KR101687291B1

KR101687291B1 - 3차원 세포배양 시스템 및 이를 이용한 세포 배양 방법

Info

Publication number: KR101687291B1
Application number: KR1020140125315A
Authority: KR
Inventors: 박현숙; 이순례; 양지원; 추설; 박장미; 모현정
Original assignee: (주)세포바이오
Priority date: 2014-09-19
Filing date: 2014-09-19
Publication date: 2016-12-19
Also published as: CN107075443A; US10752880B2; EP3196293B1; US20170283767A1; EP3196293A1; ES2969778T3; KR20160034540A; WO2016043489A1; JP2017526378A; JP6475322B2; CN107075443B; EP3196293C0; EP3196293A4

Abstract

본 발명은 다공성막 및 하이드로겔을 이용하여 세포를 세포 배양 접시에서 비접촉적으로 배양함으로써 세포의 전방위로 배지를 통해 공기 및 영양성분을 공급하여 세포의 생장 및 증식을 증대시키는 방법에 관한 것이다.

Description

3차원 세포배양 시스템 및 이를 이용한 세포 배양 방법{3D CELL CULTURE SYSTEM AND CELL CULTURE METHOD USING THE SAME}

본 발명은 생분해성 합성 바이오겔을 기반으로 하는 3차원 세포 배양 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 줄기세포 및 일차배양세포의 배양에 있어 다공성막 및 생분해성 합성 바이오겔을 이용하여 세포를 세포 배양 접시에서 비접촉적으로 배양하는 방법에 관한 것이다.

현재 가장 널리 사용되고 있는 세포 배양 방법은 2차원적인 웰 플레이트(well plate)나 배양 접시에서 세포를 배양하는 것이다. 그러나 최근 논문보고에 따르면 2차원(monolayer) 세포배양시, 3차원적 세포배양을 했을 때보다 세포의 기능이 떨어지고 형태(morphology)도 현저히 달라진다는 보고들이 있었다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 1943-1948, 2003; Cell, 111: 923-925, 2002; Cancer Cell 2: 205-216, 2002). 이러한 단점을 극복하고자 최근 들어 삼차원 구조를 가진 지지체를 이용한 세포배양 방법이 많이 개발되고 있고, 이러한 구조를 만드는 방법에는 전기방사(electrospinning), 발포성형, 이온의 농도를 이용하는 방법, 구형 자기조립체를 이용해 역전구조를 만드는 방법이 많이 쓰이고 있다. 또한, 최근에는 바이오 메디컬 분야에서 사용되는 초소형 전자기계시스템인 DNA칩, 단백질칩, 일체형칩 등을 일컫는 바이오멤스(Bio-MEMS) 분야의 발전으로 생체 내의 환경과 유사하도록 만들어주는 세포배양법의 새로운 패러다임이 시도되고 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 5545-5548, 1999; Anal. Chem., 74: 1560-1564, 2002; Biotechnol. Prog., 20: 338-345, 2004; Biomed. Microdevices, 4: 161-166, 2002). 이와 유사하게, 대한민국 등록특허 제10-0733914호에서는 3차원 겔 속에 세포가 존재하는 것을 특징으로 하는 3차원 미세 세포 배양 시스템에 대하여 제시하고 있으나, 세포 배양 후 세포의 계대 배양 또는 세포를 이용한 분석시에 겔 내부에 존재하는 세포를 분리하기 어렵고, 특히, 세포 부착 및 증식이 까다로운 줄기세포 또는 일차배양세포의 경우 세포 분리시 세포가 손상되는 단점이 있었다.

줄기세포(stem cell)란, 미분화 상태를 유지하면서 무한히 증식할 수 있으며 일정한 환경과 조건이 주어질 경우 특정 기능과 형태를 갖도록 분화할 수 있는 세포를 말한다. 인간 배아줄기세포는 적당한 체외 배양조건에서 자가 증식(self-renewal)을 지속적으로 할 수 있고, 인체를 이루고 있는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency)으로 인해 인체의 발생, 분화 및 성장에 대한 기초 지식을 이해하기 위해서뿐만 아니라 인체의 손상 또는 다양한 질환의 근본적인 치료 방법인 세포 치료제 개발 및 다양한 신약 후보물질의 약효 검색, 질환의 원인 규명, 치료법 개발 등 다양한 측면에서 이를 대상으로 한 연구결과의 활용범위가 확대되고 있다.

한편, 일차배양세포(primary cell)는 동물 조직이나 기관으로부터 직접 일차 배양한 세포로서 살아있는 생물 조직에서 얻은 정상적인 세포를 말하며, 종양세포와 다르게 실험실내 인위적인 (in vitro) 계대배양에 있어서 한계가 있다. 일차배양세포는 생물의 실제 반응과 유사하다는 장점을 지니기 때문에 생물의약품 생산 등에 사용되고 있으며 세포치료제도로 개발되고 있다.

기존의 세포 배양 용기의 표면에 부착하여 배양하는 세포 배양 방법은 부착된 부위를 제외한 세포의 일부분으로만 공기 투과 및 배지의 영양분이 제공되므로, 세포의 기능이 떨어지고 형태(morphology)가 달라지며, 생장 및 증식이 용이하지 않다. 특히, 줄기세포 또는 일차배양세포와 같이 부착, 생장 및 증식이 어려운 세포의 경우 이와 같은 배양 방법은 한계가 있으며, 겔 내부에 배양되는 종래의 3차원 배양 방법은 세포를 분리할 수 없는 단점이 있어, 세포의 분리가 요구되는 계대 배양 또는 분석에 용이하고 제작이 용이한 3차원 세포 배양 시스템의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명에서는 쉽게 세포를 분리할 수 있으면서, 전방위적으로 공기 및 배지가 제공되어 줄기세포 및 일차배양세포의 부착, 생장 및 증식을 향상시키기 위하여, 세포를 배양 용기에 비접촉적으로 배양하는 세포 배양 방법 및 세포 배양 용기에 비접촉적으로 세포를 배양할 수 있는 세포 배양 시스템을 제공한다.

본 발명의 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템을 이용하여 세포를 배양하는 경우, 세포의 전방위에서 공기 및 배지와 접촉할 수 있어, 세포의 기능 및 형태가 유지되며, 세포의 부착, 생장 및 증식이 촉진되는 효과를 나타내며, 세포 배양 온도인 36 내지 37 ℃에서는 겔 상태이기 때문에 겔의 내·외에서 세포가 배양되지만 온도가 배양 온도 미만으로 저하되면 졸 상태로 변하기 때문에 세포 증식 후의 계대 배양 또는 세포 분리 후의 분석이 용이하고, 특히, 배양이 어려운 줄기세포 및 일차배양세포의 부착, 생장 및 증식을 향상시키는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 3차원적 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템을 나타낸 도식이다.
도 2는 종래의 배양 접시를 이용한 2차원적 세포 배양 방법을 나타낸 도식이다.
도 3은 생분해성 합성 바이오겔만을 이용한 3차원적 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템을 나타낸 도식이다.
도 4는 종래의 배양 접시를 이용한 2차원적 세포 배양 방법, 생분해성 합성 바이오겔만을 이용한 3차원적 세포 배양 방법 및 본 발명의 3차원적 세포 배양 방법 (세 번째 레인에서부터 오른쪽으로 5%, 10% 및 15% 농도의 생분해성 합성 바이오겔)으로 배양한 인간 골수 유래 간엽줄기세포의 세포 부착 상태, 세포 생존 및 콜로니 형성능을 확인한 도이다.
도 5는 종래의 배양 접시를 이용한 2차원적 세포 배양 방법, 생분해성 합성 바이오겔만을 이용한 3차원적 세포 배양 방법 및 본 발명의 3차원적 세포 배양 방법 (오른쪽으로 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 및 30% 농도의 생분해성 합성 바이오겔)으로 배양한 인간 지방 유래 간엽줄기세포의 부착 상태 및 세포 수율을 나타낸 도이다.
도 6은 종래의 배양 접시를 이용한 2차원적 세포 배양 방법 또는 본 발명의 3차원적 세포 배양 방법 (생분해성 합성 바이오겔 10% 조건)으로 배양한 인간 탯줄 유래 간엽줄기세포를 확인한 도이다.
도 7은 종래의 배양 접시를 이용한 2차원적 세포 배양 방법, 다공성막만을 이용한 3차원적 세포 배양 방법 및 본 발명의 3차원적 세포 배양 방법 (오른쪽으로 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 및 30% 생분해성 합성 바이오겔)으로 배양한 인간 유래 일차배양세포인 피부 각질 세포의 부착 상태 및 세포 수율을 나타낸 도이다.
도 8은 종래의 배양 접시를 이용한 2차원적 세포 배양 방법 및 본 발명의 3차원적 세포 배양 방법 (생분해성 합성 바이오겔 10% 조건)으로 배양한 개 (비글)의 지방 유래 조직에서 유래한 간엽줄기세포를 확인한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.

일 측면에서, 본 발명은

다공성막을 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 위치시키고;

상기 다공성막의 한쪽 표면에 생분해성 합성 바이오겔 용액을 도포하여 졸-겔 상변이를 통해 생분해성 합성 바이오겔을 코팅하며;

상기 코팅된 생분해성 합성 바이오겔 위에 세포를 포함한 배지를 넣어 배양하는 것을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 다공성막은 투과성막으로 구성된 배양용기일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 다공성막을 세포 배양 용기의 바닥에 평행하도록 비접촉적으로 위치시킬 수 있다. 상기 다공성막에 생분해성 합성 바이오겔을 코팅하는 것과 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 위치시키는 것의 순서가 특별히 한정되지 않으며, 상기의 경우, 다공성막을 세포 배양 용기의 바닥에 비접촉적으로 배치한 뒤에 생분해성 합성 바이오겔을 코팅할 수도 있고, 미리 다공성막에 생분해성 합성 바이오겔을 코팅한 뒤에 세포 용기 내부에 비접촉적으로 배치할 수도 있다.

일 구현예에서, 세포 배양 용기 내부에서 비수평적적으로 세포를 배양하는 경우에는 다공성막의 한쪽 표면에 생분해성 합성 바이오겔 용액을 도포하고, 생분해성 합성 바이오겔 위에 세포를 부착한 뒤 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 위치시켜 배양할 수도 있다.

일 구현예에서, 상기 다공성막과 세포 배양 용기 사이에 배지가 유입되어 배지 및 공기가 세포의 부착 부위로도 제공될 수 있다. 본 발명의 다공성막 및 생분해성 합성 바이오겔은 공기 및 배지의 투과를 허용하며, 다공성막과 세포 배양 용기가 비접촉적으로 배치됨으로써 생긴 다공성막과 세포 배양 용기 사이의 공간에 배지가 유입되어 채우기 때문에, 생분해성 합성 바이오겔 위에 부착된 세포의 부착 부위로도 배지 및 공기가 유입되어 세포 배양에 필요한 영양분 및 공기의 제공이 가능하다.

본 발명의 세포 배양 용기는 일반적으로 세포 배양에 사용되는 접시(dish), 웰 플레이트를 말하며, 세포 배양에 사용되고, 다공성막을 용기 바닥에 비접촉적으로 도입할 수 있는 세포 배양용기라면 특별히 제한되지 않는다. 또한, Hyperflask(Corning Co., USA)와 같이 전방위적인 공기 투과성을 갖는 세포배양 용기도 이에 해당된다.

일 구현예에서, 상기 생분해성 합성 바이오겔 용액 (하이드로졸)의 생분해성 합성 바이오겔로의 졸-겔 상변이는 37℃에서 1 내지 2 시간 동안 수행될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 생분해성 합성 바이오겔은 1 내지 40% 생분해성 합성 바이오겔일 수 있으며, 40% 이상에서는 세포 생장 및 증식의 변화가 유의미하지 않아 세포 배양에는 의미가 없으며, 간엽줄기세포의 경우에는 5 내지 10%가 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

일 구현예에서, 상기 생분해성 합성 바이오겔은 생분해성 합성 바이오겔 %에 따라 37℃에서의 점도가 1.E+00 내지 1.E+06 (10⁰ 내지 10⁶) mPa·s일 수 있으며, 상기 범위 이외의 점도를 가지는 생분해성 합성 바이오겔은 세포의 생장 및 증식이 더 증가하지 않아 세포 배양에 의미가 없거나 오히려 세포 부착, 생장 및 증식이 감소할 수 있다.

본 발명에 사용된 생분해성 합성 바이오겔 이외에 세포가 부착할 수 있는 다공성 겔이 사용될 수 있으며, 이의 예로, sigma-aldrich사에서 제조한 HydroMatrix^TM Peptide Cell Culture Scaffold, D.A. Narmoneva, et al. / Biomaterials 26 (2005) 4837-4846에 개시된 올리고펩타이드로 이루어진 겔, 국제공개특허 WO2007/029003에 개시된 하이드로겔 미국 특허 US20070099840에 개시된 하이드로겔, M. Zhou et.,al. Biomaterials, 2009, in press에 개시된 세포 부착용 올리고펩타이드 매트릭스, 4 V. Jayawarna, et al.. Acta Biomaterialia, 2009, in press에 개시된 펩타이드 겔 등이 사용될 수 있으며, 세포를 부착 또는 지지하면서 공기 및 배지 투과성인 겔이라면 제한되지 않는다.

일 구현예에서, 상기 생분해성 합성 바이오겔은 폴리에스터 중합체, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리락트산-글리콜산의 공중합체, 폴리하이드로옥시부티르산, 폴리하이드로옥시발레르산 및 폴리하이드로옥시부티르산-발레르산의 공중 합체를 1종 이상 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 다공성막은 공극이 0.1 내지 8 ㎛일 수 있으나, 배지 및 공기는 통과하나 생분해성 합성 바이오겔은 통과하지 못할 공극 사이즈라면 제한되지 않는다.

일 구현예에서, 상기 세포는 줄기세포 또는 일차배양세포일 수 있으며, 상기 줄기세포는 탯줄 유래 간엽줄기세포(Umbilical cord mesenchymal stem cell, UCMSC), 지방 유래 간엽줄기세포(Adipose derived mesenchymal stem cell, ADMSC) 또는 골수 유래 간엽줄기세포(Bone marrow-derived mesenchymal stem cell, BMMSC)일 수 있고, 상기 일차배양세포는 인간 피부 유래 각질세포(keratonocyte)일 수 있다. 상기 줄기세포는 포유동물 유래일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 인간 유래 및 개 유래 줄기세포를 사용하였다.

본 발명에서 용어, "3차원적 배양"은 세포가 부착된 하부 부분으로도 공기 및 배지가 공급되어 세포의 전방위적으로 공기 및 영양성분이 공급되는 배양 방법을 말한다. 본 발명의 일 실시예에서는 다공성막으로 생분해성 합성 바이오겔과 세포 배양 접시의 바닥을 물리적으로 분리하여 세포의 부착, 생장 및 증식이 향상되었다.

본 발명에서 용어, "다공성막", "투과성막" 또는 "폴리머막(polymer membrane)"은 배지 및 공기는 통과하나 생분해성 합성 바이오겔은 통과하지 못하는 다공성막 또는 필름 형태의 물질을 말한다. 세포 배양 배지 및 공기 투과성인 다공성 구조물이라면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "하이드로겔(hydrogel)"은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질을 말하며, 세포 부착 및 배양에 적합한 하이드로겔이라면 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의 일 실시예에서는 생분해성 합성 바이오겔을 사용하였다. 본 발명의 생분해성 합성 바이오겔은 Polyoxyethylen-(POE) 및 Polyoxypropylene-(POP-)로 이루어진 공중합체를 이용하였으며, 이는 세포 배양 온도인 36 내지 37 ℃에서는 점도가 1.E+00 내지 1.E+06 (10⁰ 내지 10⁶) mPa·s인 겔 상대이므로 세포 부착에 용이하고, 배양 온도 미만에서는 졸 상태로 변하기 때문에 세포 증식 후의 계대 배양 또는 세포 분리 후의 분석이 용이하다.

본 발명에서 용어, "줄기세포"는 자기 복제능 및 분화증식능을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 줄기세포에는, 분화 능력에 따라서, 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell), 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)등의 아집단이 포함된다. 상기 전분화능 줄기세포는 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 다분화능 줄기세포는 모든 종류는 아니지만, 복수 종의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 단분화능 줄기세포는 특정한 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 전분화능 줄기세포로서는, 배아 줄기세포(ES Cell), 미분화생식선세포(EG Cell), 역분화줄기세포(iPS cell) 등을 들 수 있으며, 다분화능 줄기세포로서는,간엽계 줄기세포(지방유래, 골수유래, 제대혈 또는 탯줄 유래 등), 조혈계 줄기세포(골수 또는 말초 혈액 등에서 유래), 신경계 줄기세포, 생식 줄기세포 등의 성체 줄기세포 등을 들 수 있으며 단분화능 줄기세포로는 평소에는 분열능이 낮은 상태로 존재하다가 활성화 이후 왕성한 분열로 오직 간세포들만을 만드는 간세포(Committed stem cell) 등을 들 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적으로 인간 골수 유래 간엽 줄기세포, 인간 지방 유래 줄기세포, 인간 탯줄 유래 줄기세포 및 개 지방 유래 간엽줄기세포를 사용하여 본 발명의 3차원 세포 배양 방법으로 부착, 생장 및 증식이 촉진되는 것을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "일차배양세포(Primary cell)"는 개체에서 추출한 조직에서 유전자 등의 조작 없이 분리한 세포로 생체 장기/조직의 기능을 대변하는 세포이다. 피부나 혈관내피, 골수, 지방, 연골 등에서 일차배양세포가 분리되어 해당 조직 및 세포의 기능을 연구하거나 잃어버린 조직을 복구하기 위한 세포치료제로 이용되고 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적으로 인간 피부 유래 각질세포를 사용하였다.

상기 줄기세포 또는 일차배양세포는 본 발명의 세포 배양 방법 및 세포배양기에 의해 배양될 수 있는 세포라면 특별히 그 유래에 제한되지 않으며, 그 예로 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 유래의 세포가 있다. 상기 줄기 세포 또는 일차배양세포는 바람직하게는 인간 유래의 줄기세포 또는 일차배양세포이나, 이에 제한되지 않는다.

일 측면에서, 본 발명은

세포 배양 용기;

상기 세포 배양 용기 바닥의 상부에 비접촉적으로 배치되는 다공성막; 및

상기 다공성막 상부에서 졸-겔 상변이를 통해 다공성막 상부 표면에 부착되는 생분해성 합성 바이오겔을 포함하는 세포 배양 시스템에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 다공성막 및 생분해성 합성 바이오겔은 배지 및 공기의 투과가 가능한 것일 수 있으며, 세포 배양 배지의 투과가 가능하여 세포 배양에 필요한 영양분 및 공기의 제공이 가능하다.

본 발명에 사용된 용어 "세포 배양 시스템"은 세포를 배양하는 용기, 장치 또는 기기를 말한다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 . 3차원 상태에서의 줄기세포 배양 방법

생분해성 합성 바이오겔 (BASF, Germany)을 멸균된 3차 증류수에 5%부터 30%까지 5% 간격의 농도로 녹여 다양한 %의 겔을 제조한 후, 250 ㎕/cm²로 0.4 ㎛ 내지 1 ㎛인 폴리머막 (Corning, USA) 위에 도포하여 1시간 30분 동안 37℃에서 굳혀 세포 배양 용기를 제작하였다. 그 후, 기존 배양 방법으로 배양 접시에서 배양한 인간 지방유래 간엽줄기세포, 인간 골수 유래 간엽줄기세포, 인간 탯줄 유래 간엽줄기세포, 인간 피부 유래 각질세포(Keratonocyte) 또는 개 지방유래 간엽줄기세포(Canine ADMSC)를 상기 세포 배양 용기의 생분해성 합성 바이오겔 위에 접종하고 하기의 각 세포에 최적화된 배양액으로 37℃, CO₂ 배양기에서 3일 내지 4일간 배양하였다. 배양하였다. 인간 지방 유래 간엽줄기세포는 CEFOgro ADMSC 배지 (CB-ADMSC-GM, CEFO, Korea), 인간 골수 유래 간엽줄기세포는 CEFOgro BMMSC 배지 (CB-BMMSC-GM, CEFO, Korea), 인간 탯줄 유래 간엽줄기세포는 CEFOgro UCMSC 배지 (CB-UCMSC-GM, CEFO, Korea), 인간 피부 유래 각질세포(Keratonocyte)는 CEFOgro HK 배지 (CB-HK-GM, CEFO, Korea) 및 개 지방 유래 간엽줄기세포(Canine ADMSC)는 CEFOgro MSGM 배지 (CB-MS-GM, CEFO, Korea)로 배양하였다 (도 1).

비교예 1. 2차원 상태에서의 줄기세포 배양 방법

종래의 줄기세포 배양 방법인 2차원적 배양 방법으로 줄기세포를 배양하였다. 구체적으로, 세포배양 용기(접시)에 상기 실시예에서와 같이 줄기세포를 접종하고 줄기세포를 배양하였다 (도 2).

비교예 2. 폴리머막 없이 3차원 상태에서의 줄기세포 배양 방법

상기 실시예에서 폴리머막 없이 생분해성 합성 바이오겔이 세포 배양 접시의 바닥에 도포한 뒤 이 위에 상기 실시예에서와 동일하게 줄기세포를 접종한 뒤 배양하였다 (도 3).

도 2 (2차원 방법) 및 도 3 (생분해성 합성 바이오겔만을 사용한 3차원 방법)과 비교해, 본 발명의 3차원 세포 배양 방법 (도 1)은 세포의 전방위로 공기 및 배지가 제공되는 특징이 있다.

실험예 1. 인간 골수 유래 간엽줄기세포의 3차원 배양 확인

인간 골수 유래 간엽줄기세포의 배양 후 세포 배양 정도를 확인하기 위하여, 인간 골수 유래 간엽줄기세포를 비교예 1의 2차원 배양 방법, 비교예 3의 배양 방법 및 상기 실시예의 배양 방법 (5%, 10% 또는 15% 생분해성 합성 바이오겔)로 배양하였다. 세포 배양 후, 위상차 현미경으로 세포를 관찰한 결과, 비교예 2의 방법으로는 줄기세포가 잘 부착되지 못하였으며, 실시예의 방법을 이용하여 배양한 경우에는 종래의 2차원 배양 방법 (비교예 1)보다도 세포가 잘 생장하는 것을 확인할 수 있었다 (도 4). 또한, 인간 골수 유래 간엽줄기세포의 생존을 확인하기 위하여, 세포사멸이 발생한 경우는 빨간색으로 염색이 되고 생존세포는 녹색으로 염색이 되는 Live/Dead 분석을 수행하기 위하여, 상기와 같이 세포를 배양한 뒤, 배지를 제거하고 세척 과정 없이 Live/Dead assay (Invitrogen, USA) 용액을 150㎕/12well로 첨가하여 20분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후 세척 과정 없이 즉시 형광현미경 (LEICA, Germany) 상에서 이미지를 분석하였으며 이 모든 시험과정은 제조사 제공 프로토콜을 따랐다. 그 결과, 상기 위상차 현미경 관찰 결과와 동일하게, 실시예의 방법으로 배양한 경우에는 비교예 방법보다 세포가 잘 부착되고 생장하는 것을 알 수 있었다 (도 4). 아울러, 줄기세포능을 간접적으로 확인하기 위하여, 1 개의 세포에서 세포가 분열하여 콜로니를 형성하는 것을 확인하는 CFU 분석을 수행하였다. 구체적으로, 실시예, 비교예 1 및 비교예 2의 방법으로 6 웰 플레이트 (Corning, USA)에 인간 골수 유래 간엽줄기세포를 웰당 200개씩 접종하고 약 8일간 배양한 후, 포르말린으로 고정하여 1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 염색 후 3차 증류수 또는 포스페이트버퍼살린(PBS, Phosphate buffer saline)으로 세척하고 도립현미경 (LEICA, Germany) 상에서 이미지 분석을 실시한 결과, 상기의 다른 실험 결과와 유사한 결과를 보였으며, 본 발명의 실시예의 방법으로 배양된 줄기세포의 세포분열 (증식) 능력은 1 내지 20% 생분해성 합성 바이오겔에서 가능하였으며, 특히, 5% 생분해성 합성 바이오겔 및 10% 생분해성 합성 바이오겔에서 우수함을 알 수 있었다 (도 4). 이를 통해, 배양 접시에 생분해성 합성 바이오겔을 직접 코팅하고 세포를 배양하는 경우 (비교예 2)에는 세포가 부착되지 않아 세포 배양 방법으로는 적합하지 않은 것으로 판단되며, 이는 공기 투과 및 배지 제공에 문제가 있기 때문일 것으로 유추된다.

실험예 2. 인간 지방 유래 간엽줄기세포의 3차원 배양 확인

인간 지방 유래 간엽줄기세포의 배양 후 세포 배양 정도를 확인하기 위하여, 인간 지방 유래 간엽줄기세포를 실시예 (5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30% 생분해성 합성 바이오겔), 비교예 1 및 비교예 2의 방법으로 배양하였다. 세포 배양 후, 위상차 현미경으로 세포를 관찰한 결과, 상기의 골수 유래 간엽줄기세포와 마찬가지로 비교예 2의 방법으로는 세포가 잘 부착되지 못하였으며, 실시예의 방법으로 (1 내지 30% 생분해성 합성 바이오겔) 줄기세포를 배양한 경우 대부분 세포가 잘 자랐다. 또한, 배양된 인간 지방 유래 간엽줄기세포를 계수하기 위하여, 각각의 방법으로 배양한 후 PBS로 2회 세척하고 트립신 (Invitrogen, USA)을 처리하여 37℃, CO₂ 배양기에서 7분 동안 반응시켜 세포를 수집한 뒤 배양액으로 2회 세척한 후 자동 세포계수기 (ADAM; Nano&Tech, Korea)로 세포를 계수한 결과, 상기 현미경 관찰과 동일하였으며, 특히 실시예 방법으로 배양한 줄기세포 중에 5 내지 15%의 생분해성 합성 바이오겔에서 세포 성장이 우수하였다 (도 5).

실험예 3. 인간 탯줄 유래 간엽줄기세포의 3차원 배양 확인

다른 줄기세포인 인간 탯줄 유래 간엽줄기세포를 실시예 (10% 생분해성 합성 바이오겔), 비교예 1의 방법으로 배양한 뒤 위상차 현미경으로 세포를 관찰한 결과, 탯줄유래간엽줄기세포 또한 본 발명의 폴리머막 및 생분해성 합성 바이오겔을 이용한 실시예의 방법으로 배양시 생장이 촉진되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6).

실험예 4. 인간 유래 일차배양세포의 3차원 배양 확인

인간 유래의 일차배양세포인 인간 피부 유래 각질세포를 실시예 (5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30% 생분해성 합성 바이오겔), 비교예 1 및 비교예 2의 방법으로 배양하고 세포 배양 정도를 확인하였다. 구체적으로, 인간 피부 유래 각질세포를 실시예 (5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30% 생분해성 합성 바이오겔), 비교예 1 및 비교예 2의 방법으로 각각 배양한 후, 위상차 현미경으로 확인하고, 세포를 수집하여 계수하였다. 그 결과, 폴리머막 위에 1 내지 30%의 생분해성 합성 바이오겔을 굳힌 실시예의 방법으로 배양한 피부 각질세포가 대체적으로 잘 자랐으며, 생분해성 합성 바이오겔 %가 높아질수록 세포 산출량이 많아지고 20 내지 30% 생분해성 합성 바이오겔에서는 생분해성 합성 바이오겔 함유 %에 의한 차이가 거의 없는 것으로 나타났다. 특히, 15 내지 30% 생분해성 합성 바이오겔을 포함하는 세포 배양 용기에서는 일반 배양접시로 배양하는 방법보다 세포 산출량이 더 많았다 (도 7).

실험예 5. 개 유래 간엽줄기세포의 3차원 배양 확인

다른 종 유래 간엽줄기세포인 개의 지방 유래 간엽줄기세포를 실시예 (10% 생분해성 합성 바이오겔), 비교예 1의 방법으로 배양하여 현미경을 이용하여 확인한 결과, 2차원 배양 방법보다도 세포가 잘 배양되는 것을 확인할 수 있었다 (도 8).

상기의 결과를 통해, 세포 배양 접시에 비접촉적으로 폴리머막을 설치하고 그 위에 생분해성 합성 바이오겔을 형성하여 그 위에 세포를 배양하면 배양이 세포의 부착이 용이하고 생장 및 증식이 증대되는 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템을 이용하면, 일반적으로 세포 부착, 생장 및 증식이 까다로운 줄기세포 및 일차배양세포의 배양이 용이하고, 실온에서 하이드로겔이 졸 상태로 변하기 때문에 배양 후 계대 배양 또는 분석을 위한 세포 분리시 용이한 장점이 있다.

Claims

다공성막을 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 위치시키고;
상기 다공성막의 한쪽 표면에 세포 배양 온도인 37℃에서 점도가 1.E+00 내지 1.E+06 (10⁰ 내지 10⁶) mPas이 되도록 폴리옥시에틸렌(POE) 및 폴리옥시프로필렌(POP)으로 이루어진 공중합체를 포함하는 하이드로겔 용액을 도포하여 졸-겔 상변이를 통해 하이드로겔을 코팅하되, 이때 줄기세포를 배양하는 경우에는 5~15% 농도의 하이드로겔을 코팅하고 일차배양세포를 배양하는 경우에는 15~30% 농도의 하이드로겔을 코팅하고; 및
상기 코팅된 하이드로겔 위에 세포를 포함한 배지를 넣어 3차원적으로 배양하는 것을 포함하며;
상기 다공성막의 공극은 0.1㎛ 내지 8㎛이고,
상기 다공성막 및 하이드로겔은 공기 및 배지의 투과를 허용하는 것을 특징으로 하는,
줄기세포 또는 일차배양세포의 배양 방법.
제 1항에 있어서, 상기 다공성막과 세포 배양 용기의 사이에 배지 및 공기가 유입되어 배지 및 공기가 세포의 부착 부위로도 제공되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 또는 일차배양세포의 배양 방법.
제 1항에 있어서, 상기 졸-겔 상변이는 37℃에서 1 내지 2 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 또는 일차배양세포의 배양 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 탯줄 유래 간엽줄기세포(Umbilical cord mesenchymal stem cell), 지방 유래 간엽줄기세포(adipose derived mesenchymal stem cell) 또는 골수 유래 간엽줄기세포(Bone marrow-derived mesenchymal stem cell)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 또는 일차배양세포의 배양 방법.
삭제
삭제