと
ができる。

所望または必要である場合には、被験体は、公知の技術により、ラパマイシン、アザチ
オプリン、コルチコステロイド、シクロスポリン、および／またはＦＫ５０６などの、投
与される細胞の移植片拒絶反応を抑制する物質を投与することもできる。たとえば、米国
特許第５，４６１，０５８号明細書、第５，４０３，８３３号明細書、および第５，１０
０，８９９号、ならびに米国特許第６，４５５，５１８号明細書、第６，３４６，２４３
号明細書、および第５，３２１，０４３号明細書を参照されたい。

さらに、本発明の細胞は、播種の前に遺伝物質（たとえば特異的遺伝子）をトランスフ
ェクトすることができる。有用な遺伝物質は、たとえば宿主の免疫応答を軽減または除去
することができる遺伝的配列であってよい。たとえば、クラスＩおよびクラスＩＩ組織適
合抗原などの細胞表面抗原の発現を抑制することができる。これによって、移植細胞が宿
主によって拒絶される可能性を減少させることができる。

＜尿中前駆細胞を収集するためのキット＞
尿サンプルを収集するためのキットも本明細書において提供される。好ましくは本発明
によるキットは、遠隔地（たとえば好適な実験施設）への輸送中に尿中前駆細胞の生存能
を維持する機能を果たす。ある実施形態では、キットは、好適な培地（たとえば、１〜１
５ｍＬの、ある実施形態では５ｍＬの、ウシ胎児血清などの血清）を含有する管を含む。
この培地は、使用前に解凍するように、凍結させて提供することができる。別の実施形態
では、キットは、抗生物質（たとえば、１〜１５ｍＬの、ある実施形態では５ｍＬの、１
％ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する溶液）を含有する管を含む。抗生物質
は粉末形態であってもよいし、水溶液であってもよい（場合により、使用前に解凍するよ
うに、凍結させて提供される）。

キットは、尿サンプル（たとえば、好適な容積、たとえば１００〜１，０００ｍＬ、あ
る実施形態では５００ｍＬの３つの滅菌プラスチック瓶）を収集するための好適な容器（
たとえば、瓶）を含むこともできる。キットは、アルコール消毒綿を含むこともできる。
ある実施形態ではアイスバック、冷パックなどの冷却手段が、尿をおよそ４℃に冷却して
維持するために含まれる（たとえば、３インチ×２インク×０．５インチの寸法の２つの
アイスバッグ）。さらなる実施形態は、上記の構成品を維持することが可能な容器（たと
えば、高さ６インチ×幅６インチ×長さ７インチの寸法のプラスチック製の箱）を含み、
場合により使用説明書も含む。

本発明を以下の非限定的実施例により、さらに詳細に説明する。
〔実施例１〕

＜尿からの前駆細胞の分離および特性決定＞
５８のヒト尿サンプルを、２〜５０歳の範囲の年齢の２２名の男性および１名の女性の
提供者（１５名の健常人および８名の患者）から収集した。すべての培養中で細菌汚染は
見られなかった。尿サンプルを４℃、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離し、滅菌ＰＢＳで
２回洗浄した。段階希釈法を使用して、細胞を平均０．５細胞／ウェルで、前駆細胞培地
を有するマルチウェルプレート中に入れた。この前駆細胞培地は、３／４のＤＭＥＭ、１
／４のハムＦ１２、１０％のＦＢＳ、０．４ｍｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０^−１０
Ｍのクロン・トキシン、５ｍｇ／ｍｌインスリン、１．２ｍｇ／ｍｌのアデニン、２．５
ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン＋０．１３６ｍｇ／ｍｌの３，３９，５−トリヨード−Ｌ
−チロニン、１０ｍｇ／ｍｌのＥＧＦ、および１％のペニシリン−ストレプトマイシンを
含有する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ
．−Ａｎｉｍａｌ ３７：４１９，２００１）。１種類の細胞を同定し、５０％を超える
集密度まで増殖させた。次に細胞を継代培養し、６ｃｍの培養皿に移し、増殖させた。

増殖した初代細胞が、尿サンプルから開始した培養の約３９％で得られた。コロニー中
の平均細胞数は、２日目で健常人で４．５／１００ｍｌ尿であった（表１および図１）。
細胞は小さくより明るい外観の細胞であり、長期間の観察による本発明者らの経験に基づ
くと、膀胱粘膜の基層由来のものがほとんどであると思われ、比較的未分化であった。各
クローン系で尿細胞の高収率が一貫して実現された。尿細胞の細胞倍増期間は、前駆細胞
培地およびＫＳＦＭ（１：１）の複合培地中で３１．３時間であった。尿細胞が１つの細
胞から６ｃｍの培養皿中で集密的となるまで１０〜１２日を要した（図２）。

尿細胞の分子的および細胞的特徴を示すために、前駆細胞特異的および分化細胞特異的
マーカーの発現を分析した。継代１、３、および４の尿細胞すべては、Ｃ−ｋｉｔ、ＳＳ
ＥＡ−４、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ７３^＋、ＣＤ９０^＋、ＣＤ１３３^＋、およびＣＤ４４^＋を
含む前駆細胞特異的表面マーカーに関して陽性染色を示し、ＣＤ３１⁻、ＣＤ３４⁻、お
よびＣＤ４５⁻に関しては陰性染色を示した（表２およびく）。ＣＤ４４は、膀胱基底細
胞の細胞表面マーカーであると考えられている（Ｄｅｓａｉ，ｅｔ ａｌ．（２０００）
Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１３：１３１５）。基底細胞は自己再生能を有し、増殖して中間
細胞および表皮細胞に分化することができ、基底細胞は尿路上皮前駆細胞または幹細胞と
呼ばれる（Ｓｔａａｃｋ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
７３：１２１）。尿中の基底細胞は、ＣＤ４４によって、および基底細胞および中間細胞
の細胞内タンパク質マーカーであるサイトケラチン１３を使用した免疫蛍光法によって確
認した（Ｒｏｍｉｈ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．３２
０：２５９）。

前駆細胞および成熟細胞の混合細胞集団が尿中に存在すると思われる。尿は尿路上皮前
駆細胞および平滑筋前駆細胞を含有することが分かった。これらの細胞は前述のＣＤマー
カーで確認した。さらに、尿路上皮前駆細胞マーカーおよび平滑筋細胞マーカーを、これ
らの細胞をさらに特徴付けるために使用した。尿路上皮前駆細胞特異的マーカーに対する
モノクローナル抗体のウロプラキンＩａならびにサイトケラチン７、１３、１７、および
１９を、７０％の細胞集密度において、各抗体について以下の希釈で使用した。抗サイト
ケラチン７、１：２００、抗サイトケラチン１３、１：１００、抗サイトケラチン１７、
１：１００、および抗サイトケラチン１９、１：１００。ウロプラキンおよび上記サイト
ケラチンの尿中前駆細胞中での発現を測定し、通常の生検組織から得られた培養尿路上皮
中のマーカーの発現と比較し（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．５３９：９０７、Ｌｕｄｗｉｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９９
）ＢＪＵ Ｉｎｔ．８４：５０７、Ｓｕｇａｓｉ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｕｒｏ
ｌ．１６４：９５１、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌ
ｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．３７：４１９）、正常ヒト膀胱粘膜とも比較した（Ｓ
ｏｕｔｈｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（１９９４）７
１：５８３）。免疫蛍光の程度は、陰性（−）から強度に陽性（＋＋＋＋）までの範囲で
規定した。組織生検から得た培養尿路上皮と同様に、尿細胞は、ウロプラキンＩａ、なら
びにサイトケラチン（ＣＫ）７、１３、１７、および１９を発現した（図３および表３）
。

さらに、免疫蛍光法によって、体内の膀胱細胞を、平滑筋細胞特異的マーカーのα平滑
筋アクチン（ＡＳＭＡ）、デスミン、ミオシン、およびカルポニンを発現する尿から得た
細胞と比較した（図４および表４）。

〔実施例３〕

＜尿中前駆細胞の細胞収縮性およびタイトジャンクション＞
尿由来の平滑筋細胞の機能特性は、コラーゲン格子を使用して細胞収縮性を求めること
によって確認される。コラーゲン格子収縮アッセイ方法は、当分野において公知である（
Ｋｒｏｐｐ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６２：１７７９）。アゴニスト
に応答した収縮性は、格子開放の直前にアゴニストを無血清培地に加えることを除けば同
様の方法で行われる。試験されるアゴニストとしてはＣａイオノフォアＡ２３１８７（１
０２５Ｍ）およびＫＣｌが挙げられる。

尿由来の尿路上皮前駆細胞のタイトジャンクションを解析する。尿路上皮のバリア機能
は、頂端膜プラークと細胞間タイトジャンクションによって維持される。尿中前駆細胞中
のタイトジャンクション成分は、電気顕微鏡検査（ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｍｉｃｒｏｓｃｏ
ｐｙ）等の従来方法を使用して調べられる（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｄ
ｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．５３９：９０７、Ｌｕｄｗｉｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ
．（１９９９）ＢＪＵ Ｉｎｔ．８４：５０７、Ｓｕｇａｓｉ，ｅｔ ａｌ．（２０００
）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６４：９５１、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．３７：４１９、Ｃｒｏｓｓ，ｅｔ ａｌ
．（２００５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８９：Ｆ４
５９）。
〔実施例４〕

＜尿中前駆細胞の平滑筋細胞への分化＞
尿中前駆細胞の平滑筋細胞への分化に対する、上皮−間質細胞相互作用または細胞間相
互作用の影響を調べるために（Ｓｔａａｃｋ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔｉａｔｉｏｎ ７３：１２１、ＤｉＳａｎｄｒｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｕ
ｒｏｌ．１６０：１０４０）、２つの共培養方法を使用する。その第１は、４．５μｍの
サイズ排除を有するトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）装置を使用する間接共培養で
ある。尿平滑筋前駆細胞を、上部チャンバーのウェル上に入れ、組織生検で得た膀胱平滑
筋細胞および／または尿路上皮をトランスウェルユニットの底部ウェル上に播種する（Ｌ
ｕｋ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０５：３９、
Ｇｅｒｓｔｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒ
ｅｓ．４４（ｓｕｐｐｌ １）：８５）。第２の方法は、直接共培養法であり、０．４μ
ｍの孔径のトランスウェルインサートを使用して行われる。このトランスウェルは、基底
膜として使用され、その下面上で尿中前駆細胞が培養され、一方、反対側の上面上で正常
ヒト膀胱尿路上皮および平滑筋細胞が培養される（Ｌｅ Ｖｉｓａｇｅ，ｅｔ ａｌ．９
２００４）Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．１０：１４２６）。続いて尿細胞は、表現型の出現、
分子解析、および平滑筋タンパク質発現免疫組織化学的染色によって、細胞播種から３、
７、１４、および２８日後に評価される。
〔実施例５〕

＜尿中前駆細胞を播種した足場＞
尿中前駆細胞の膀胱粘膜下膜（ＢＳＭ）および小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）上への細胞付
着性、増殖、および分化を評価して、臨床応用における細胞−マトリックス相互作用を求
めた。インビトロでの細胞播種構造物では、尿中前駆細胞由来の尿路上皮のＢＳＭ粘膜側
への播種、尿中前駆細胞由来の平滑筋細胞の漿膜上への播種を混合培地（ＫＳＦＭ：ＤＭ
ＥＭ、１：１）の存在下で行った。

続いて、播種したマトリックスを無胸腺マウスの皮下に埋め込んだ。埋め込まれた培養
組織を取り出し、組織科学（Ｈ＆Ｅおよびトリクロム（Ｔｒｉｃｈｒｏｍ））、免疫組織
化学（サイトケラチンおよび平滑筋細胞特異的マーカー）、ウエスタンブロット解析、お
よびヒトＸ／Ｙ染色体検出アッセイ（ＦＩＳＨ）により評価した。組織化学的および免疫
組織化学的分析では、標準手順を使用して、培養組織を１０％の中性緩衝ホルマリン中で
固定し、脱水し、パラフィン中に埋め込んだ。５ｍｍの断片を切り取り、標本にした。通
常のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色およびマッソン（Ｍａｓｓｏｎ）三色
染色を行った。免疫組織化学的染色も、平滑筋細胞タンパク質に対するモノクローナル抗
体の、α平滑筋アクチン（１：１０００で希釈）、デスミン（１：２０）、カルポニン（
１：５０）、およびミオシン（１：１００）、ならびに尿路上皮細胞特異的タンパク質に
対するモノクローナル抗体の、サイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３（１：１００の抗体希釈）
を使用して行った（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００５）ＢＪＵ Ｉｎｔ．９６：１１
２０、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．５３
９：９０７、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６４：９２８、Ｚ
ｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００６）ＢＪＵ Ｉｎｔ．９８：１１００、Ｚｈａｎｇ，ｅ
ｔ ａｌ．（２００４）Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．１０：１８１、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ
．（２００１）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．３７：４１
９）。

ウエスタンブロット解析用のタンパク質は、公知の方法により溶解緩衝液を使用して、
細胞、または細胞を播種した足場組織を溶解させることによって分離した（Ｚｈａｎｇ，
ｅｔ ａｌ．（２００５）ＢＪＵ Ｉｎｔ．９６：１１２０、Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２
００４）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１７１：１３４８）。マウス抗ヒトα平滑筋アクチン、デスミン
、ミオシン、およびＡＥ１／ＡＥ３を一次抗体として使用し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ
抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用した。タンパク質バンドの存在を市販の高感度ケミ
ルミネッセンスアッセイキットによって検出した。

移植組織中、尿中前駆細胞は、埋め込みから１か月後にＬａｃＺで染色された。埋め込
まれた細胞はヒトＸ／Ｙ染色体によっても確認した。好都合には、尿中前駆細胞は、イン
ビボで、多層尿路上皮細胞および平滑筋様組織構造を足場中に形成した（図５）。さらに
、埋め込みから３か月後に移植組織中に腫瘍は見られなかった。

したがって、これらのデータは、尿から得られた細胞が、膀胱組織工学の供給源として
機能できるというインビトロおよびインビボでの証拠となっている。尿中前駆細胞は、容
易に利用可能であり、インビトロで増殖して尿路上皮および平滑筋に分化することが示さ
れている。尿中前駆細胞由来の膀胱細胞は、それぞれ尿路上皮特異的タンパク質および平
滑筋特異的タンパク質の発現などの尿路上皮様および平滑筋様の表現型を示す。コラーゲ
ンマトリックスは、尿中前駆細胞の三次元増殖を補助し、このことは膀胱再建に対する基
本的な要求である。インビボで尿中前駆細胞を播種した足場によって、膀胱再建の費用対
効果の大きい方法が得られる。

以上は本発明の例であり、本発明を限定するものと解釈すべきではない。本発明は、以
下の特許請求の範囲により規定され、請求項の同等物も本発明の範囲に含まれる。

Claims (30)

1. 尿中前駆細胞の培養物を生産する方法であって、
   尿サンプルを提供するステップと、続いて
   尿中前駆細胞を前記尿サンプルから分離するステップと
   を含む、方法。
2. 前記分離ステップが、
   （ａ）細胞を尿サンプルから収集して粗細胞サンプルを得るステップと、
   （ｂ）尿中前駆細胞を前記粗細胞サンプルから選別するステップと
   によって行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記収集ステップが、前記尿サンプルの遠心分離によって行われる、請求項２に記載の
   方法。
4. 前記選別ステップが、細胞選択培地を含む組成物中に前記細胞を配置することによって
   行われる、請求項２に記載の方法。
5. 前記選別ステップが、形態学に基づいて対象の細胞を選別することによって行われる、
   請求項２に記載の方法。
6. 前記選別ステップが、尿中前駆細胞に特異的なマーカーを選別することによって行われ
   る、請求項２に記載の方法。
7. 前記選別ステップが、尿中前駆細胞に特異的なマーカーを選別することによって行われ
   、前記マーカーの選別がＦＡＣＳによって行われる、請求項２に記載の方法。
8. 前記マーカーが、Ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、
   ＣＤ９０、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４からなる群より選択される、請求項６または７に
   記載の方法。
9. 前記尿中前駆細胞が哺乳動物被験体から得られる、請求項１〜８のいずれか一項に記載
   の方法。
10. 請求項１〜９に記載の方法によって産生された分離細胞。
11. 前記尿中前駆細胞を、尿路上皮細胞および平滑筋細胞からなる群の少なくとも１つに分
    化させるステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
12. 分離された尿中前駆細胞であって、ｃ−ｋｉｔ陽性であり、尿路上皮細胞、平滑筋細胞
    、内皮細胞、および間質細胞からなる群より選択される２つ以上の系譜に分化可能できる
    、細胞。
13. 播種された組織足場を提供する方法であって、前記方法が、
    請求項１０に記載の分離尿中前駆細胞を提供するステップと、
    前記尿中前駆細胞を、尿路上皮細胞および平滑筋細胞からなる群の少なくとも１つに分
    化させて、分化した細胞を産生するステップと、
    前記分化した細胞を生分解性組織足場上に播種するステップと
    を含む、方法。
14. 前記組織足場がコラーゲンマトリックスを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記組織足場が合成ポリマーを含む、請求項１３に記載の方法。
16. 前記組織足場が、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、および乳酸グリ
    コール酸共重合体（ＰＬＧＡ）からなる群より選択される合成ポリマーを含む、請求項１
    ３に記載の方法。
17. 生分解性組織足場と尿中前駆細胞とを含む、播種された組織足場。
18. 前記尿中前駆細胞が分化しているまたは未分化である、請求項１７に記載の播種された
    組織足場。
19. 前記尿中前駆細胞が、尿路上皮細胞、平滑筋細胞、間質細胞、および上皮細胞からなる
    群より選択される細胞に分化する、請求項１７に記載の播種された組織足場。
20. 前記生分解性組織足場がコラーゲンマトリックスを含む、請求項１７〜１９のいずれか
    一項に記載の播種された組織足場。
21. 前記生分解性組織足場が合成ポリマーを含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載
    の播種された組織足場。
22. 前記生分解性組織足場が、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、および
    乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）からなる群より選択される合成ポリマーを含む、
    請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の播種された組織足場。
23. 治療を必要とする被験体の治療方法であって、
    膀胱組織基質を提供するステップであって、ここで、前記基質は尿中前駆細胞を含み、
    前記尿中前駆細胞を、尿路上皮細胞および平滑筋細胞からなる群の少なくとも１つに分
    化させて、分化した細胞を産生するステップと、
    前記分化した細胞を生体適合性基質に播種するステップと、
    前記基質を前記患者の体内に移植するステップと
    を含む、方法。
24. 前記基質がコラーゲンマトリックスを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記基質が合成ポリマーを含む、請求項２３に記載の方法。
26. 前記基質が、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、および乳酸グリコー
    ル酸共重合体（ＰＬＧＡ）からなる群より選択される合成ポリマーを含む、請求項２３に
    記載の方法。
27. 尿サンプルの輸送に適した容器と、
    培地と、
    １種類以上の抗生物質と、
    前記容器、培地、および抗生物質を保持するための包装材料と、
    場合により、使用説明書と
    を含む、キット。
28. 冷却手段をさらに含む、請求項２７に記載のキット。
29. アルコール消毒綿をさらに含む、請求項２７または２８に記載のキット。
30. 前記容器が滅菌されている、請求項２７、２８または２９に記載のキット。

Images