KR101860301B1 - 하이드로겔을 이용한 3차원적 줄기세포 골분화 유도 방법 - Google Patents

하이드로겔을 이용한 3차원적 줄기세포 골분화 유도 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간엽줄기세포의 골분화 유도에 있어서, 다공성막 및 생분해성 합성 바이오겔을 이용하여 세포를 세포 배양 용기와 비접촉적으로 배양함으로써 단시간 내에 골분화하는 방법에 관한 것으로, 종래의 골분화 방법에 비해 현저히 골분화 유도 기간을 단축시킬 수 있으며, 분화 후에도 세포의 분리가 용이한 효과가 있다.

Description

하이드로겔을 이용한 3차원적 줄기세포 골분화 유도 방법{3D METHOD FOR OSTEOGENIC DIFFERENTIATION USING HYDROGEL}
본 발명은 간엽줄기세포의 골분화 유도에 있어서, 합성 바이오겔 위에서 단시간 내에 골분화하는 방법에 관한 것이다.
최근 조직공학과 재생의학의 발달에 의하여 손상된 조직과 장기를 치료할 수 있는 종래와는 다른 방법들이 개발되고 있는데, 그 중 제일 각광을 받고 있는 것은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)에 의한 세포치료이다. 줄기세포(stem cell)란, 미분화 상태를 유지하면서 무한히 증식할 수 있으며 일정한 환경과 조건이 주어질 경우 특정 기능과 형태를 갖도록 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포에는 사람의 배아를 이용해 만들 수 있는 배아줄기세포(Embryonic stem cell)와 혈구세포를 끊임없이 만드는 골수세포와 같은 성체 줄기세포(Adult stem cell)가 있다. 배아줄기세포는 인체를 이루는 모든 세포와 조직으로 분화할 수 있지만 윤리적인 이유로 사용이 제한되어 있는 반면, 성체 줄기세포는 제대혈이나 다 자란 성인의 골수와 혈액 등에서 추출한 것으로, 성체 줄기세포는 생체 내 이식 후에 특정 조직 및 장기 특이적으로 분화할 수 있고, 본래 세포의 특성과는 다른 타 조직의 세포로 전이 분화할 수 있는 분화 유연성을 가지는 세포로서, 윤리적인 제한 없어 조직공학에 널리 사용되고 있다. 이에 최근에는 의료분야에서 줄기세포를 증식 후 특정 세포로 분화시켜 환자의 조직 또는 기관의 재생 및 치환을 위해 다양한 시도와 초기 임상 실험이 진행 중에 있다. 간엽줄기세포는 발생이 끝난 신체의 여러 장기 또는 혈액에 존재하는 성체 줄기세포 중에 하나로, 유지 방법이 용이하고 윤리적 문제가 없는 세포 원으로 현재 재생 의료 분야에서 가장 주목받는 줄기세포이나, 배아줄기세포에 비해 체외 계대 배양 및 분화능에 한계점이 존재하는 단점이 있다
이미 인간과 동물을 대상으로 한 연구에서 성체 줄기세포 중 골수 유래 줄기세포가 골형성 세포로 분화되는 것이 확인되었고(Friedenstein A.J. et al., Transplantation., 6:230-247, 1968), 최근 연구에서는 골수로부터 분리한 줄기세포를 배양하여 골아세포로 분화 증식시키는 방법에 진전이 있으며 이를 통한 임상적용의 가능성이 높아지고 있다(Ohgushi H. et al., J. Biomed Mater Res., 48:913-927, 1999). 최근에는 간엽 줄기세포로부터 골세포를 분화시키는 방법이 주도적으로 연구되고 있는 실정이다.
한편, 현재 줄기세포의 분화에 가장 널리 사용되고 있는 방법은 2차원적인 웰 플레이트(well plate)에서 세포를 배양하여 분화시키는 것이다. 그러나 최근 논문보고에 따르면 2차원(monolayer)적으로 세포 배양시, 3차원적 세포 배양을 했을 때보다 세포의 기능이 떨어지고 형태(morphology)도 현저히 달라진다는 보고들이 있었다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 1943-1948, 2003; Cell, 111: 923-925, 2002; Cancer Cell 2: 205-216, 2002). 이와 같이 세포의 상태에 악영향을 미치는 방식으로 세포를 배양하면서 분화를 유도하면 분화가 어려우며, 기간이 오래 걸리는 단점이 있다. 이러한 세포 배양의 단점을 극복하고자 대한민국 등록특허 제10-0733914호에서는 3차원 겔 속에 세포가 존재하는 것을 특징으로 하는 3차원 미세 세포 배양 시스템에 대하여 제시하고 있으나, 줄기세포의 세포 배양 또는 분화 후에 겔 내부에 존재하는 세포를 분리하기 위해서는 겔을 녹여내야 하므로 세포 손상이 심한 단점이 있다.
기존의 2차원적 세포 배양 용기에서 줄기세포를 골분화 유도하면 줄기세포의 일부분으로만 배지와 접하기 때문에 분화에 필요한 영양 성분, 유도 성분 및 공기의 유입이 용이하지 않아 분화가 어려우며, 분화 기간이 3 내지 5주로 긴 단점이 있다. 겔 내부에 배양되는 종래의 3차원 배양 방식은 세포를 분리할 수 없는 단점이 있어, 줄기세포의 골분화 후 분화된 세포의 분리 및 사용이 용이한 3차원 세포 배양 시스템의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명에서는 쉽게 세포를 분리할 수 있으면서, 세포의 배지 접촉 표면적을 증가시켜 골분화를 촉진시키기 위하여, 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 존재하면서 세포의 전방위로 배지와 접촉하여 골분화를 촉진시켜 골분화 기간을 단축시킬 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명의 줄기세포를 골분화 유도하는 방법을 이용하여 줄기세포를 골분화하면, 줄기세포와 배지가 더 넓은 표면적으로 접촉할 수 있어, 줄기세포의 골분화 유도가 촉진되어 종래의 골분화 방법에 비해 현저히 골분화 유도 기간을 단축시킬 수 있으며, 세포가 하이드로겔의 내·외면에 부착되어 있으나 배양 온도인 37℃ 미만에서는 겔 상태의 하이드로겔이 졸 상태로 변하기 때문에, 분화 후에도 세포의 분리가 용이한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 3차원 상태에서의 줄기세포 분화 방법을 나타낸 도식이다.
도 2는 종래의 배양 접시를 이용한 2차원 상태에서의 줄기세포 분화 방법을 나타낸 도식이다.
도 3은 하이드로겔 없이 폴리머 막을 이용한 3차원적 줄기세포 분화 방법을 나타낸 도식이다.
도 4는 비교예 1의 방법 (14일: controlⅠ, 5일: controlⅡ), 비교예 2의 방법 (레인 3, 하이드로겔 농도 0%) 및 실시예의 방법으로 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포의 골분화를 확인한 도이다.
도 5는 비교예 1의 방법, 비교예 2의 방법 (레인 2) 및 실시예의 방법으로 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포의 골분화를 확인한 도이다.
도 6은 비교예 2의 방법 (control), 비교예 2의 방법에 추가로 BMP2 100 ng/ml 또는 Wnt3a 20 ng/ml을 처리를 처리, 및 실시예의 방법으로 골분화 유도한 탯줄 유래 간엽줄기세포 (hydrogel(3D))의 골분화 정도를 확인한 도이다.
도 7은 실시예의 방법으로 1일, 3일, 5일 또는 7일 동안 골분화 유도한 탯줄 유래 간엽줄기세포의 골분화 정도를 확인한 도이다.
도 8은 골수 유래 간엽줄기세포(BMMSC), 지방 유래 간엽줄기세포(ADMSC), 탯줄 유래 간엽줄기세포(UCMSC), 배아줄기세포 유래 간엽줄기세포(ESMSC) 및 치주인대세포(PDL)를 비교예 1의 방법으로 14일 동안 (2D), 비교예 2의 방법 (without hygrogel) 및 실시예의 방법으로 골분화 유도한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.
일 측면에서, 본 발명은
한쪽 면에 하이드로겔이 도포된 다공성막이 비접촉적으로 내부에 위치한 세포 배양 용기에서 줄기세포를 골분화 유도하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은
다공성막을 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 위치시키고;
상기 다공성막의 한쪽 표면에 하이드로겔 용액을 도포하여 졸-겔 상변이를 통해 하이드로겔을 코팅하며;
상기 코팅된 하이드로겔 위에 줄기세포를 접종하고; 및
상기 줄기세포를 골분화 유도 배지에서 배양하여 줄기세포를 골분화 유도할 수 있다.
일 구현예에서, 줄기세포 접종 후, 골분화 유도 배지에서 배양하기 전에 상기 줄기세포를 골분화 전처리 배지에서 10 내지 24시간 동안 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 전처리 배지는 글루코오스 농도가 1.5g/l 이하일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 다공성막을 세포 배양 용기의 바닥에 평행하도록 비접촉적으로 위치시킬 수 있다. 상기 다공성막에 하이드로겔을 코팅하는 것과 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 위치시키는 것의 순서가 특별히 한정되지 않으며, 상기의 경우, 다공성막을 세포 배양 용기의 바닥에 비접촉적으로 배치한 뒤에 하이드로겔을 코팅할 수도 있고, 미리 다공성막에 하이드로겔을 코팅한 뒤에 세포 용기 내부에 비접촉적으로 배치할 수도 있다.
본 발명의 세포 배양 용기는 일반적으로 세포 배양에 사용되는 접시(dish), 웰 플레이트를 말하며, 세포 배양에 사용되고, 다공성막을 용기 바닥에 비접촉적으로 도입할 수 있는 세포 배양용기라면 특별히 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 세포 배양 용기 내부에서 비수평적적으로 세포를 배양하여 줄기세포를 골분화 유도하는 경우에는 다공성막의 한쪽 표면에 하이드로겔 용액을 도포하고, 하이드로겔 위에 세포를 부착한 뒤 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 위치시켜 골분화를 유도할 수도 있다.
일 구현예에서, 상기 줄기세포는 골분화 유도 배지에서 3 내지 7일 동안 배양될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 다공성막과 세포 배양 용기의 사이에 배지가 유입되어 줄기세포와 배지의 접촉 표면적을 증가시켜 골분화 유도 기간을 단축시킬 수 있다. 본 발명의 다공성막 및 하이드로겔은 공기 및 배지의 투과를 허용하며, 다공성막과 세포 배양 용기가 비접촉적으로 배치됨으로써 생긴 다공성막과 세포 배양 용기 사이의 공간에 배지가 유입되어 배지 및 공기가 세포의 부착 부위로도 제공되기 때문에, 더 넓은 표면적으로 줄기세포가 배지 및 공기와 접하고 이로 인해 골분화 유도 시간이 단축된다. 일 예로, 기존 골분화 방식은 3주 내지 5주 걸리나, 본 발명의 방법을 이용하면 3일 내지 7일이면 골분화가 일어난다.
본 발명의 세포 배양 용기는 일반적으로 세포 배양에 사용되는 접시(dish), 웰 플레이트를 말하며, 세포 배양에 사용되고, 다공성막을 용기에 비접촉적으로 도입할 수 있는 세포 배양용기라면 특별히 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔 용액 (하이드로졸)의 하이드로겔로의 졸-겔 상변이는 37℃에서 1 내지 2 시간 동안 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 1 내지 40% 하이드로겔일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 내지 15% 하이드로겔이다. 0% 하이드로겔에서는 줄기세포가 분화하지 못하고, 40% 이상에서는 골분화 효율이 더 증가하지 않아 의미가 없다. 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 1 내지 40 %의 하이드로겔을 다공성막에 200 내지 300 ㎕/cm2로 도포할 수 있으며, 졸-겔 상변이를 통해 형성된 하이드로겔의 두께는 1 내지 4 mm일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 하이드로겔 %에 따라 37℃에서의 점도가 1.E+00 내지 1.E+06 (100 내지 106)mPa·s일 수 있으며, 상기 범위 이외의 기공 사이즈를 가지는 하이드로겔에서는 줄기세포의 부착 또는 분화가 어려울 수 있다. 본 발명의 하이드로겔은 세포 배양 온도인 37℃에서는 겔 상태이기 때문에 겔의 내·외에서 세포가 배양되지만 배양 온도 미만에서는 졸 상태로 변하기 때문에 세포 분화 후에 분리가 용이하다.
일 구현예에서, 상기 다공성막은 공극이 0.1 내지 8 ㎛일 수 있으나, 배지 및 공기는 통과하나 하이드로겔은 통과하지 못할 공극 사이즈라면 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 줄기세포는 탯줄 유래 간엽줄기세포(Umbilical cord mesenchymal stem cell), 지방 유래 간엽줄기세포(adipose derived mesenchymal stem cell), 배아줄기세포 유래 간엽줄기세포(Embryonic stem cell derived mesenchymal stem cell), 치주인대세포(Periodontal ligament cell) 또는 골수 유래 간엽줄기세포(Bone marrow-derived mesenchymal stem cell)일 수 있다. 상기 줄기세포는 특별히 그 유래에 제한되지 않으며, 그 예로 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 유래의 세포가 있다. 상기 줄기세포는 바람직하게는 인간 유래의 줄기세포이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "다공성막" 또는 "폴리머막(polymer membrane)"은 배지 및 공기는 통과하나 하이드로겔은 통과하지 못하는 다공성막, 투과성막 또는 필름 형태의 물질을 말한다. 세포 배양 배지 및 공기 투과성인 다공성 구조물이라면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "하이드로겔(hydrogel)"은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질을 말한다. 세포 부착 및 배양에 적합한 하이드로겔이라면 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의일 실시예에서는 생분해성 합성 바이오겔을 사용하였다.
본 발명에서 용어, "줄기세포"는 자기 복제능 및 분화증식능을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 줄기세포에는, 분화 능력에 따라서, 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell), 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)등의 아집단이 포함된다. 상기 전분화능 줄기세포는 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 다분화능 줄기세포는 모든 종류는 아니지만, 복수 종의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 단분화능 줄기세포는 특정한 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 전분화능 줄기세포로서는, 배아 줄기세포(ES Cell), 미분화생식선세포(EG Cell), 역분화줄기세포(iPS cell) 등을 들 수 있으며, 다분화능 줄기세포로서는,간엽계 줄기세포(지방유래, 골수유래, 제대혈 또는 탯줄 유래 등), 조혈계 줄기세포(골수 또는 말초 혈액 등에서 유래), 신경계 줄기세포, 생식 줄기세포 등의 성체 줄기세포 등을 들 수 있으며 단분화능 줄기세포로는 평소에는 분열능이 낮은 상태로 존재하다가 활성화 이후 왕성한 분열로 오직 간세포들만을 만드는 간세포(Committed stem cell) 등을 들 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은
세포 배양 용기;
한쪽 면에 세포가 부착될 하이드로겔이 부착된 다공성막; 및
상기 세포 배양 용기의 내부에 상기 하이드로겔이 부착된 다공성막이 비접촉적으로 배치되는 것을 포함하는 줄기세포 분화 장치에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 다공성막 및 하이드로겔은 배지 및 공기의 투과가 가능한 것일 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 3차원 상태에서의 줄기세포 분화 방법
줄기세포의 분화를 촉진시키기 위하여, 3차원적으로 분화를 수행하고자 하였다. 이를 위하여, 세포 배양 접시 또는 웰의 바닥에 수평이 되도록 비접촉적으로 0.4 ㎛ 내지 1 ㎛인 폴리머 막 (Corning, USA)을 설치하고 생분해성 합성 바이오겔 (BASF, Germany)을 멸균된 3차 증류수에 다양한 %의 녹여 제조한 생분해성 합성 바이오겔 (BASF, Germany)을 폴리머 막 위에 250 ㎕/cm2로 도포한 뒤 1시간 30분 동안 37℃에서 겔로 굳혀 분화용 세포 배양기를 제작하였다. 졸-겔 상전이 후의 생분해성 합성 바이오겔의 두께는 최소 1 mm였으며, 평균 2.5 mm였다. 지방 유래 간엽줄기세포는 CEFOgro ADMSC 배지 (CB-ADMSC-GM, CEFO, Korea), 골수 유래 간엽줄기세포는 CEFOgro BMMSC 배지 (CB-BMMSC-GM, CEFO, Korea), 배아줄기세포 유래 간엽줄기세포는 CEFOgro ESMSC 배지(CB-ESMSC-GM, CEFO, Korea), 탯줄 유래 간엽줄기세포는 CEFOgro UCMSC 배지 (CB-UCMSC-GM, CEFO, Korea), 치주인대세포(PDL)는 CEFOgro PDL 배지 (CB-PDL-GM, CEFO, Korea)로 37℃, CO2 배양기에서 3일 내지 4일간 배양한 뒤, 각각의 줄기세포를 상기 바이오겔 위에 접종한 뒤, 골분화 전처리 배지 (CB-DM-Osteo-PT, CEFO, Korea)를 넣고 37℃, CO2 배양기에서 18시간 동안 배양하였다. 그 후, 골분화 유도배지 (CB-DM-Osteo, CEFO, Korea)로 배지를 교환하고 37℃, CO2 배양기에서 5일 동안 골분화를 유도하였다 (도 1).
비교예 1. 2차원 상태에서의 줄기세포 분화 방법
종래의 줄기세포 분화 방법인 2차원적 분화 방법으로 줄기세포를 분화하였다. 구체적으로, 12well 세포배양 용기(접시)에 세포를 접종하고 골분화 유도를 위한 전처리 배지(CB-DM-Osteo-PT, CEFO, Korea)에서 세포 밀도가 85 내지 90%가 될 때까지 배양한 뒤 골분화 유도배지 (CB-DM-Osteo, CEFO, Korea)로 교환하여 14 내지 21일 동안 골분화를 유도하였다 (도 2).
비교예 2. 하이드로겔 없이 3차원 상태에서의 줄기세포 분화 방법
상기 실시예 1에서 폴리머 막 위에 생분해성 합성 바이오겔이 0%인 (폴리머 막만 존재) 경우에서의 줄기세포의 분화를 확인하기 위해, 폴리머 막 위에 줄기세포를 접종한 뒤 실시예 1과 동일하게 5일 동안 배양하였다 (도 3).
실험예 1. 골수 유래 간엽줄기세포의 골분화 확인
상기 비교예 1의 방법으로 14일 또는 5일 동안 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포, 상기 비교예 2의 방법 (0% 생분해성 합성 바이오겔)으로 5일 동안 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포 및 상기 실시예의 방법 (5%, 10% 또는 15% 생분해성 합성 바이오겔)으로 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포를 위상차 현미경을 통하여 육안으로 골분화를 확인하였다. 또한, 골분화한 세포를 알리자린 레드 염색을 통해 확인하기 위하여 세포들을 PBS로 2회 세척한 후 70% 에틸알콜로 10분간 상온에서 고정하고 3차 증류수로 2회 세척하였다. 이후 알리자린 레드(Alizarin Red) 염색 키트 (CB-SK-Osteo)의 Sol I을 처리하고 상온에서 30분간 반응시켰다. 이후 Sol II로 3회 깨끗이 세척한 후 도립현미경 (LEICA, Germany)으로 이미지 분석을 실시하였다. 아울러, 이를 수치화하기 위하여 이미지 분석 후 Sol III를 처리하여 30분간 상온에서 반응시키고 염색된 시약을 완전히 녹였다. 녹인 용액을 100 ㎕씩 취하여 96 웰 플레이트에 넣고 550 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 비교예 1의 방법으로 5일 동안 골분화 유도한 경우 및 비교예 2의 방법으로 5일 동안 골분화 유도한 경우 골분화가 이루어지지 않았으나, 실시예의 방법으로 5일 동안 골분화를 유도한 경우에는 5일 만에 충분한 골분화가 유도되었다. 특히, 실시예의 방법으로 골분화시 1 내지 30% 하이드로겔에서 골분화가 모두 잘 일어났으며, 특히 10% 농도에서 골분화가 가장 최적임을 알 수 있었다 (도 4).
실험예 2. 지방 유래 간엽줄기세포의 골분화 확인
상기 비교예 1의 방법으로 14일 동안 골분화 유도한 지방 유래 간엽줄기세포, 상기 비교예 2의 방법 (0% 생분해성 합성 바이오겔)으로 5일 동안 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포 및 상기 실시예의 방법 (5%, 10% 또는 15% 생분해성 합성 바이오겔)으로 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포를 위상차 현미경을 통하여 육안으로 골분화를 확인하였다. 또한, 골분화한 세포를 알리자린 레드 염색을 통해 확인하기 위하여 세포들을 PBS로 2회 세척한 후 70% 에틸알콜로 10분간 상온에서 고정하고 3차 증류수로 2회 세척하였다. 이후 알리자린 레드(Alizarin Red) 염색 키트 (CB-SK-Osteo)의 Sol I을 처리하고 상온에서 30분간 반응시켰다. 이후 Sol II로 3회 깨끗이 세척한 후 도립현미경 (LEICA, Germany)으로 이미지 분석을 실시하였다. 그 결과, 비교예 2의 방법으로 5일 동안 골분화 유도한 경우 골분화가 전혀 이루어지지 않았으나, 실시예의 방법으로 5일 동안 골분화시 1 내지 30% 생분해성 합성 바이오겔에서 골분화가 모두 잘 일어났으며, 특히 5 내지 10% 농도에서 골분화가 가장 최적임을 알 수 있었다 (도 5).
실험예 3. 탯줄 유래 간엽줄기세포의 골분화 확인
상기 비교예 2의 방법으로 5일 동안 골분화 유도한 탯줄 유래 간엽줄기세포, 상기 비교예 2의 방법으로 세포를 접종하고 BMP(bone morphogenic protein)2 (peprotech, israel) 100 ng/ml 또는 Wnt3a (peprotech, israel) 20 ng/ml을 처리하여 5일 동안 골분화를 유도한 탯줄 유래 간엽줄기세포 및 상기 실시예의 방법 (10% 생분해성 합성 바이오겔)으로 골분화 유도한 탯줄 유래 간엽줄기세포를 위상차 현미경을 통하여 육안으로 골분화를 확인하였다. 또한, 골분화한 세포를 알리자린 레드 염색을 통해 확인하기 위하여 세포들을 PBS로 2회 세척한 후 70% 에틸알콜로 10분간 상온에서 고정하고 3차 증류수로 2회 세척하였다. 이후 알리자린 레드(Alizarin Red) 염색 키트 (CB-SK-Osteo)의 Sol I을 처리하고 상온에서 30분간 반응시켰다. 이후 Sol II로 3회 깨끗이 세척한 후 도립현미경 (LEICA, Germany)으로 이미지 분석을 실시하였다. 아울러, 이를 수치화하기 위하여 이미지 분석 후 Sol III를 처리하여 30분간 상온에서 반응시키고 염색된 시약을 완전히 녹였다. 녹인 용액을 100 ㎕씩 취하여 96 웰 플레이트에 넣고 550 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 골분화를 촉진시키는 것으로 알려진 BMP와 Wnt3a를 처리하고 비교예 2의 방법으로 5일 동안 골분화 유도한 경우보다도 본 발명의 실시예 방법을 이용한 탯줄 유래 간엽줄기세포의 골분화 효율이 현저히 우수하였다 (도 6).
실험예 4. 탯줄 유래 간엽줄기세포의 골분화 기간에 따른 변화 확인
상기 실시예의 방법 (10% 생분해성 합성 바이오겔)으로 골분화를 1일, 3일, 5일 또는 7일 동안 유도한 탯줄 유래 간엽줄기세포를 알리자린 레드 염색을 통해 이미지 분석을 실시하였다. 아울러, 이를 수치화하기 위하여 550 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 골분화 유도 1 일차부터 골분화가 유도되기 시작하였고 골분화 기간이 길어질수록 골분화가 강하게 일어났다. 특히, 탯줄 유래 간엽줄기세포의 경우는 종래의 2차원 방식에서 다른 간엽줄기세포에 비해 골분화가 잘 일어나지 않는 것으로 알려져 있는데 본 발명의 실시예의 3차원 골분화 유도 방법을 이용한 경우에는 다른 간엽줄기세포와 같이 골분화가 잘 이루어지는 것으로 나타났다 (도 7).
실험예 5. 다양한 간엽줄기세포의 골분화 확인
골수 유래 간엽줄기세포, 지방 유래 간엽줄기세포, 탯줄 유래 간엽줄기세포, 배아줄기세포 유래 간엽줄기세포 및 치주인대세포를 각각 상기 비교예 1의 방법으로 14일 동안, 상기 비교예 2의 방법 (0% 생분해성 합성 바이오겔)으로 5일 동안, 또는 상기 실시예의 방법 (10% 생분해성 합성 바이오겔)으로 5일 동안 골분화 유도한 뒤 알리자린 레드 염색을 통해 간엽줄기세포의 골분화 정도를 확인하였다.
그 결과, 비교예 1의 방법 및 비교예 2의 방법으로 5일간 골분화를 유도한 경우에는 간엽 줄기세포들의 골분화가 전혀 유도되지 않았으나, 실시예의 방법으로 생분해성 합성 바이오겔 위에서 3차원적으로 5일간 골분화를 유도한 경우에는 간엽줄기세포의 유래에 상관없이 골분화가 잘 이루어지는 것을 관찰할 수 있었다 (도 8).
상기에서와 같이, 종래의 2차원적 골분화 방법으로는 간엽줄기세포의 골분화가 약 2주 내지 5주 걸리나, 세포 배양 용기 위에 폴리머 막을 비접촉적으로 배치하고 그 위에 하이드로겔을 도포하여 그 위에 간엽줄기세포를 접종하여 골분화 전처리 배지로 배양한 뒤 골분화 유도 배지를 처리하는 본 발명의 3차원적 골분화 방법을 이용하면 3 내지 7일이면 골분화가 일어나는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 다공성막을 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 위치시키고;
    상기 다공성막의 한쪽 표면에 하이드로겔 용액을 도포하여 졸-겔 상변이를 통해 하이드로겔을 코팅하고;
    상기 코팅된 하이드로겔 위에 줄기세포를 접종하고; 및
    상기 줄기세포를 골분화 유도 배지에서 배양하는 단계를 포함하며;
    상기 하이드로겔은 5~15%의 농도의 하이드로겔을 다공성막의 한쪽 표면에 코팅하고, 세포배양 온도인 37℃에서는 겔 상태로서 1.E+00 내지 1.E+06 (100 내지 106) mPa·s의 점도를 가지며, 세포 배양 온도 미만에서는 졸 상태이며, 졸-겔 상변이를 통해 형성된 하이드로겔의 두께는 1mm 내지 4mm이고,
    상기 다공성막은 공극이 0.1㎛ 내지 8㎛이며,
    상기 다공성막 및 하이드로겔은 공기 및 배지의 투과를 허용하는 것을 특징으로 하는,
    3일~7일 안에 줄기세포로부터 골분화를 유도하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 다공성막과 세포 배양 용기의 사이에 배지가 유입되어 줄기세포와 배지의 접촉 표면적을 증가시켜 골분화 유도 기간을 단축시키는 것을 특징으로 하는, 3일~7일 안에 줄기세포로부터 골분화를 유도하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 2항에 있어서, 상기 줄기세포는 탯줄 유래 간엽줄기세포(Umbilical cord mesenchymal stem cell), 지방 유래 간엽줄기세포(adipose derived mesenchymal stem cell), 배아줄기세포 유래 간엽줄기세포(Embryonic stem cell derived mesenchymal stem cell), 치주인대세포(Periodontal ligament cell) 또는 골수 유래 간엽줄기세포(Bone marrow-derived mesenchymal stem cell)인 것을 특징으로 하는, 3일~7일 안에 줄기세포로부터 골분화를 유도하는 방법.
  9. 제 2항에 있어서, 상기 졸-겔 상변이는 37℃에서 1 내지 2 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 3일~7일 안에 줄기세포로부터 골분화를 유도하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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