KR20220047199A

KR20220047199A - 중간엽 줄기세포에서 분화된 골모세포 및 이를 포함하는 골질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220047199A
Application number: KR1020210134429A
Authority: KR
Inventors: 박현숙; 이연경; 고은진; 김하진; 이순례; 권아름
Original assignee: (주)세포바이오
Priority date: 2020-10-08
Filing date: 2021-10-08
Publication date: 2022-04-15
Also published as: JP2023521097A; US20230248776A1; CN115516081A; CA3202264A1; WO2022075809A1; EP4227404A1

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포를 골모세포로 분화시키는 방법, 상기 방법으로 분화된 골모세포를 포함하는 골질환 치료용 세포치료제 내지 이의 제조방법에 대한 것이다.
본 발명에 따른 분화방법은 중간엽 줄기세포를 골모세포로 안정적이고 신속하게 분화시킬 수 있다. 상기 분화된 골모세포는 혈관 형성능이 우수하고, 뼈 형성능이 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 줄기세포를 골모세포로 분화시키는 방법 내지 상기 방법으로 수득한 골모세포는 골 질환과 관련된 세포치료제 용도로서도 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포에서 분화된 골모세포 및 이를 포함하는 골질환 치료용 조성물 {Osteoblasts differentiated from mesenchymal stem cells and composition for treating bone diseases comprising thereof}

본 발명은 중간엽 줄기세포를 골모세포로 분화시키는 방법, 상기 방법으로 분화된 골모세포를 포함하는 골질환 치료용 세포치료제 내지 이의 제조방법에 대한 것이다.

줄기세포(Stem cell)는 각종 세포로 분화(differentiation)할 수 있는 다능성(pluripotent)을 가지고 있는 미분화 세포들을 총칭하며, 줄기세포는 특정 분화 인자 및/또는 환경에 의해 특정 세포로 분화될 수 있다. 줄기세포의 종류에는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 암줄기세포(cancer stem cell) 등이 있다. 최근에는 다양한 세포로 분화가 가능한 줄기세포를 이용하여 손상된 조직의 재생, 연골손상 질환, 당뇨병, 백혈병, 신경질환, 심장병, 척수외상 또는 섬유성 장애 등을 비롯한 다양한 질환을 치료하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있고, 이에 따라 줄기세포를 특정 세포로 분화시키고자 하는 연구들이 시도되고 있다. 또한 분화가 끝난 세포를 역분화를 통해 줄기세포로 만든 역분화줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPS) 등도 세포분화에 사용되고 있다. 특히, 중간엽 줄기세포(MSC, Mesenchymal Stem Cell)는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포로 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포이다. 이러한 능력으로 인하여 중간엽 줄기세포는 골질환, 조직 손상의 재생의료 분야에서 치료적 제제로서 가치있게 여겨지고 있다. 재생의학은 기존에는 회복이 불가능했던 조직이나 장기의 고유 회복 메커니즘을 활성화시키거나 또는 손상된 조직을 교체함으로써 손상된 부위를 재생시키는 것에 목적을 두고 있기 때문에, 신체가 스스로 치유할 수 없는 조직 또는 장기를 실험실에서 배양하고 이를 신체 내로 안전하게 이식하거나 주입하는 시도를 포함한다. 재생의료에 기반한 치료법으로서 난치성 질환에 대한 치료방법으로 줄기세포의 자기복제능력 및 분화능력을 이용한 줄기세포치료제가 차세대 치료제로서 각광을 받고 있다.

다만, 사용되는 줄기세포의 기원, 유래 부위, 배양 정도, 분화 정도 등 다양한 요인에 기인된 위험요소로 인하여 안전성 및 유효성에 대한 기준이 엄격하여 인허가에 어려움이 있다. 또한, 다양한 세포로 분화될 수 있는 다능성을 가진 줄기세포를 특정 세포로 분화시키고 상업적으로 사용하기 위해서는 대량생산이 필요하지만, 줄기세포에서 골세포로 신속하고 안전하게 분화시키는 것은 어려운 일이다.

줄기세포를 특정 세포로 분화시키는 방법에 대하여, 대한민국 특허 10-2016-0034541호에서는 졸겔 상전이를 이용하여 하이드로젤을 코팅한 다공성 막에서 줄기세포에서 골세포로 분화시키는 방법이 공개되어 있으며, 대한민국 특허 10-2018-0114307호에서는 중간엽 줄기세포의 분화를 촉진하기 위하여 배지에 헥사노일 글리콜 키토산을 함유하는 방법을 공개하고 있다. US 8,580,757 B2에서는 중간엽 줄기세포의 분화를 조정하는 방법으로서, miRNA 또는 siRNA를 이용하는 방법에 대하여 개시하고 있다. 이처럼, 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키기 위한 다양한 시도들이 이루어지고 있으나, 외부의 물질을 줄기세포에 투여함이 없으면서 분화배지에 값비싼 조성의 추가 없이 줄기세포에서 골세포를 신속하게 대량으로 분화시킬 수 있는 방법은 여전히 개발되지 않고 있는 상황이다.

그러나 골 관련 질환에 대한 세포치료제로서 활용할 수 있도록 골모세포를 줄기세포로부터 안정적이고 신속하게 분화 및 배양하는 방법에 대한 추가적인 연구는 여전히 요구되는 실정이다.

이에 본 발명자들은 골질환을 치료하기 위한 재생의료방법의 하나로서 중간엽 줄기세포에서 분화된 골세포 치료제를 제조하는 최적의 방법을 고민하면서 본 발명을 창출하였다. 본 발명자들은 골질환 치료용 세포치료제를 제조하기 위한 골모세포를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. 본 발명의 분화방법을 이용하는 경우 기존 세포치료제용 줄기세포를 분화시키는 방법에 비하여 골모세포로 안정적이고 신속하게 분화할 수 있으며, 상기 골모세포의 골재건 효능이 매우 우수한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 중간엽 줄기세포를 골모세포로 분화시키는 방법, 상기 방법으로 분화된 골모세포를 포함하는 골질환 치료용 세포치료제 내지 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 i) 공기투과성 폴리머 막을 계면활성제 버블로 코팅하는 단계;

ii) 상기 단계 i)의 버블에 중간엽 줄기세포를 1 × 10³ 내지 1 × 10⁵ 개/cm² 밀도로 접종하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)의 중간엽 줄기세포를 분화 배지에서 골모세포로 분화시키는 단계; 및

iv) 상기 단계 iii)에서 분화시킨 골모세포를 분리 및 수득하는 단계;

를 포함하는 중간엽 줄기세포를 골모세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 계면활성제는 폴록사머(poloxamer) 인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 버블은, 상기 공기투과성 폴리머 막 위에서 계면활성제를 넣고 움직여 버블을 발생시키는 단계; 를 포함하여 제조되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii)의 중간엽 줄기세포는, 탯줄, 제대혈, 태반, 양막, 골수, 지방, 모낭, 치아, 치수 및 피부진피로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에서 유래한 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 수득한 골모세포를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 골모세포는 커넥신 43(Connexin 43, CX43), 렁스2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2) 및 콜라겐 타입 1A(Collagen type 1A1, COL1A1)의 발현 수준이 미분화 줄기세포 및 성숙한 골세포에 비하여 높고; 안지오포이에틴(Angiopoietin 1, ANGPT1) 및 알칼라인포스파타아제(Alkaline Phosphatase, AP) 의 발현 수준이 미분화 줄기세포에 비하여 높으며; 오스테릭스(Osterix, OSX), 오스테오칼신(Osteocalcin, OCN) 및 오스테오폰틴(Osteopontin, OPN) 의 발현 수준이 성숙한 골세포에 비하여 낮은 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 골모세포는 Ki-67 의 발현 수준이 미분화 줄기세포에 비하여 낮은 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 수득한 골모세포를 포함하는 골질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 골 질환은 골절, 대퇴골두골괴사, 척추유합, 지연유합 또는 불유합, 골다공증, 골괴사증, 가관절증, 파제트병 및 골형성부전증 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 분화방법은 중간엽 줄기세포를 골모세포로 안정적이고 신속하게 분화시킬 수 있다. 상기 분화된 골모세포는 혈관 형성능이 우수하고, 뼈 형성능이 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 줄기세포를 골모세포로 분화시키는 방법 내지 상기 방법으로 수득한 골모세포는 골 질환과 관련된 세포치료제 용도로서도 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 탯줄 유래 골모세포를 분화 및 수득하는 공정을 나타낸다.
도 2은 폴록사머 버블 코팅 후 폴록사머 용액은 제거하고 다공성 막 위에 남아있는 폴록사머 버블이 유지 여부를 7시간(0H~7H) 동안 관찰한 결과를 나타낸다. 폴록사머 용액 제거 후 2시간 이후(2H)에 버블이 사라지는 것을 확인할 수 있었다.
도 3은 폴록사머 버블 코팅 후 QD 처리한 세포를 로딩한 것을 형광현미경 3D 이미지로 촬영한 결과를 나타낸다.
도 4은 계면활성제 종류별 세포독성 실험 결과를 나타낸다. CCK-8(cell counting kit-8) 1일차 결과 P407(폴록사머 407) 을 제외한 나머지 계면활성제(DIAPON K-SF 및 Tween-20)들은 세포에 독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
도 5는 계면활성제 종류별 세포독성 실험 결과를 나타낸다. CCK-8(cell counting kit-8) 1일에서 3일까지의 세포 증식을 확인한 결과 P407(폴록사머 407) 을 제외한 나머지 계면활성제(DIAPON K-SF 및 Tween-20)들은 세포 독성으로 세포가 증식하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
도 6는 계면활성제 종류별 세포독성 실험 결과를 나타낸다. CCK-8(cell counting kit-8) 1일차 결과 P407(폴록사머 407) 을 제외한 나머지 계면활성제(Methylprednisolone 및 Tween-20)들은 세포에 독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
도 7은 계면활성제 종류별 세포독성 실험 결과를 나타낸다. CCK-8(cell counting kit-8) 1일에서 3일까지의 세포 증식을 확인한 결과 P407(폴록사머 407) 을 제외한 나머지 계면활성제(Methylprednisolone 및 Tween-20)들은 세포 독성으로 세포가 증식하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
도 8는 미분화세포 또는 겔(Gel) 형태의 계면활성제에서 분화시킨 세포에 비하여 버블 형태(Bubble foam)의 계면활성제에서 분화시킨 세포의 유전자(COL1A) 발현 수준이 유의적으로 높은 것을 나타낸다.
도 9은 미분화세포 또는 겔(Gel) 형태의 계면활성제에서 분화시킨 세포에 비하여 버블 형태(Bubble foam)의 계면활성제에서 분화시킨 세포의 단백질(VEGF) 발현 수준이 유의적으로 높은 것을 나타낸다.
도 10은 미분화세포(RCB001, RCB002, RCB005) 대비 본 발명의 분화된 세포치료제(RCB001-DP1 ~ RCB005-DP5)의 골 유도 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타낸다. 미분화세포 대비 본 발명 세포치료제에서 분비되는 커넥신 43(Connexin 43, CX43) 및 렁스2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2) 의 발현 수준이 유의적으로 증가된 것을 확인할 수 있었다.
도 11는 미분화세포(RCB005) 대비 본 발명의 분화된 세포치료제(RCB005-DP1)의 골 유도 유전자의 발현수준을 골수유래 중간엽줄기세포(BM-MSC) 및 성숙한(mature) 골모세포(NHOst)와 비교한 결과를 나타낸다. 상기 골모세포는 초기 골모세포 마커인 커넥신 43(Connexin 43, CX43), 렁스2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2) 및 콜라겐 타입 1A(Collagen type 1A1, COL1A1) 의 발현 수준이 미분화세포 및 성숙된 골모세포 비하여 높고, 오스테릭스(Osterix, OSX), 오스테오칼신(Osteocalcin, OCN) 및 오스테오폰틴(Osteopontin, OPN) 의 발현 수준은 성숙한(mature) 골모세포(NHOst)에 비하여 낮은 것을 확인할 수 있었다.
도 12은 골형성 마커 단백질과 혈관유도 마커 단백질이 미분화세포 대비 본 발명의 분화된 골세포 치료제에서 증가한 것을 확인할 수 있었다. (A) 는 COL1A1, (B) 는 오스테오폰틴(OPN) 및 (C) 는 안지오포이에틴(Angiopoietin) 을 의미한다.
도 13 는 본 발명의 분화된 세포치료제가 해동 후 3일차 내지 7일차 후에도 골형성 마커 단백질과 혈관유도 마커 단백질이 유지되는 것을 나타낸다. (A) 는 COL1A1, (B) 는 오스테오폰틴(OPN) 및 (C) 는 안지오포이에틴(Angiopoietin) 을 의미한다.
도 14은 본 발명의 탯줄 유래 골모세포의 혈관내피 혈관 형성능을 나타낸다. 혈관 형성 유도 인자로 알려진 VEGF 양성대조군(Positive Control) 만큼 탯줄유래의 원료세포(Undifferentiation UCMSC) 및 골분화 세포치료제(Osteogenic differentiation)에 의한 혈관 생성이 유도되는 것을 확인할 수 있으며, 특히 세포치료제에 의해 분비된 단백질에 의해 형성된 혈관은 더 두껍고 튼튼하게 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
도 15a 및 도 15b는 본 발명 세포치료제의 대동물(염소)에 대한 유효성 결과를 나타낸다.
도 16는 본 발명 세포치료제의 소동물(랫드)에 대한 유효성 결과를 나타낸다.
도 17a 및 도 17b는 중간엽 줄기세포에서 골세포로의 분화 단계를 나타낸다. 점선으로 표시한 영역이 본 발명의 세포치료제의 단계를 의미한다.
도 18은 미분화 UCMSC(원료)와 분화한 골모세포(DP)의 2 배치에서 세포분열능을 Ki-67(세포분열의 지표)으로 확인한 결과를 나타낸다. 일관되게 Ki-67발현이 DP에서 1% 이하로 급격하게 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 CF-M801이 골모세포 모델의 초기 단계의 골모세포임을 의미한다.
도 19a 및 도 19b는 미분화 줄기세포 BMMSC, UCMSC(원료)와 분화한 골모세포(DP)의 2 배치를 이용하여 CFU-F를 측정한 결과를 나타낸다. 분화한 골모세포(DP, CF-M801)는 Ki-67(세포분열의 지표) 발현과 유사한 패턴으로 CFU-F이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
도 20는 미분화 줄기세포 UCMSC(원료)와 분화한 골모세포(DP)의 2 배치를 이용하여 콜로니 형성 후 알칼리인산분해효소(Alkaline phosphatase) 염색하여 흡광도를 측정한 결과를 나타낸다. 분화한 골모세포(DP)가 만든 콜로니는 미분화세포에 비해 알칼리인산분해효소가 염색되고 그 흡광도 값이 증가한것으로 보아 본 세포치료제가 증식하여 만든 콜로니는 골모세포인 것을 확인할 수 있었다.
도 21a 및 도 21b 는 본 발명의 분화시킨 골모세포(DP1 ~ DP3)는 CD10을 80% 이상 발현하는 반면 미분화 중간엽줄기세포는 CD10을 15% 이하로 발현한다. 이는 본 발명의 골모세포는 기존의 줄기세포 표지인자가 아닌 골모세포 특이적인 표지인자를 확인하여 순도 확인 관리하고 있음을 의미하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 “중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)”는 다능성(multipotent) 미분화 세포와 같은 의미로 사용되는데, 지방세포, 골모세포, 연골세포, 심장세포 또는 근육세포를 포함한 여러가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 성체줄기세포를 의미한다. 또한, 배아줄기세포에 일반적으로 문제가 되는 암(cancer)화나 윤리적인 문제에서 자유로울뿐 아니라 이식 후에도 면역 거부 반응을 일으키지 않을 수 있다.

본 발명의 “골모세포(osteoblast)”는 척추동물들의 골세포(osteocyte)를 만드는 세포로서 조골세포라고도 한다. 골 기질을 합성 및 분비하여 뼈를 만들기도 하며, 자신이 만든 골조직 속에 묻혀 스스로 일반 골세포가 되기도 한다. 그 외에 뼈에 필요한 Ca, Mg 이온 등의 물질을 뼈에 침착시켜 골조직을 석회화시킬 수 있다. 내부 물질의 차이와 활성에 따라 휴지기와 형성기가 나뉘며, 분열 능력이 크지만 오래된 뼈에서는 그 수가 감소한다.

본 발명의 "골 질환(bone disease)" 은 골(bone, 骨, 뼈)에 손상이 생겨서 뼈의 구성 및 밀도가 변화하고 골절이 일어나기 쉬운 상태를 의미한다. 골은 골격계의 안정성을 유지하는 신체내 가장 단단한 조직으로서, 근육의 지렛대로 사용되고 내부의 장기를 보호할 뿐 아니라 칼슘, 마그네슘과 같은 미네랄을 저장하는 역할을 한다. 이러한 골 질환은 대부분 골절과 같은 외상, 또는 무혈성 괴사, 골다공증과 같은 대사성 질환에 의하여 발생하며, 원인과 관계없이 신체의 기계적 지지에 문제가 생겨 운동능이 저하될 뿐만 아니라 기관절의 형성 등으로 지속적 통증을 유발한다. 본 명세서에서 골 질환은 골다공증, 골괴사증, 가관절증, 파제트병 또는 골형성부전증을 포함한다.

상기 "골다공증(osteoporosis)" 은 골의 양이 감소하고 질적인 변화로 인해 골의 강도가 약해져서 골절이 일어날 가능성이 높은 상태를 의미하며, 주로 유전, 조기폐경, 과도한 식이요법 또는 스테로이드 약제 등이 주원인이 된다.

상기 “골괴사증”은 뼈에 혈액 공급이 되지 않아 뼈조직이 죽어 가는 질환이다. 신체의 어디서든 발생할 수 있지만, 주로 대퇴부(허벅지 뼈) 위쪽, 팔 위쪽, 어깨, 무릎 또는 척추 등에서 발생한다.

상기 “가관절증”은 가관절 이라고도 하며 뼈가 부러진 후 그 부위가 잘 붙지 않아(불유합) 마치 관절처럼 움직이는 것을 말한다. 골절 후 치료하는 과정에서 잘못되거나 골절부위의 세균 감염이 원인이 되어 생길 수 있다.

상기 “파제트병”은 뼈가 새로 생기고 성장하며, 흡수되는 과정인 골 재형성(bone remodeling)이 과도하게 나타나면서 다양한 부위의 골격계가 침범되는 국소성 골 질환이다. 주로 골반, 대퇴부 또는 두개골에서 발생한다.

상기 “골형성부전증”은 선천적으로 뼈가 약해서 특별한 원인 없이 뼈가 쉽게 부러지는 증상을 총칭하며, 골이형성증 이라고도 한다.

본 발명의 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

본 발명의 “세포치료제(cell therapeutic agent)”는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작으로 제조된 세포 및 조직을 치료, 진단 또는 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 사용될 수 있다.

상기 기재한 바와 같이, 기존 줄기세포를 이용한 세포치료제는 높은 단가 등의 문제로 인해 대중적으로 상용화되기 어려웠으며, 특히 줄기세포를 골모세포로 분화시키는데에 시간과 비용이 많이 소요된다는 등의 단점이 존재하였다.

반면에, 본 발명에 따른 분화방법은 계대배양 초기의 줄기세포를 골모세포로 단기간에 안정적이고 신속하게 분화시킬 수 있다. 기존 줄기세포 분화방법은 8회 이상 계대배양된 줄기세포를 약 20일 이상 분화시켜야 골모세포를 수득할 수 있었던 반면, 본 발명에서는 5회 계대배양된 줄기세포를 약 3일만 분화시키면 분화한 골모세포를 수득할 수 있다(도 1). 특히, 본 발명의 분화방법을 이용하는 경우 줄기세포의 출처(donor)에 따른 반응 편차(variation) 없이 모두 골모세포로 분화할 수 있으므로 동종 세포치료제로서 활용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 i) 공기투과성 폴리머 막을 계면활성제 버블로 코팅하는 단계;

를 포함하는 중간엽 줄기세포를 골모세포로 분화시키는 방법 내지 상기 방법으로 분화된 골모세포를 제공할 수 있다.

상기 단계 i)의 폴리머 막은 하이퍼 플라스크의 다공성 막일 수 있다.

상기 단계 ii)의 밀도는 바람직하게 1 × 10³ 내지 1 × 10⁵ 개/cm² 일 수 있고, 보다 바람직하게는 1 × 10⁴ 개/cm² 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 계면활성제는 폴록사머(poloxamer)인 것일 수 있다. 폴록사머 이외의 다른 계면활성제는 세포독성을 띄어(실시예 4) 본 발명에 적합하지 않다. 상기 폴록사머는 폴록사머184, 폴록사머185, 폴록사머188, 폴록사머124, 폴록사머237, 폴록사머338 및 폴록사머407 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상 인 것일 수 있다.

상기 단계 i)의 계면활성제는 최대 10 % 계면활성제인 것일 수 있다.

상기 단계 i)의 버블은, 상기 공기투과성 폴리머 막 위에서 계면활성제를 넣고 움직여 발생되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 단계 i)의 버블은, 상기 공기투과성 폴리머 막 위에서 계면활성제를 흔들어 발생되거나, 파이펫팅을 통하여 발생되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii)의 중간엽 줄기세포는 탯줄, 제대혈, 태반, 양막, 골수, 지방, 모낭, 치아, 치수 및 피부진피로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에서 유래한 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 단계 ii)의 중간엽 줄기세포는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.

상기 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 경우 출산 후 폐기되는 탯줄조직을 이용함으로써, 채취가 용이하고 다량의 줄기 세포를 손쉽게 확보 가능하다는 장점이 있다. 지방이나 골수 유래 줄기세포는 분리, 추출되는 공여자의 나이나 건강상태 등에 영향을 받아 증식력이나 분화능 등에 제한이 있고 변동성이 많지만, 탯줄 유래 줄기세포의 경우 성체 줄기세포 중 가장 이른 시기에 수득할 수 있는 줄기세포로서 공여자의 나이 등의 변수에 따라 줄기세포능에 영향을 거의 받지 않으며 뛰어난 증식력 및 분화능을 가진다. 또한, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포는 신경계 질환, 간 질환, 근골격계 질환 등 다양한 질환에 활용 가능한 줄기세포군을 분리할 수 있다는 장점이 있다.

상기 단계 ii) 에서 중간엽 줄기세포를 버블에 접종하는 것은, 공기투과성 폴리머 막을 계면활성제 버블로 코팅한 후 최소 2시간 이상 경과하여 버블이 소멸하기 시작한 때에 접종하는 것일 수 있다.

상기 단계 ii)의 중간엽 줄기세포는 5 내지 8 계대배양한 줄기세포인 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 5 내지 6 계대배양한 줄기세포인 것일 수 있다.

상기 단계 ii) 에서 접종된 중간엽 줄기세포는 분화 배지에서 골모세포로 분화되기 전 α-MEM, DMEM 및 FBS 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있는 배양액에서 12시간 내지 48시간 동안 배양하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 배양액에서 20 시간 내지 30 시간 배양하는 것일 수 있다.

상기 단계 iii)의 분화는 24시간 내지 120 시간 동안 분화시키는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 60 시간 내지 80 시간 동안 분화시키는 것일 수 있다.

본 발명의 골모세포는 초기골모세포에서 발현되는 커넥신 43(Connexin 43, CX43), 렁스2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2), 콜라겐 타입 1A(Collagen type 1A1, COL1A1) 및 알칼라인포스파타아제(Alkaline Phosphatase, AP)의 발현이 미분화 줄기세포에 비하여 현저하게 높고, 세포증식의 표지자인 Ki-67의 발현이 미분화보다 감소하기는 하나 발현이 되며, 콜로니를 형성하는 것으로 세포증식이 일어나는 초기 골모세포임을 알 수 있다. 이에 비하여 충분히 성숙한 골세포로 가면서 발현이 증가하는 오스테릭스(Osterix, OSX), 오스테오칼신(Osteocalcin, OCN) 및 오스테오폰틴(Osteopontin, OPN) 의 발현 수준은 성숙한 골세포(NHOst)에 비하여 낮았다. 아울러 초기 골모세포에서 뚜렷이 발현되는 안지오포이에틴(Angiopoietin 1, ANGPT1)의 발현도 유전자 및 단백질의 발현이 수 백배 이상 증가하여 초기 골모세포의 특성을 분명하게 나타내고 있었다(표 1).

	Ki-67	AP	ANGPT1	RUNX2	CX43	COL1A	OSX	OPN	OCN
MSC	+++	+	+	+	+	+	-	+	+
OB	+	+++	+++	++++	++++	++++	+++	++	++
LONZA	(-)	(+)	(+)	++	++	++	+++	+++	+++

상기 CX43은 GJA1 유전자에 의해 암호화되며, 연골세포, 조골세포, 골세포 또는 파골세포 등 뼈 세포 유형에서 발현되는 가장 보편적인 간극 접합 단백질이다. CX43 은 다양한 뼈 세포 유형 간의 신호 전달을 조절하는 데 중요한 역할을 하여 뼈의 발달, 분화, 모델링 및 리모델링뿐만 아니라 병리를 조절한다. 특히, CX43 은 조골세포의 생존, 증식 및 분화에 필요하며 다양한 골형성 마커의 발현을 향상시킬 수 있다.

상기 RUNX2 는 골세포 분화의 주요 조절자로서, 조골세포 분화의 초기 표현형질인 알칼라인포스파테이즈(ALP)와 후기 표현형질인 오스테오칼신(Osteocalcin, OCN)의 발현을 조절하는 중요한 전사인자이다. 초기단계의 골모세포(osteo-progeniotrs, immature osteoblasts)는 RUNX2+이며 증식능을 갖추고, 성숙한 골세포로 분화하며 무기질화(mineralization) 과정이 더욱 진행된다. 골모세포는 일정시기 동안은 세포분열이 멈추지 않는 상태로 있으며 분화가 진행되면서 분열능을 점차 잃고 골세포로 분화하게 된다(도 17a 및 도 17b).

상기 콜라겐 타입 1A(COL1A1) 는 골모세포로 분화시 특징적으로 발현되는 골 형성 마커이다.

상기 오스테릭스(OSX) 는 골세포 형성과 관련된 분화인자에 해당한다. OSX 는 COL1A1 프로모터 활성을 높임으로써 뼈 매트리스의 발현을 증가시켜 조골 모세포가 성숙한 조골세포로 분화하는데 중요한 역할을 한다.

상기 오스테오칼신(OCN) 은 골세포 형성과 관련된 분화인자에 해당한다. OCN 은 골모세포에서 형성된 후에 골기질속에 침착되며, 그 후 새로이 형성되는 것의 일부는 혈액내로 방출되므로 혈중 농도를 측정하면 골형성 정도를 알 수 있다.

상기 오스테오폰틴(OPN) 은 골세포 형성과 관련된 분화인자로서, 골형성 마커 단백질에 해당한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 수득한 골모세포를 포함하는 골질환 치료용 세포치료제를 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.

탯줄 유래 줄기세포 분리 및 수득

분리된 탯줄에서 우선 동맥과 정맥 혈관을 제거하고 남은 조직을 잘게 다져 AdiCol™(CEFO)과 37℃에서 30분 이상 반응시킨 후 세포를 추출하였다. 추출된 세포는 CEFOgro™배지로 37℃5% CO₂조건에서 배양하여 간엽줄기세포를 확보하였다.

공기투과성 폴리머 막을 계면활성제 버블로 코팅

하이퍼 플라스크의 다공성 막 위에서 PBS에 완전히 녹인 8% 폴록사머 407(poloxamer 407)을 흔들어 버블을 발생시킨 후 남은 폴록사머 용액은 따라 냈다. 2시간동안 37℃에서 공기투과성 폴리머 막을 폴록사머 버블로 코팅하였다. 현미경 3D 이미징을 통하여 폴록사머 407 버블 발생 후 용액을 제거하고 버블이 유지되는지 여부를 관찰한 결과, 2시간 이후(2H)에 버블이 사라지기 시작하였으며, 5시간 이후(5H)에는 버블이 완전히 사라지는 것을 확인할 수 있었다(도 2).

또한, 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 추적할 수 있도록 줄기세포에 quantum dot-conjugated silica nanoparticle(QD)을 24시간 uptake 하였다. 폴록사머 407 버블 발생 후 용액을 제거하고 세포를 loading 한 후 현미경 Z- stack을 이용하여 3D로 이미지화 하였다(도 3).

골모세포로의 분화 및 배양

상기 [실시예 2]에서 폴록사머 버블로 코팅한 후 2시간 이후에 상기 [실시예 1]에서 수득한 탯줄 유래 줄기세포를 1 × 10⁴ 개/cm² 밀도로 접종하고, DMEM 및 FBS 를 포함하는 배양액에서 24시간 배양하였다. 배양한 줄기세포를 골 분화 배지에서 72 시간동안 골모세포로 분화시켰다.

공기투과성 폴리머 막 코팅을 위한 적합한 계면활성제 선별

대표적인 생체적합성 계면활성제로 알려져 있는 폴록사머(poloxamer 407, p407), 소듐메틸코코일타우레이트(Sodium Methyl Cocoyl Taurate, DIAPON K-SF), 트윈20(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween 20) 또는 메틸프레드니솔론(Methylprednisolone) 의 독성을 확인하고자 하였다.

구체적으로, 3차원 다공성막을 포함하는 트랜스웰(transwell)에 위 챔버(chamber)에는 계면활성제 p407, DIAPON K-SF 또는 Tween 20을 각각 0, 0.5 1, 5 또는 15%(v/v)으로 각각 처리하여 상기 [실시예 2] 와 동일한 방법으로 2시간 코팅 후 상기 [실시예 1] 에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 20,000 cell/cm² 로 seeding 하였다. 아래 챔버에는 세포 성장 배지를 넣어 주고 3일동안 배양하였다. 1, 2, 3일째 CCK-8(Cat.CK04, DOJINDO) 용액을 넣고 37℃CO₂ incubator에서 3시간 반응 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 독성(도 4) 및 세포 성장 정도(도 5)를 분석하였다.

또한, 3차원 다공성막을 포함하는 트랜스웰(transwell)에 위 챔버(chamber)에는 계면활성제 p407, Methylprednisolone 또는 Tween 20을 4 mM 농도로 처리하여 상기 [실시예 2] 와 동일한 방법으로 2시간 코팅 후 상기 [실시예 1] 에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 20,000 cell/cm² 로 seeding 하였다. 아래 챔버에는 세포 성장 배지를 넣어 주고 3일동안 배양하였다. 1, 2, 3일째 CCK-8용액을 넣고 37℃CO₂ incubator 3시간 반응 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 독성(도 6) 및 세포 성장 정도(도 7)를 분석한다.

그 결과, [도 4] 내지 [도 7] 에서 나타나는 바와 같이 P407을 제외한 나머지 DIAPON K-SF, 트윈20 및 메틸프레드니솔론은 모두 세포에 독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

계면활성제 코팅 방법 선별

폴록사머(poloxamer)를 하이퍼 플라스크 다공성 막위에 버블 또는 겔 상태로 코팅한 후 [실시예 3]의 방법으로 분화시킨 탯줄 유래 줄기세포의 골분화 정도를 비교하고자 하였다.

구체적으로, 분화 유도된 골모세포와 미분화 세포를 각각 포집하여 Trizol™과 클로로포름(Sigma)을 처리하고 원심분리로 층 분리하여 mRNA만을 획득하였다. Transcriptor Universal cDNA Master Kit (Roche)를 이용하여 획득된 mRNA를 cDNA로 합성하였다. 이후 COL1A1 대상으로 RT-PCR을 통하여 DNA를 증폭하여 유전자레벨에서의 DNA copy 수 차이를 확인하였다. 중합효소연쇄반응 조건은 95℃10초, 54℃10초, 72℃30초로 50 cycles이었다(도 8).

또한, 상기 [실시예 3]의 방법으로 제조 및 분화 유도된 골모세포 및 미분화 세포의 배양액을 포집하여 혈관내피세포성장인자 Vascular endothelial growth factor (VEGF)의 분비 정도를 효소면역분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 실시하였다(도 9).

그 결과, [도 8] 및 [도 9] 에서 나타나는 바와 같이 미분화 또는 겔 상태의 폴록사머에서 분화한 세포에 비하여 본 발명의 방법으로 분화한 세포의 골유도 유전자 및 혈관형성 유도 단백질의 발현 정도가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.

수득한 골모세포의 골 형성능 평가

<6-1> 골모세포의 골 형성능(유전자 레벨)

골모세포의 분화과정에서 채취한 골모세포에서 RNA를 분리하여 cDNA를 합성한 후 실시간 중합효소연쇄반응(Real Time-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)을 이용하여 골형성 유전자 마커인 렁스2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2) 및 커넥신 43(Connexin 43, CX43) 의 유전자 발현 수준을 미분화 세포와 비교하였다.

구체적으로, 상기 [실시예 3]의 방법으로 제조 및 분화 유도된 골모세포와 미분화 세포를 각각 포집하여 Trizol™과 클로로포름(Sigma)을 처리하고 원심분리를 통하여 층 분리하여 mRNA만을 획득하였다. Transcriptor Universal cDNA Master Kit (Roche)를 이용하여 획득된 mRNA를 cDNA로 합성하였다. 이후 RUNX2, CX43를 대상으로 RT-PCR을 통하여 DNA를 증폭하여 유전자레벨에서의 발현량 차이를 확인하였다. 중합효소연쇄반응 조건은 95℃ 10초, 54℃ 10초, 72℃ 30초로 50 cycles이었다.

또한, 상기 [실시예 3]의 방법으로 제조 및 분화 유도된 골모세포, 미분화 세포, 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 및 성숙한 골세포(NHOst) 를 각각 포집하여 mRNA를 획득하고, Transcriptor Universal cDNA Master Kit (Roche)를 이용하여 획득된 mRNA를 cDNA로 합성하였다. 이후 RUNX2, CX43, COL1A를 대상으로 RT-PCR을 통하여 DNA를 증폭하여 유전자레벨에서의 발현량 차이를 확인하였다. 중합효소연쇄반응 조건은 95℃ 10초, 54℃ 10초, 72℃ 30초로 50 cycles이었다.

그 결과, [도 10] 및 [도 11]에서 나타나는 바와 같이 본 발명의 골모세포에서 RUNX2, CX43 또는 COL1A 이 미분화 줄기세포 및 성숙한 골세포(NHOst) 대비 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. [도 10]에서 RCB001, RCB002 및 RCB005 는 미분화세포를 의미하며, RCB001-DP1 내지 RCB005-DP5 는 분화된 본원발명의 세포치료제를 의미한다.

반면에, OSX, OCN 또는 OPN의 경우는 성숙한 골세포(NHOst)에서 본 발명의 골모세포보다 더 높게 발현되었데 이는 본 발명의 골모세포가 NHOst에 비해 미성숙 골분화 단계에 있는 것을 나타낸다(도 11). [도 11]에서 RCB001, RCB002 및 RCB005 는 미분화세포를 의미하며, RCB001-DP1 내지 RCB005-DP5 는 분화된 본원발명의 세포치료제를 의미한다.

<6-2> 골모세포의 골 형성능(단백질 레벨)

상기 [실시예 3]의 골모세포 분화과정에서 채취한 배양액 및 골모세포에서 골형성 또는 혈관 형성 단백질 마커로 알려져 있는 콜라겐 타입 1A(Collagen type 1A, COL1A), 오스테오폰틴(osteopontin) 또는 안지오포이에틴(Angiopoirtin, ANGPT-1)의 단백질 농도 변화를 확인하고자 하였다. 추가적으로, 동결된 본 발명의 세포치료제가 해동 후에도 골 형성 단백질 내지 혈관유도 단백질을 유지할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 상기 [실시예 3]의 방법으로 제조 및 분화 유도된 골모세포, 미분화 세포 및 분화 배양액을 각각 포집하여 효소면역분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 실시하였다. COL1A 는 분화 유도된 세포와 미분화 세포를 취하여 세포를 용해시킨 세포내의 단백질 발현 변화 정도를 확인하였고, 오스테오폰틴, 안지오포이에틴은 분화 72시간째까지의 배양액에서 단백질 분비 정도를 확인하였다.

그 결과, [도 12] 에서 나타나는 바와 같이 상기 본 발명의 골모세포에서 COL1A 단백질 발현이 증가되고 오스테오폰틴 및 안지오포이에틴의 분비가 모두 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, [도 13] 에서 나타나는 바와 같이 해동 후 3일 내지 7일까지 경과하여도 본 발명 세포치료제의 골 형성 단백질 내지 혈관유도 단백질이 유지되는 것을 확인할 수 있었다. [도 12] 및 [도 13] 에서 (A) 는 COL1A1, (B) 는 오스테오폰틴(OPN) 및 (C) 는 안지오포이에틴(Angiopoietin) 을 의미한다.

수득한 골모세포의 혈관 형성능 평가

수득한 골모세포에 의해 분비되는 혈관형성 단백질로 인한 인간 탯줄 정맥 내피 세포(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)의 혈관 형성능을 확인하고자 하였다.

구체적으로, 8.0 ㎛ pore size의 다공성 막이 포함된 12 well 트랜스웰 플레이트 위에는 미분화 줄기세포 또는 골모세포를 4 x 10⁴ cell/well 로 접종하고, 배양 중인 HUVEC 세포를 사용하여 quantum-dot을 24 시간 uptake 시킨 후 세포를 취하여 트랜스웰 아래에 25,000/cm² 밀도로 접종하였다. 접종한 후 1일 동안 공배양 하여 HUVEC의 혈관 튜브 형성 분석 실험을 실시하였다. 각 세포는 12 well plate에 seeding 후 transwell을 이용하여 배지 및 물질 교환이 일어나게 한 후, 12시간 배양하며 HUVEC세포의 혈관 유도를 확인하였다. Transwell 위에는 골분화세포와 미분화세포를 넣어 비교하였다. 음성대조군은 코팅된 Matrigel 위에 HUVEC 세포만을 접종하여 VEGF가 없는 HUVEC 배지를 이용하여 12시간 배양한 것이고 양성대조군은 음성대조군과 동일한 조건에서 VEGF 20 ng/ml을 첨가하여 배양한 것이다.

그 결과, [도 14] 에서 나타나는 바와 같이 혈관 형성 유도 인자로 알려진 VEGF 양성대조군(Positive Control) 과 비슷한 수준으로 탯줄유래의 원료세포(Undifferentiation UC-MSC) 와 골세포치료제 공배양 시 튜브(tube) 형성이 일어남을 확인할 수 있었다. 또한, 골분화 세포치료제(Osteogenic differentiation) 와 공배양 하였을 때 두껍고 튼튼한 혈관이 형성되는 것을 확인할 수 있으며, 특히 세포치료제에 의해 분비된 단백질에 의해 형성된 혈관은 더 두껍고 튼튼하게 형성되는 것을 확인할 수 있었다.

수득한 골모세포의 골 재생능 확인 - in vivo

대동물(염소) 또는 소동물(랫드) 모델에서 골 결손을 유도한 후 본 발명 세포치료제의 골 재생능을 확인하고자 하였다.

구체적으로, 면역억제시킨 염소 모델에 대퇴골결손을 유도한 후 염소 한 마리 당 1 × 10⁷ 골모세포를 처리하여 26주간 골 재생 효과를 확인하였다(표 2). 또한, 염소 모델에 대한 유효성 시험으로서 골조직을 2개월반 동안 탈회하여 H&E 및 Masson's Trichrome염색으로 본 세포치료제의 유효성에 대한 조직학적 평가를 진행하였다.

면역억제시킨 랫드 모델의 경우 요골결손을 유도한 후 랫드 한 마리 당 1 × 10⁶ 골모세포를 처리하여 12주간 골 재생 효과를 확인하였다(표 3). Sham 대조군은 알지네이트로 구성된 스캐폴드만을 처리하였다. 골 재생 정도는 μCT 이미지에 의하여 확인하고, 뼈 조직 고정, 탈회 및 섹션하여 슬라이드를 제작하여 염색 후 신생골 재생을 확인하였다.

군	투여물질	동물수(M/F)	경로	용량
Sham 대조군	-	6/6	대퇴골결손	-
시험물질 투여군	CF-M801	8/8	대퇴골결손	1 × 10⁷

군	투여물질	동물수(M/F)	경로	용량
Sham 대조군	-	10	요골결손	-
시험물질 투여군	CF-M801	10	요골결손	1 × 10⁶

염소 모델에 대한 유효성 시험 결과, [도 15a] 및 [도 15b] 에서 나타나는 바와 같이 26주에서 수컷과 암컷 모두, 대조군의 proximal과 distal 부분의 신생골 형성이 매우 부실하고 부분적으로만 확인되었으며, 상처치유 과정에 있는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 세포투여군의 proximal과 distal에서는 결손부위에 세포가 차 들어와 증식 및 골세포로 분화하여 신생골주가 끊어짐 없이 유기적으로 잘 연결되어 있었고, 두께도 상당히 두꺼워진 것을 확인할 수 있었다(도 15a의 왼쪽 하단 흰색 화살표). 혈관 역시 규칙적으로 잘 형성되어 있는 것으로 나타났다. 13주, 26주차 모두 신생골 형성은 세포투여군에서만 유의하게 관찰됨을 확인할 수 있었다.

랫드 모델에 대한 유효성 시험 결과, [도 16] 에서 나타나는 바와 같이 G3그룹은 passage 7에서 2일 분화시킨 세포치료제, G5 그룹은 passage 5에서 3일 분화 시킨 치료제 그룹으로 두 그룹 모두 대조군에 비해 뼈의 볼륨, 뼈의 볼륨 밀도, BMD 등이 증가하는 경향을 나타냈지만 특히, passage 5에서 3일 분화 시킨 치료제 그룹의 뼈의 볼륨이 더 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

세포치료제의 단계(Stage) 확인

본 발명 세포치료제의 단계를 확인하고자 하였다.

<9-1> Ki-67 발현 확인

인간 Ki-67는 세포주기 중 정지기(G0)에는 발현되지 않고 증식기(G1, S, G2, M기)에 발현되는 것으로 알려져 있으며, 세포치료제는 골세포로의 분화 후에는 세포가 증식하지 않기 때문에 발현하지 않는다. 이에 미분화 UCMSC(원료)와 본 발명의 분화한 골모세포(DP)의 2 배치에서 세포분열능을 세포분열의 지표인 Ki-67에 대한 발현정도를 세포면역형광법(Immunocytochemistry, ICC) 방법으로 확인하였고, 핵 염색 물질인 DAPI를 염색하여 세포 수 대비 Ki-67의 발현 정도로 보정하였다.

구체적으로, slide plate를 준비하여 각 well에 3x10⁵ 분량으로 미분화, 분화세포를 접종한 후 24시간 CO₂ incubator에서 배양하였다. 4% 포름알데히드로 10 분간 상온에서 세포를 고정하고 1% Triton X-100로 상온에서 10분간 세포를 permeabilization 하였다. BSA 로 상온에서 30분간 blocking 한 후, Ki-67 1차 항체를 상온에서 1시간, 형광연결된 2차 항체를 빛을 차광한 후 상온에서 1시간 반응시켰다. DAPI 가 포함되어 있는 ProLong™ Gold Antifade Mountant (Invitrogen)를 이용하여 mounting 하고 형광현미경을 이용하여 세포를 관찰하였다.

그 결과, [도 18] 에서 나타나는 바와 같이, 일관되게 Ki-67발현이 골모세포(DP)에서 1% 이하로 급격하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

<9-2> CFU-F 발현 확인

미분화 줄기세포 BMMSC, UCMSC(원료)와 본 발명의 분화한 골모세포(DP)의 2 배치를 이용하여 CFU-F를 측정하고자 하였다. 또한, 중간엽 줄기세포는 체외 배양을 시작하면 증식을 시작하여 특징적인 세포집락을 형성한다고 알려져 있는데, 집락내의 세포들은 섬유아세포 같은 모양을 보이며 각각의 세포 집락을 Colony forming unit-fibroblast라고 하며, 이는 줄기세포의 중요한 특징으로 알려져 있다. 이에, 형성된 콜로니를 2% crystal violet 염색 실시 후육안 및 카메라 사진으로 관찰하고, 염색된 콜로니를 3mm 이상, density 80% 이상인 것을 계수함으로써 정량하였다.

그 결과, [도 19a] 및 [도 19b] 에서 나타나는 바와 같이 분화한 골모세포(DP, CF-M801)는 Ki-67(세포분열의 지표) 발현과 유사한 패턴으로 CFU-F이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 골수유래 줄기세포, 탯줄유래 줄기세포인 원료세포에서는 콜로니가 다량 형성되었으나, 세포치료제에서는 콜로니 형성이 거의 안 됨을 확인하였다. 이로 보아, 탯줄유래 줄기세포 원료세포는 골분화세포로 분화됨으로써, 콜로니 형성능을 상실한 것으로 판단하였다. 이 결과를 통하여, 세포치료제는 원료세포에서 대부분 분화되었음을 확인하였다.

<9-3> ALP 발현 확인

세포치료제 CF-M801를 이용한 CFU-F에서 평균 1% 미만으로 나타나는 콜로니를 형성하는 세포가 미분화 중간엽줄기세포인지 골분화 유도된 세포 (Osteoblast)인지 확인하고자 하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <9-2>에서 CFU-F와 같은 방법으로 배양하여 나타나는 콜로니를 ALP(Alkaline phosphatase) 염색법으로 염색하여 골분화 여부를 확인하였다. 10,000개 세포를 접종하여 일주일간 유지한 후 ALP염색을 시행하였다. ALP 염색 후 Dimethylsulfoxide를 반응시켜 염색을 충분히 녹여 상층액만 취한 후 Microplate reader로 흡광도를 측정하였다.

그 결과, [도 20] 에서 나타나는 바와 같이 동종 탯줄유래 중간엽줄기세포인 미분화 UCMSC는 ALP염색이 거의 되지 않았으나 골분화 유도된 CF-M801은 서로 다른 3개 lot에서 콜로니가 모두 ALP 양성인 것을 확인할 수 있었다. 또한 골분화 유도된 CF-M801이 미분화 세포에 비해 높은 흡광도를 나타내었다. 이를 상대값으로 변환하여 분석한 결과 미분화 UCMSC대비 모든 경우에 1.5배 이상 높은 값을 보였다. 결과적으로, 분화한 골모세포(DP)는 골모세포는 일정시기 동안은 세포분열 멈추지 않은 상태로 있으며 분화가 진행되면서 분열능을 점차 잃고 골세포로 분화하는 것을 확인하였다.

종합적으로, 본 발명의 세포치료제는 골세포 분화의 master regulator인 RUNX2가 중간엽줄기세포를 골모세포로 분화시킬 수 있다. 초기단계의 골모세포(osteo-progeniotrs, immature osteoblasts)는 RUNX2+이며 증식능을 갖추고, 성숙된 골세포로 분화하며 mineralization이 더욱 진행된다는 것을 알 수 있었다(도 17a 및 도 17b).

<9-4> CD-10 발현 확인

세포치료제 분화의 확인을 위해서 CD10에 대한 발현정도를 유세포분석(Flowcytometry, FACS) 및 세포면역형광법(Immunocytochemistry, ICC) 방법으로 확인하였다.

구체적으로, 상기 [실시예 3]의 방법으로 제조 및 분화 유도된 골모세포, 미분화 세포 및 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)를 2% BSA/DPBS 용액으로 세포를 부유시켰다. CD10 1차 항체를 상온에서 1시간 반응시키고, 워싱 후 FITC 형광이 연결된 2차항체를 상온에서 30분간 반응시켰다. 세포 워싱 후, 상층액을 제거하고 3.7% 포름알데히드를 넣고 상온에서 20분간 고정 후 유세포 분석기(BD Accuri C6 Plus)를 이용하여 CD10 의 발현 정도를 확인하였다.

ICC는 slide plate를 준비하여 각 well에 3x10⁵ 분량으로 미분화, 분화세포를 접종한 후 24시간 CO₂ incubator에서 배양하였다. 4% 포름알데히드로 10 분간 상온에서 세포를 고정하고, 1% Triton X-100로 상온에서 10분간 세포를 permeabilization 하였다. BSA 로 상온에서 30분간 blocking 한 후, CD10 1차 항체를 상온에서 1시간, FITC 형광연결된 2차 항체를 빛을 차광한 후 상온에서 1시간 반응시켰다. DAPI 가 포함되어 있는 ProLong™Gold Antifade Mountant (Invitrogen)를 이용하여 mounting 하고 형광현미경을 이용하여 세포를 관찰하였다.

그 결과, [도 21a] 및 [도 21b] 에서 나타나는 바와 같이 본 발명의 분화시킨 골모세포(DP1 ~ DP3)는 CD10을 80% 이상 발현하는 반면 미분화 중간엽줄기세포는 CD10을 15% 이하로 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 골모세포는 기존의 줄기세포 표지인자가 아닌 골모세포 특이적인 표지인자를 확인하여 순도 확인 관리하고 있음을 의미하였다.

Claims

i) 공기투과성 폴리머 막을 계면활성제 버블로 코팅하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 버블에 중간엽 줄기세포를 1 × 10³ 내지 1 × 10⁵ 개/cm² 밀도로 접종하는 단계;
iii) 상기 단계 ii)의 중간엽 줄기세포를 분화 배지에서 골모세포로 분화시키는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii)에서 분화시킨 골모세포를 분리 및 수득하는 단계;
를 포함하는 중간엽 줄기세포를 골모세포로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 i)의 계면활성제는 폴록사머(poloxamer)인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포를 골모세포로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 i)의 버블은, 상기 공기투과성 폴리머 막 위에서 계면활성제를 넣고 움직여 버블을 발생시키는 단계; 를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포를 골모세포로 분화 시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 중간엽 줄기세포는, 탯줄, 제대혈, 태반, 양막, 골수, 지방, 모낭, 치아, 치수 및 피부진피로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에서 유래한 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포를 골모세포로 분화시키는 방법.
제1항의 방법으로 수득한 골모세포.
제5항에 있어서, 상기 골모세포는 커넥신 43(Connexin 43, CX43), 렁스2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2) 및 콜라겐 타입 1A(Collagen type 1A1, COL1A1)의 발현 수준이 미분화 줄기세포 및 성숙한 골세포에 비하여 높고; 안지오포이에틴(Angiopoietin 1, ANGPT1) 및 알칼라인포스파타아제(Alkaline Phosphatase, AP) 의 발현 수준이 미분화 줄기세포에 비하여 높으며; 오스테릭스(Osterix, OSX), 오스테오칼신(Osteocalcin, OCN) 및 오스테오폰틴(Osteopontin, OPN) 의 발현 수준이 성숙한 골세포에 비하여 낮은 것을 특징으로 하는 골모세포.
제5항에 있어서, 상기 골모세포는 Ki-67 의 발현 수준이 미분화 줄기세포에 비하여 낮은 것을 특징으로 하는 골모세포.
제1항의 방법으로 수득한 골모세포를 포함하는 골질환 치료용 세포치료제.
제8항에 있어서, 상기 골모세포는 커넥신 43(Connexin 43, CX43), 렁스2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2) 및 콜라겐 타입 1A(Collagen type 1A1, COL1A1)의 발현 수준이 미분화 줄기세포 및 성숙한 골세포에 비하여 높고; 안지오포이에틴(Angiopoietin 1, ANGPT1) 및 알칼라인포스파타아제(Alkaline Phosphatase, AP) 의 발현 수준이 미분화 줄기세포에 비하여 높으며; 오스테릭스(Osterix, OSX), 오스테오칼신(Osteocalcin, OCN) 및 오스테오폰틴(Osteopontin, OPN) 의 발현 수준이 성숙한 골세포에 비하여 낮은 것을 특징으로 하는 세포치료제.
제8항에 있어서, 상기 골모세포는 Ki-67 의 발현 수준이 미분화 줄기세포에 비하여 낮은 것을 특징으로 하는 세포치료제.
제8항에 있어서, 상기 골질환은 골절, 대퇴골두골괴사, 척추유합, 지연유합 또는 불유합, 골다공증, 골괴사증, 가관절증, 파제트병 및 골형성부전증 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포치료제.