BR102020007764A2 - Inserto de cultura de células contendo hidrogel e método de uso - Google Patents
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Abstract
inserto de cultura de células contendo hidrogel e método de uso. a presente invenção trata de insertos de cultura de células contendo uma camada de hidrogel para uso em cultura de células em interfaces ar-gel de modo a promover a formação de construções semelhantes a tecidos epiteliais, bem como trata de método de utilização desses insertos de cultura de células. o inserto de acordo com a presente invenção compreende uma câmara oca com duas porções distintas, sendo uma porção superior (1) e uma porção inferior (2), e uma base de sustentação (3), dita porção superior (1) possuindo extremidade aberta no topo e dita porção inferior (2) possuindo paredes laterais perfuradas (21) e sendo fechada no fundo (4) também perfurado (5), dotado de um tampão de higrogel (6) sobre o qual se dispõe as células (7).
Description
[01] A presente invenção trata de insertos de cultura de células contendo uma camada de hidrogel para uso em cultura de células em interfaces ar-gel de modo a promover a formação de construções semelhantes a tecidos epiteliais. A presente invenção também trata de método de utilização desses insertos de cultura de células.
[02] Como bem conhecido da técnica, o estudo pré-clínico, como modelos animais, possui sérios problemas, tais como o seu alto custo biológico, ético e financeiro. Assim, ao longo do tempo, as pesquisas realizadas em laboratório se basearam no uso de modelos in vitro que buscam mimetizar e replicar estruturas observadas em organismos vivos, notadamente para o desenvolvimento de novas drogas e medicamentos. Em geral, as culturas de células eram realizadas com o auxílio de dispositivos confeccionados em material plástico, ou vidro, em modelos bidimensionais, os quais ainda não eram adequados para reproduzir o microambiente natural no qual as células originalmente se encontram nos organismos vivos. Portanto, o uso de engenharia tecidual tem sido uma alternativa ao cultivo celular tradicional bidimensional e aos modelos “in vivo" ao utilizar materiais biomiméticos e linhagens celulares para mimetizar tecidos em um ambiente tridimensional. A utilização de modelos de cultivo celular tridimensional demonstra vantagens para o estudo das células, notadamente para mimetizar e estudar diferentes patologias.
[03] Insertos e dispositivos convencionais de cultura de células são vastamente descritos pelo estado da técnica. Por exemplo, as patentes norteamericanas US4871674 de Matsui, Hirai e Nakamura, 1989; US5026649 de Lyman, Mathus e Root, 1991; US5578492 de Fedun, 1996); US5652142 de Barker et al., 1997; e US7598076B2 de Wedell e Matthes, 2009.
[04] A patente US4871674 revela inserto contendo projeções descontínuas para pendurá-lo em uma porção circunferencial superior e um filtro de membrana em uma porção inferior, sendo caracterizada por possuir nervuras cônicas triangulares providas continuamente embaixo das peças de projeção descontínuas.
[05] A patente US5026649 revela um aparelho para cultivar tecidos “in vitro”, o qual permite que um gradiente de concentração de nutrientes se desenvolva através de uma membrana permeável à qual uma amostra de tecido está ligada. A membrana permeável é presa à extremidade inferior de um suporte tubular que, por sua vez, fica suspenso por uma flange conectada à sua extremidade superior no topo de uma cuba que contém os nutrientes. Normalmente, a cuba faz parte de um conjunto de placa de cultura de tecidos. A flange posiciona o suporte e a membrana centralmente na cuba, de modo a evitar a ação capilar no espaço entre a cuba e o suporte. A configuração do suporte e sua cooperação com a tampa do conjunto da placa também impedem que o suporte e a membrana flutuem na solução nutriente da cuba. As aberturas no suporte fornecem acesso a uma pipeta para adicionar e retirar fluido do espaço entre a cuba e o suporte da membrana e do espaço abaixo da membrana.
[06] A patente US5578492 revela um inserto contendo uma membrana para cultura de células e um dispositivo para separação da membrana para facilitar o uso de instrumentação convencional para posterior exame. O inserto de cultura de células é fornecido com uma membrana microporosa formando a parede inferior como a superfície de cultura de células do inserto. O inserto inclui um mecanismo de suporte para mantê-lo suspenso em uma determinada posição em uma placa com várias cubas para cultura e um mecanismo para separar o suporte da porção de sustentação da membrana do inserto, uma vez que o grau desejado de cultura de células tenha sido atingido.
[07] A patente US5652142 revela um aparelho para cultivar células ou tecidos “in vitro” que permite o desenvolvimento de um gradiente de concentração de nutrientes através de uma membrana permeável na qual uma amostra de tecido está ligada. A membrana permeável é unida à extremidade inferior de um insertode cultura de células que, por sua vez, é suportado por uma flange conectada em sua extremidade superior no topo de uma cuba que contém os nutrientes. O movimento restrito do inserto de cultura de células na cuba pode ser facilitado por projeções que se estendem para fora da superfície da parede externa do inserto, de modo a evitar a ação capilar no espaço entre a cuba e o inserto.
[08] Por fim, a patente US7598076 revela um inserto de cultura celular compreendendo uma parede em forma de copo, uma base consistindo em uma membrana de filtração, projetando braços de suporte que são distribuídos em torno da periferia do topo e espaçadores laterais para orientação vertical e horizontal em uma cuba contendo um meio de cultura líquido em uma placa de cultura de células. Os espaçadores estão distribuídos pela periferia do inserto de cultura de células e têm diferentes comprimentos radiais de tal maneira que uma grande abertura de alimentação e várias aberturas menores são formadas.
[09] Os documentos acima citados descrevem em geral um inserto de cultura de células de plástico compreendendo uma parede lateral delimitada por uma abertura de extremidade superior e abertura de extremidade inferior, com uma membrana permeável plana fixada à abertura de extremidade inferior. Na maioria dos casos, esses insertos celulares são usados para permitir a cultura paralela de dois tipos de células, uma na placa de cultura celular e outra no inserto de cultura celular, para que a interação entre esses dois tipos de células possa ser estudada sem o real contato físico entre eles.
[010] Outro possível uso desses insertos de cultura de células do estado da técnica é cultivar células em interfaces ar-líquido. Em tais experimentos, as células são cultivadas no topo da membrana permeável plana anexada à extremidade inferior do inserto, de modo que elas entrem em contato com o meio de cultura de células em sua superfície inferior e com o ar em sua superfície superior. Essa configuração é particularmente interessante para a cultura de células epiteliais, que requerem estar em contato com o ar para amadurecer e expressar seu fenótipo característico. A membrana permeável presente nas inserções convencionais de cultura de células, no entanto, expõe as células a um microambiente que é muito distinto daquele encontrado no corpo humano. Isso leva a uma baixa taxa de sucesso dentre os compostos submetidos a testes pré-clínicos e clínicos, desperdiçando-se tempo e recursos que poderiam ser aplicados ao desenvolvimento de compostos com maior chance de sucesso.
[011] Portanto, ainda existe necessidade de se prover novos e aperfeiçoados insertos de cultura de células capazes de oferecer às células e tecidos um microambiente mimético ao encontrado no corpo humano e, assim, aumentar o potencial de tradução dos resultados encontrados na pesquisa básica.
[012] A presente invenção trata de um modo geral de insertos de cultura de células contendo uma camada de hidrogel para uso em cultura de células em interfaces ar-gel para promover a formação de construções semelhantes a tecidos epiteliais e método de utilização desses insertos.
[013] Os tecidos epiteliais cultivados em interfaces ar-gel de acordo com a presente invenção representam um microambiente mais semelhante ao “in vivo”, quando comparado às monocamadas em sistemas de cultura bidimensionais convencionais ou interfaces ar-líquido.
[014] As células epiteliais estão presentes em diferentes tecidos do corpo, como a pele, o trato digestivo, o trato pulmonar, o trato urinário e as glândulas. Em todos esses tecidos, as células epiteliais repousam sobre uma camada de matriz extracelular que atua como um suporte no qual o epitélio pode proliferar. A camada de hidrogel no inserto de cultura de células de acordo com a presente invenção imita, de forma eficiente, o microambiente no qual as células são naturalmente dispostas.
[015] A presente invenção trata, portanto, de insertos tridimensionais de cultura de células contendo uma camada de hidrogel para cultura de células em interfaces de ar-gel para promover a formação de construções semelhantes a tecidos epiteliais e métodos de utilização desses insertos. Ditos insertos compreendem uma câmara oca com duas regiões distintas - superior e inferior, um enchimento de hidrogel e uma cápsula de sustentação.
[016] Os insertos de acordo com a presente invenção poderão ser melhor entendidos com a descrição das figuras em anexo, as quais de uma forma apenas ilustrativas e não limitativas de seu escopo, representam:
- − Figuras 1A-1E – ilustram uma representação esquemática reconstruída em 3D do inserto de cultura de células objeto da presente invenção sem o hidrogel.
- − Figura 2 – ilustra uma representação esquemática do inserto de cultura celular objeto da presente invenção evidenciando as interfaces ar-gel.
- − Figura 3 – ilustra uma representação esquemática da sequência metodológica em que o inserto está configurado para promover a formação de construções semelhantes a tecidos epiteliais.
[017] As Figuras 1A-1E mostram em representação esquemática tridimensional - 3D as características principais do inserto de cultura de células de acordo com a presente invenção sem o hidrogel. Nestas, pode ser visualizada além do design geral do inserto, também o design do suporte do inserto. Assim, temos na Figura 1A uma vista superior do inserto, na Figura 1B uma vista inferior do inserto, na Figura 1C uma vista lateral do inserto, na Figura 1D uma vista em seção transversal do inserto, e na Figura 1E uma vista em perspectiva geral do inserto.
[018] Mais especificamente se referindo às Figura 2 e 3, observa-se que o inserto de cultura de células de acordo com a presente invenção compreende uma câmara oca com duas porções distintas, sendo uma porção superior (1) e uma porção inferior (2), e uma base de sustentação (3).
[019] A câmara oca possui a porção superior (1) com extremidade aberta no topo e a porção inferior (2) com extremidade perfurada e fechada no fundo (4). A porção superior (1) da dita câmara oca possui paredes laterais inclinadas (11), como o diâmetro da porção superior (12) maior que o diâmetro da porção inferior (13). No topo da dita porção superior (1), na extremidade aberta, são providos um ou mais abas (14) direcionadas para o interior da câmara oca, de modo a facilitar a manipulação do inserto de cultura de células.
[020] A porção inferior (2) da câmara contém paredes laterais perfuradas (21) dotadas de múltiplos orifícios que conectam as superfícies externa e interna das mesmas. Em geral, a título de exemplo, prefere-se que cada orifício tenha diâmetro variando de 100 µm a 2500 µm. Um tampão de hidrogel (6) preenche o volume completo da porção inferior (2) da câmara oca e sobre o qual se dispõem as células (7).
[021] O fundo (4) da câmara oca é perfurado por múltiplos orifícios (5) que conectam as superfícies externa e interna. Em geral, a título de exemplo, preferese que cada orifício tenha diâmetro variando de 100 µm a 2500 µm.
[022] A câmara oca (1, 2) possui base de sustentação (3) dotada de pelo menos duas pernas inclinadas (31, 32) com espaçamentos entre si de modo a permitir o trânsito de fluidos do meio de cultura (8) em direção ao fundo (4) com perfurações (5) da câmara oca (1, 2), atingindo, assim, a camada de hidrogel (6) sobre a qual repousam as células (7). Assim, quando o inserto de cultura de células de acordo com a presente invenção é posicionado dentro da cuba de um vaso (9) de cultura de tecidos, a ponta de cada perna (31, 32) toca a borda do fundo do dito vaso (9) de modo a estabilizar o inserto de cultura de células.
[023] Nota deve ser feita ao fato de que as dimensões exteriores do inserto de cultura de células objeto da presente invenção são suficientemente inferiores às dimensões internas do vaso de cultura de tecidos de forma a permitir que o inserto seja completamente inserido dentro do vaso de cultura de tecidos. O inserto de cultura de células de acordo com a presente invenção pode ser dimensionado para ser adaptado ao uso com diferentes vasos de cultura de tecidos e cubas de diversos tamanhos e configurações geométricas.
[024] O hidrogel utilizado no inserto para cultura de células de acordo com a presente invenção pode ser qualquer do tipo sintético, tal como, por exemplo, aqueles produzidos e escolhido dentre os quais se incluem aqueles produzidos em polietileno glicol, ácido poliacrílico, álcool polivinílico, ácido poliacrílico, poli(metacrilato de metila), poliácido metacrílico, poliacrilamida, polivinilpirrolidona, poliuretano, poli(hidroxietil metacrilato), poli(N-isopropil acrilamida) e poliamida, mas não limitado a estes. Hidrogel natural também pode ser utilizado, tais como, por exemplo, fibrina, colágeno, elastina, gelatina, hidrogéis derivados da matriz extracelular, polipeptídeos, ácido hialurônico, alginato, agarose, quitosana, nanocelulose e polímeros naturais modificados, mas não limitados a estes. Também pode ser utilizados misturas desses hidrogéis ou composições dos mesmos.
[025] Adicionalmente, mas sem limitações, o hidrogel pode ter sua superfície modificada quimicamente para apresentar grupos funcionais químicos, incluindo carbonilos (C = O), álcoois (-OH), ácidos carboxílicos (CO2H), ésteres (CO2R) e aminas (NH2), bem como ter sua superfície biologicamente modificada para apresentar (macro)moléculas biológicas específicas, incluindo anticorpos, enzimas e hormônios.
[026] O hidrogel para utilização no inserto para cultura de células de acordo com a presente invenção pode, ainda, apresentar características de topografia de superfície, incluindo colunas, fossas, ranhuras, hemisférios e grades, dentre outras possíveis.
[027] A presente invenção trata ainda de método de uso do inserto para cultura de células de acordo com a presente invenção, compreendendo a introdução de células alvo no topo do hidrogel (6) e um meio de cultura de células (8) no vaso (9) onde a inserção é incorporada para fazer crescer as células alvo em uma interface de ar-gel.
[028] O método de uso acordo com a presente invenção inclui compostos químicos, bioquímicos ou biológicos que são adicionados ao meio contido no vaso (9), de modo que eles se movam do dito vaso (9) para o hidrogel (6), passem pelo hidrogel (6) e atinjam a cultura de células (7).
[029] Agentes biológicos, por exemplo, príons, vírus, bactérias e protozoários, sem limitação a esses, são adicionados ao meio (8) contido no vaso (9), de modo que eles se movam do vaso (9) para o hidrogel (6), passando pelo hidrogel (6) e alcançando a cultura de células (7). Alternativamente, ou adicionalmente, ditos agentes biológicos podem ser adicionados diretamente às células (7) que crescem no topo do hidrogel (6), sendo os efeitos de tais tratamentos avaliados nas células alvo (7).
[030] Os técnicos versados no assunto apreciarão que inúmeras variações incidindo no escopo da presente invenção são permitidas, sem com isso fugir do escopo inventivo aqui revelado e, dessa forma, reforça-se o fato de que a presente invenção não está limitada às configurações e concretizações particulares acima descritas.
Claims (18)
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, caracterizado por compreender uma câmara oca com duas porções distintas, sendo uma porção superior (1) e uma porção inferior (2), e uma base de sustentação (3), dita porção superior (1) possuindo extremidade aberta no topo e dita porção inferior (2) possuindo paredes laterais perfuradas (21) e sendo fechada no fundo (4) também perfurado (5), dotado de um tampão de higrogel (6) sobre o qual se dispõe as células (7).
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porção superior (1) da dita câmara oca possui paredes laterais inclinadas (11), como o diâmetro da porção superior (12) maior que o diâmetro da porção inferior (13).
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que dita porção superior (1) possui extremidade superior aberta onde são providas uma ou mais abas (14) direcionados para o interior da câmara oca.
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ditas paredes laterais perfuradas (21) são dotadas de múltiplos orifícios com diâmetro variando de 100 µm a 2500 µm.
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito tampão de hidrogel (6) preenche o volume completo da porção inferior (2) da câmara oca.
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ditos múltiplos orifícios (5) do fundo (4) da câmara oca possuem diâmetro variando de 100 µm a 2500 µm.
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita base de sustentação (3) é dotada de pelo menos duas pernas inclinadas (31, 32) com espaçamentos entre
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ditas pernas inclinadas (31, 32) são tais que tocam a borda do fundo de uma cuba de vaso (9) de cultura de tecidos.
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 5, caracterizado pelo fato de que o hidrogel é do tipo sintético e escolhido dentre os quais se incluem aqueles produzidos em polietileno glicol, ácido poliacrílico, álcool polivinílico, ácido poliacrílico, poli(metacrilato de metila), poliácido metacrílico, poliacrilamida, polivinilpirrolidona, poliuretano, poli(hidroxietil metacrilato), poli(N-isopropil acrilamida) e poliamida, suas misturas ou composições contendo os mesmos.
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 5, 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o hidrogel é uma mistura do tipo sintético com tipo natural.
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 5, caracterizado pelo fato de que o hidrogel é do tipo natural e escolhido dentre os quais se incluem aqueles produzidos em fibrina, colágeno, elastina, gelatina, hidrogéis derivados da matriz extracelular, polipeptídeos, ácido hialurônico, alginato, agarose, quitosana, nanocelulose e polímeros naturais modificados, suas misturas ou composições contendo os mesmos.
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 5, 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o hidrogel tem sua superfície modificada quimicamente para apresentar grupos funcionais químicos, incluindo carbonilos (C = O), álcoois (-OH), ácidos carboxílicos (CO2H), ésteres (CO2R) e aminas (NH2).
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 5, 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o hidrogel tem sua superfície modificada biologicamente para apresentar (macro)moléculas biológicas específicas, incluindo anticorpos, enzimas e hormônios.
- INSERTO DE CULTURA DE CÉLULAS CONTENDO HIDROGEL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 5, 9 a 13, caracterizado pelo fato de que o hidrogel apresenta características de topografia de superfície, incluindo colunas, fossas, ranhuras, hemisférios e grades.
- MÉTODO DE USO, de inserto de cultura de células contendo hidrogel conforme definido nas reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende:
- − introduzir as células alvo no topo do hidrogel (6),
- − introduzir um meio de cultura de células (8) no vaso (9),
- − introduzir compostos químicos, bioquímicos ou biológicos ao meio de cultivo de células (8) contido no vaso (9),
- − deixar que ditos compostos químicos, bioquímicos ou biológicos se movam do dito vaso (9) para o hidrogel (6) até atingir a cultura de células (7).
- MÉTODO DE USO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os compostos biológicos são escolhidos dentre príons, vírus, bactérias e protozoários.
- MÉTODO DE USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que os compostos químicos, bioquímicos ou biológicos são adicionados diretamente às células (7) que crescem no topo do hidrogel (6).
- MÉTODO DE USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que os efeitos de tais tratamentos são avaliados nas células objeto do estudo.
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