JP4915722B2

JP4915722B2 - 腎臓幹／前駆細胞の分離方法

Info

Publication number: JP4915722B2
Application number: JP2006027360A
Authority: JP
Inventors: 健菅谷; 尚史篠崎; 伸一大島
Original assignee: 株式会社バイオリンクインク
Priority date: 2006-02-03
Filing date: 2006-02-03
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2026-02-03
Also published as: JP2007202512A

Description

本発明は、ヒトの腎臓幹／前駆細胞の分離方法に関する。

近年、慢性腎不全の患者数が増加している。慢性腎不全は、腎臓における疾病又は腎臓以外の器官における疾病が原因で生じた腎臓障害が進行した病態であり、血液中に含有される尿毒素を除去する機能、内分泌機能、調節機能など、正常な腎臓が有する機能が廃絶する。

慢性腎不全が進行すると、正常な腎臓が有する機能が廃絶するために、体内の各臓器に影響が及び、尿毒症となる。具体的には、中枢神経障害、末梢神経障害、心・循環器障害、消化器障害、視力・眼障害、血液・凝固障害、免疫障害、内分泌障害、皮膚障害、骨・関節障害、電解質障害、酸塩基平衡障害などになる。

慢性腎不全は、腎臓移植が現存する唯一の根治療法であるが、ドナー不足のため全ての慢性腎不全患者に移植を施すことは不可能である。このため、慢性腎不全患者は生存のためには人工透析を余儀なくされ、この透析患者の増大が医療費の増大を招き、大きな社会問題にもなっている。また、人工透析は、技術の進歩によって患者への負担は以前よりも軽減されてきているものの、腎臓移植を受けて根治した患者と比べると、その生活の質（ＱＯＬ）においては格段の差がある。

Poulsom R. et al.,"Bone marrow cells contribute to both normal turnover of renal epithelia and regeneration after damage.", J. Pathol., 195, pp.229-235, 2001 Bussolati B. et al.,"CD133+ cells from kidney represent a multipotent adult resident stem cell population that may contribute to the repair of renal injury.", Am. J. Pathol., 166, pp.545-555, 2005

ところで、近年、幹／前駆細胞を用いて組織や臓器をin vitro又はin vivoで形成することで病変や欠損を治療する、いわゆる再生医療が注目を集めている。このような流れの中で、骨髄中や腎臓に腎臓幹／前駆細胞が存在することが明らかにされている（非特許文献１，２を参照）。

そこで、この腎臓幹／前駆細胞を分離・取得して再生医療に応用することが考えられるが、骨髄中や腎臓から腎臓幹／前駆細胞を分離するのは、生体に対する負担が大きく、すなわち侵襲性が高いという問題があった。

本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、ヒトの腎臓幹／前駆細胞を非侵襲的に分離する方法を提供することを目的とする。

本件発明者等は、上述した目的を達成するために、様々な観点から鋭意研究を重ねてきた。その結果、腎機能が低下している腎疾患患者の尿中に落下している尿中落下細胞から腎臓幹／前駆細胞を分離・取得できることを見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。

すなわち、本発明に係る腎臓幹／前駆細胞の分離方法は、腎疾患患者の尿中に含まれる細胞の初代培養細胞をヘキスト３３３４２で染色したときの弱陽性又は陰性画分を分離することを特徴とする。

従来、腎疾患の指標としては、血中クレアチニン、シスタチンＣ、ＢＵＮ（blood urea nitrogen；血中尿素窒素）などが知られているが、近年、尿や血液に含まれる脂肪酸結合タンパク質（fatty acid binding protein；ＦＡＢＰ）のうち、肝型の分子種（以下、Ｌ−ＦＡＢＰという。）が、腎臓では近位尿細管に特異的に発現しており、腎疾患の指標となり得ることが報告されている（特許第３２５９７５８号公報を参照）。すなわち、尿中Ｌ−ＦＡＢＰ値の正常上限は１０ｎｇ／ｍｌ程度であるが、腎疾患患者では例えば５０ｎｇ／ｍｌ以上など、高値を示すため、腎疾患の指標として用いることができる。特に、尿中Ｌ−ＦＡＢＰ値とヘキスト３３３４２弱陽性／陰性画分の割合とが正に相関することが本件発明者によって確認されているため、本発明においては、このＬ−ＦＡＢＰを指標として腎疾患患者を選ぶことが好ましい。

なお、本発明における腎疾患患者には、生体腎移植手術直後の患者や腎機能が未熟な新生児も含まれるものとする。

このような生体腎移植手術直後の患者や腎機能が未熟な新生児も、尿中のＬ−ＦＡＢＰが高値（例えば、１００ｎｇ／ｍｌ以上）を示すため、この指標を用いて尿中から腎臓幹／前駆細胞を効率的に分離することができる。

また、本発明に係る腎臓幹／前駆細胞は、上述の分離方法によって分離されたことを特徴とし、本発明に係る腎疾患治療剤は、上述の分離方法によって分離された腎臓幹／前駆細胞を含むことを特徴とする。

本発明によれば、腎疾患患者から非侵襲的に腎臓幹／前駆細胞を分離することができる。

以下、本発明を適用した実施の形態について、具体的な実験結果を参照しながら詳細に説明する。

尿中落下細胞の培養
先ず、腎疾患患者の尿中から尿中落下細胞を分離し、培養した。

詳細には、生体腎移植手術直後の患者の尿１０ｍｌを４℃、１１００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離し、上清を除去した後、１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）（MBL）を含有するＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）（Sigma）１０ｍｌで懸濁し、再度遠心分離して上清を除去して細胞を分離した。さらに、この懸濁、遠心分離、上清除去による細胞洗浄の操作を４回繰り返した。このようにして分離された細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Sigma）に終濃度として５ｍｇ／ｍｌインスリン、５ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、２．５ｍｇ／ｍｌニコチナマイド、１０^−８Ｍデキサメタゾン（以上、全てSigma）を添加した培地と、マウス間葉系細胞（独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターに寄託、受領番号FERM AP-20769）を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで約２４時間培養した際の培養上清とを１：１で混合した培地１０ｍｌで懸濁し、ゼラチンコーティングを行った細胞培養皿（BD FALCON）にて培養した。

細胞を経時的に顕微鏡観察した結果を図１に示す。図１（Ａ）〜（Ｅ）は、それぞれ３日、４日、６日、８日、１５日経過後の細胞を示したものである。細胞は培養開始後２４時間以内に培養皿上に生着し、以後１２〜２４時間毎に細胞分裂を行い、培養開始から２週間後には約５×１０^６個程度の細胞数にまで増殖した。このことから、この培養方法により、増殖能を有する細胞が得られることが確認された。

また、これらの増殖能を有する細胞群の中には、敷石上形態を示す尿細管上皮細胞様の細胞からなるコロニーが観察され、図２に示すように、経上皮輸送能を示唆する細胞ドームの形成も確認された。

これらの結果より、生体腎移植手術直後の患者の尿から分離した尿中落下細胞を培養することにより、尿細管細胞様の細胞を取得、培養可能であることが示された。

尿中落下細胞の遺伝子発現解析
次に、分離した尿中落下細胞における遺伝子発現を確認した。

詳細には、上述のようにして初代培養を５週間続けた細胞１．５×１０^６個に、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）１ｍｌを加えて懸濁し、さらに０．２ｍｌのクロロホルムを加えてよく混合した後、４℃、１２０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離した。そして、上清に０．５ｍｌのイソプロパノールを加えてよく混合してから、４℃、１２０００ｒｐｍの条件で２０分間遠心分離し、上清を除去してから１ｍｌの７５％エタノールで洗浄した後、風乾させた。このようにして得られたtotal ＲＮＡをサンプルとして、遺伝子チップ（Human Genome U133 Plus 2.0 Array Gene Chip、Affymetrix）を用いて遺伝子発現解析を行った。確認した遺伝子と、その陽性／陰性の別を以下の表１に示す。

表１から分かるように、尿中落下細胞においては、アクアポリン１、Ｎａ^＋／Ｃｌ⁻共輸送体（ＫＣＣ３ａ）、Ｎ−カドヘリンなど、近位尿細管特異的な遺伝子の発現が確認された。また、近位尿細管及びヘンレループで発現するＮａ^＋／ＨＣＯ_３ ⁻共輸送体（ＳＬＣ４Ａ４）、Ｋ−カドヘリン、ヘンレループ及び遠位尿細管で発現するＮａ^＋／ＨＣＯ_３ ⁻共輸送体（ＳＬＣ４Ａ７）、遠位尿細管で特異的に発現するカルビンジンＤ２８Ｋなどの遺伝子発現も確認された。その一方で、ネフリンやＰ−カドヘリンなどの腎小体特異的な遺伝子や、アクアポリン２やＮａ^＋／ＨＣＯ_３ ⁻共輸送体（ＳＬＣ４Ａ１）などの集合管特異的な遺伝子の発現は確認されなかった。また、胎児における発生期の腎臓で発現するＰａｘ２やＰａｘ８などの遺伝子の発現が確認された。

これらの結果から、尿中落下細胞の初代培養細胞中には、発生期の腎臓に存在する腎臓幹／前駆細胞のような未分化細胞や、近位尿細管＞ヘンレループ＞遠位尿細管と続く腎ネフロンの尿細管細胞様に分化した細胞が存在することが示唆された。

尿中落下細胞からの腎臓幹／前駆細胞の分離
ＤＮＡ結合色素であるヘキスト３３３４２（Hoechst33342）は、紫外線レーザー光で励起すると４００〜６００ｎｍ以上に亘る広範囲の蛍光を発することが知られており、多種の細胞が混ざったヘテロな細胞集団、例えば骨髄細胞等をこの色素で染色した後にフローサイトメトリーを用いて４５０ｎｍ前後の青色蛍光と６７５ｎｍ前後の赤色蛍光とで二次元に展開すると、通常の細胞周期解析で見られるＧ０／Ｇ１期の細胞よりもさらに蛍光の暗い部分に特異なパターンを持つヘキスト３３３４２弱陽性又は陰性の細胞集団が現れる。この細胞集団は、残りの大部分の細胞が属する主集団（メインポピュレーション)から突出した展開パターンを示すため、サイドポピュレーション（side population；SP）細胞と呼ばれる。

骨髄細胞においては、このＳＰ細胞中に造血幹細胞が濃縮されていることが知られている（文献「Goodell M. A. et al., J. Exp. Med., vol.183, p.1797, 1996」等を参照）。また、骨髄以外に、脳や骨格筋、心臓、肝臓、腎臓などの組織中でもＳＰ細胞が見つかっており（文献「Murayama A. et al., J. Neurosci. Res., vol.69, p.837, 2002」、文献「Gussoni E. et al., Nature, vol.401, p.390, 1999」、文献「Hierlihy A. M. et al., FEBS Lett., Vol.530, p.239, 2002」、文献「Asakura A. et al., Exp. Hematol., vol.30, p.1339, 2002」、文献「Iwatani H. et al., Kidney Int., vol.65, p.1604, 2004」等を参照）、これらの細胞でも組織幹細胞として機能している可能性がある。

なお、ＳＰ細胞では、ＡＢＣトランスポーターであるＭＤＲ（multi drug resistance gene）がコードするタンパク質を代表とするポンプ状の分子によってヘキスト３３３４２が細胞外に排出される結果、ヘキスト３３３４２によって余り染色されないと考えられている。幹／前駆細胞は、ＭＤＲの発現が活発なため、ヘキスト３３３４２の排出能は幹／前駆細胞に共通の性質であることも示唆されている（実験医学、Vol.19, No.15（増刊）,p.68-73, 2001）。このＳＰ細胞画分は、ＭＤＲ分子の機能阻害剤であるベラパミルやレセルピンを添加すると完全に消失する（第１１７回日本医学会シンポジウム記録集、p.66-74）。

以上のような背景から、尿中落下細胞においても同様にＳＰ細胞が存在し、腎臓幹／前駆細胞として機能している可能性が考えられるため、尿中落下細胞からのＳＰ細胞の分離を試みた。

詳細には、上述のように初代培養を３週間続けた尿中落下細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Invitrogen）を用いて培養皿から剥がし、１×１０^６個／ｍｌとなるように２％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに懸濁したものを２本調製した。そして、各サンプルにヘキスト３３３４２（Morecular Probe）を５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、一方のサンプルのみにレセルピン（Sigma）を１ｍｇ／ｍｌとなるように添加して陰性コントロールとした。その後、細胞を３７℃で１時間、振盪培養した後、遠心分離して上清を除去し、上清除去後の細胞を、死細胞を選別する目的でＰＩ（propidium iodide）を１ｍｇ／ｍｌとなるように添加した、２％ＦＢＳ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（Invitrogen）、１０^２Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（Invitrogen）を含有するＨＢＳＳ（Hank's Balanced Salt Solution）で懸濁し、蛍光活性化セルソーター（BD FACSAria、Beckton Dickinson）を用いてＳＰ細胞の解析、分離を行った。

ＳＰ細胞の解析結果を図３に示す。図３（Ａ）はレセルピンを添加していないサンプルを示し、図３（Ｂ）はレセルピンを添加した陰性コントロールのサンプルを示す。図中、実線で囲んだ領域がヘキスト３３３４２弱陽性又は陰性画分である。この画分は、レセルピンを添加した陰性コントロールでは完全に消失しているため、この画分がＳＰ細胞画分であることが確認された。なお、尿中落下細胞中には平均で０．３３％（ｎ＝６）のＳＰ細胞が存在した。

このＳＰ細胞を分離・取得した後、初代培養時と同じ方法で培養を行った。細胞を経時的に顕微鏡観察した結果を図４に示す。図４（Ａ）〜（Ｆ）は、それぞれ１２時間、３日、１０日、１５日、１９日、２２日経過後の細胞を示したものである。培養を行うと、高増殖能を持ち、且つ近位尿細管上皮細胞様の敷石状形態を有する上皮性細胞コロニーが得られ、さらに培養を続けたところ、２２日経過後には細胞ドームの形成が確認された。一方、ＳＰ細胞画分以外の細胞を同様の方法で培養しても、細胞ドームの形成は確認されなかった。

これらの結果から、初代培養した尿中落下細胞からヘキスト３３３４２弱陽性又は陰性のＳＰ細胞を分離することにより、尿細管上皮細胞に分化し得る腎臓幹／前駆細胞を分離・取得できることが示された。

尿中落下細胞からの腎臓幹／前駆細胞分離の効率化
次に、尿中落下細胞からの腎臓幹／前駆細胞の分離効率化を検討するため、近年、腎疾患の指標となり得ることが報告された尿中Ｌ−ＦＡＢＰ値と、初代培養の培養効率との関係を検討した。

詳細には、腎機能の未熟な新生児を含む２３９例の患者由来の新鮮尿から分離された尿中落下細胞を上述と同様に初代培養し、その培養効率を尿中Ｌ−ＦＡＢＰ値と比較した。培養１週間の時点で上皮様細胞のコロニー形成を認め、且つ３週間まで増殖の見られたものを初代培養成功例とした。尿中Ｌ−ＦＡＢＰ値によりその培養効率を比較したところ、１群：Ｌ−ＦＡＢＰ＜１００ｎｇ／ｍｌで１５％、２群：１００＜Ｌ−ＦＡＢＰ＜１０００ｎｇ／ｍｌで２２％、３群：１０００＜Ｌ−ＦＡＢＰ＜１００００ｎｇ／ｍｌで３５％、４群：Ｌ−ＦＡＢＰ＞１００００ｎｇ／ｍｌで１００％となった。

初代培養細胞は、アルカリホスファターゼ染色陽性を示し、経上皮輸送能を示す細胞ドームの形成が確認された。また、初代培養細胞からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を確認したところ、近位尿細管特異的アミノトランスポーターｒＢＡＴ（related to b0,+ system amino acid transporter）の発現が確認された。

これらの結果から、尿中Ｌ−ＦＡＢＰを指標にすることにより、その高値尿から効率的に尿細管細胞に分化し得る尿中落下細胞の初代培養が可能になることが示された。

さらに、尿中Ｌ−ＦＡＢＰ値と、ＳＰ細胞の分離効率との関係についても検討した。この結果、ＳＰ細胞の割合は、図５に示すように、初代培養時の尿中Ｌ−ＦＡＢＰ値と非常に高い相関（Ｒ＝０．８２）を示すことが明らかにされた。

このことは、腎疾患患者において尿中Ｌ−ＦＡＢＰ値が上昇している時期を特定し採尿することにより、腎臓幹／前駆細胞が取得できる可能性を示唆しており、非侵襲的且つ効率的なヒト腎細胞の樹立に大きく貢献する方法が見出されたものと考えられる。

腎臓幹／前駆細胞の腎臓への生着
次に、分離した腎臓幹／前駆細胞が成体腎臓に生着し、機能する形質を有しているか否かを確認するため、成体腎臓に障害を与え、腎臓が再生する過程においてこの細胞が生着するか否かを検討した。

詳細には、ヒト腎臓幹／前駆細胞を異種移植するレシピエントとして、拒絶反応を起しにくい実験的免疫不全マウス（２５ｇ）を使用し、両腎臓の腎動静脈を駆血し、３０分後虚血を解除し、虚血性急性腎不全モデルを作製した。分離したＳＰ細胞をさらに５週間培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Invitrogen）を用いて単一細胞にまで分散させた後、虚血解除した直後の腎皮膜下経路により注射器にて細胞移植を行った。そして、３日後に剖検して腎臓を摘出し、凍結切片を作成した。

ヒト特異的ＨＬＡ抗体（緑色蛍光標識）による免疫染色と、尿細管特異的アクアポリン１抗体（赤色蛍光標識）による免疫染色との２重染色を行った結果を図６に示す。図中、黄色を呈した部位は、移植細胞が尿細管様の管腔構造を形成した共陽性の部位である。虚血性急性腎不全モデルに異種移植を実施したにも拘わらず、生命予後の悪化は観察されなかった。

これらの結果から、分離した腎臓幹／前駆細胞は成体腎臓に生着し、尿細管特異的な機能を有するタンパクを発現する形質を有していることが示された。したがって、この腎臓幹／前駆細胞を含む腎疾患治療剤を腎疾患患者に移植することで、腎疾患を治療することができると考えられる。

以上、具体的な実験結果を参照しながら説明したように、本実施の形態の方法によれば、腎疾患患者から非侵襲的に効率よく腎臓幹／前駆細胞を分離し、分離した腎臓幹／前駆細胞を提供することができる。また、その腎臓幹／前駆細胞を含む腎疾患治療剤を提供することができる。特に、本実施の形態の方法では、腎疾患患者自身から腎臓幹／前駆細胞を分離することができるため、分離した腎臓幹／前駆細胞をその患者に移植することもでき、腎疾患に対するオーダーメイド医療の開発に応用することができると考えられる。さらに、分離した腎臓幹／前駆細胞を培養して得られたヒト尿細管細胞培養系は、in vitroでの薬剤スクリーニングにも使用することができる。

なお、本発明は上述した実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。

腎疾患患者から分離した尿中落下細胞を培養し、経時的に顕微鏡観察した結果を示す図である。尿中落下細胞を培養することにより形成される細胞ドームを示す図である。尿中落下細胞をヘキスト３３３４２で染色したときの弱陽性又は陰性画分を示す図である。分離したヘキスト３３３４２弱陽性又は陰性のＳＰ細胞を培養し、経時的に顕微鏡観察した結果を示す図である。尿中Ｌ−ＦＡＢＰ値とＳＰ細胞の分離割合との関係を示す図である。分離したＳＰ細胞の腎臓への生着を示す図である。

Claims

尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質が高値を示すヒト腎疾患患者の尿中に含まれる細胞の初代培養細胞をヘキスト３３３４２で染色し、その弱陽性又は陰性画分を分離することを特徴とする腎臓幹／前駆細胞の分離方法。
上記弱陽性又は陰性画分は、上記ヘキスト３３３４２と共にＭＤＲ（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ）分子の機能阻害剤を添加することにより消失する画分であることを特徴とする請求項１記載の腎臓幹／前駆細胞の分離方法。
初代培養の培地には、マウス間葉系細胞（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０８６５）の培養上清が含まれていることを特徴とする請求項１記載の腎臓幹／前駆細胞の分離方法。