CN116515631A - 细胞培养容器、细胞培养装置及细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及细胞核检测技术领域，具体涉及细胞培养容器、细胞培养装置及细胞培养方法。该细胞培养容器包括微腔体阵列、基底、进口和出口。微腔体阵列具有多个微腔体，微腔体具有第一开口、第二开以及于第一侧壁，第一开口具有第一宽度，第二开口具有第二宽度，第一宽度大于第二宽度以将细胞限制在微腔体中。通过该细胞培养容器、细胞培养装置及细胞培养方法，提供三维细胞球体更好的生长环境和条件，使得其更接近其体内的三维生长环境，细胞的生长状态更佳，尤其是在培养干细胞时能够最大程度地保持干细胞的“干性”，也即减少其“自发”分化趋势。
Description
技术领域
本申请涉及细胞核检测技术领域，具体涉及细胞培养容器、细胞培养装置及细胞培养方法。
背景技术
细胞培养容器(例如细胞培养瓶，25cm2、75cm2、175cm2和225cm2)可提供用于培养细胞的无菌微腔体。在一些实施方式中，培养细胞可提供关于疾病和毒理学研究，药剂和治疗的功效，肿瘤特性、生物体、遗传学以及细胞和与细胞相关的其他科学、生物学和化学原理的信息。在培养期间，细胞培养容器提供无菌、液体不可渗透的微腔体来容纳细胞。
微腔体或细胞生长室可包括底表面、顶表面和具有表面的侧壁。这些表面中的至少一个表面可适于细胞生长。例如，为了建立球体细胞培养的基础，细胞生长表面可包括多个微腔体(例如，微米尺寸的孔、亚毫米尺寸的孔穴)，它们例如以阵列排列。细胞生长表面可与细胞培养瓶一体，或者可以是放置在或固定在细胞生长室中的单独的基材。顶表面、底表面、一个或多个侧表面或它们的组合可包括成阵列的微腔体。例如，微腔体可以波状或正弦形状形成，从而形成具有圆化顶部和圆化底部的微腔体或微孔穴。在一些实施方式中，细胞培养瓶可填充有促进三维细胞培养物(例如细胞团、球体)的生长的材料(例如，培养基、固体、液体、气体)。例如，可向细胞培养室添加包含细胞并且细胞悬浮在液体中的培养基。悬浮的细胞可被聚集在多个微腔体中并且可形成(例如，生长)为细胞组或细胞簇。成组或成簇的细胞在三个维度上生长以形成三维细胞或细胞团或细胞体，其能够大致呈球状，因此在本文中可被称为球体或类器官。
在一些现有技术中，提供的细胞培养表面具有微腔体阵列的细胞培养室可用于培养球体阵列，并且每个球体位于其自身的微腔体中。例如，CN111094535A8公开了一种细胞培养容器具有侧壁和底表面。在实施方式中，底表面是具有多个微腔体的细胞培养表面。在实施方式中，细胞培养表面是附接于侧壁的基材。在实施方式中，侧壁附接于基材，使得围绕细胞培养表面的周围没有平坦表面。其说明书干公开了，多个微腔体320中的每个微腔体320a、320b、320c可包括限定孔穴322a、322b、322c的凹表面321a、321b、321c以及开口323a、323b、323c。液体通过开口323a、323b、323c进入和离开微腔体。在细胞培养室中没有平坦区域用于细胞沉降在上面。这对于确保细胞不沉降在微孔穴之外的细胞培养室中是重要的。当细胞在微孔穴之外沉降在细胞培养表面之外的平坦区域上时，细胞可生长为不规则的细胞聚集团801(参见图35A和35B、36A和36B)，并且在容器中产生不均匀的多细胞三维结构群。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。由此可见，其公开了一种通过在细胞培养表面设置非平坦区域，以避免形成不规则细胞聚集团，以更有利于细胞进行三维生长。
然而，对于一些干细胞在这些非平坦区域的细胞培养表面培养时，其干细胞容易丧失自我更新能力、易老化，或“自发性”分化成为骨细胞、间质细胞或脂肪细胞，不利于干细胞的长期体外培养，例如，Kim J，Jin W K，Park J H，et al.Biologicalcharacterization of long-term cultured human mesenchymal stem cells[J].Archives of Pharmacal Research，2009，32(1):117-126.)也有发现。
发明内容
本申请发明人创造性地发现，在培养容器中形成一个能够透气、但不能透过液体的封闭的培养空间，并在内部形成具有第一开口和第二开口的微腔体形成阵列，能够有效抑制干细胞的“自发”性分化，提高细胞干性，对于干细胞体外培养具有非常显著的积极应用前景。
为此，本申请实施例至少公共了以下技术方案：
第一方面，本申请实施例公开了一种细胞培养容器，包括：
至少一微腔体阵列，其具有多个微腔体，所述微腔体具有第一开口、第二开口以及于所述第一开口和所述第二开口之间延伸的第一侧壁，所述第一开口具有第一宽度，所述第二开口具有第二宽度，第一宽度大于第二宽度以将细胞限制在所述微腔体中；
基底，其提供形成所述微腔体阵列的结构基础；
进口，其在所述细胞培养容器的一侧上提供了通到所述微腔体的口；
出口，其在所述细胞培养容器的相对侧上提供了通到所述微腔体的口；
其中，所述基底包括：
第一支撑件，具有多个通孔和两个相互平行的表面，所述通孔贯通所述第一支撑件的两个表面以形成所述微腔体阵列；
第二支撑件，连接所述第一支撑件，并与所述第一支撑件围合形成至少一个培养空间。
在本申请实施例中，第一宽度的尺寸为100μm至约5000μm，第二宽度的尺寸为15μm至约50μm。
在本申请实施例中，所述第二支撑件由气体可渗透、液体不可渗透的材料构成，所述第二支撑件封堵于所述通孔的两端并在所述通孔内形成一个培养空间，所述微腔体包裹于所述培养空间中。
在本申请实施例中，第一支撑件包括用于围合形成所述通孔的通孔壁，所述通孔壁包括所述第一侧壁和第二侧壁；
所述第一侧壁由所述第一开口向所述第二开口延伸收窄形成，所述第二侧壁连接所述第一侧壁；
所述第一侧壁和所述第二侧壁表面均形成有无粘性涂层。
在本申请实施例中，所述第一开口外周处形成台阶，所述台阶在所述第一支撑的厚度方向与所述第一开口的形状适应，且所述台阶的尺寸大于所述第一开口的尺寸。
在本申请实施例中，包括多个于竖直方向层叠的微腔体阵列，上层的所述微腔体的第二开口于竖直方向对应于下层的所述微腔体的所述第一开口。
在本申请实施例中，所述细胞培养容器还包括：
第三支撑件，所述第三支撑件连接所述培养空间，并形成至少一个所述进口和至少一个所述出口，用于向所述培养空间内灌入和/或灌出细胞和/或细胞培养液。
在本申请实施例中，所述第三支撑件由所述第一支撑件的外周边缘延伸形成，并且内部中空。
第二方面，本申请实施例公开了一种细胞培养装置，包括：
至少一个第一方面所述细胞培养容器；以及
至少两个立管组件，所述立管组件具有至少一个连接部，所述连接部用于将所述第三支撑件形成的所述进口和/或所述出口连接至所述立管组件中。
第三方面，本申请实施例公开了一种人胎盘间充质干细胞的三维培养方法，采用第一方面所述的细胞培养容器或第二方面所述的细胞培养装置培养，所述三维培养方法包括：
通过所述进口将含有细胞和培养基的液体引入细胞培养室中；
使细胞通过沉降到微腔体中；以及
培养细胞。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：
本申请实施例提供的细胞培养容器，其通过具有第一开口、第二开口以及于第一开和第二开口之间延伸的第一侧壁的微腔体去容纳三维细胞球体，相当于在三维细胞球体的两端分别形成了便于液体流入或流出微腔体的通道，从而通过进口向培养空间中注入三维细胞培养物(例如细胞团、球体)或细胞培养液，通过出口从培养空间中导出细胞代谢物或培养废液。该细胞培养容器提供三维细胞球体更好的生长环境和条件，使得其更接近其体内的三维生长环境，细胞的生长状态更佳，尤其是在培养干细胞时能够最大程度地保持干细胞的“干性”，也即减少其“自发”分化趋势。
附图说明
图1为现有技术提供的细胞培养容器结构示意图(下方图为上方图中圆圈处的放大图)。
图2为本申请实施例提供的细胞培养容器平面结构示意图。
图3为图2中A处一种结构示意图。
图4为图2中A处一种结构示意图。
图5为本申请实施例提供的细胞培养容器平面结构示意图。
图6为图5中B处一种结构示意图。
图7为本申请实施例提供的细胞培养容器立体结构示意图，图中虚线结构为一个微腔体阵列的结构。
图8为本申请实施例提供的一个微腔体阵列的立体结构示意图。
图9为本申请实施例提供的一个微腔体阵列的立体结构示意图。
图10为本申请实施例提供的细胞培养装置平面结构示意图。
图11为本申请实施例提供的阀平面结构示意图(关闭状态)。
图12为本申请实施例提供的阀平面结构示意图(打开状态)。
图13为分别采用本申请实施例1～2和对比例1～4提供的细胞培养容器培养人胎盘间充质干细胞后的干性转录因子mRNA相对表达量结果图。
附图标记：
细胞培养容器100、细胞培养室103、微腔体160(图1中)；
微腔体阵列110、微腔体111、第一开口112、第一宽度112a、第二开口113、第二宽度113a、第一侧壁114、第一侧壁的厚度尺寸114a、第二侧壁115、第二侧壁的厚度尺寸115a/115c、第二侧壁的宽度尺寸115b/115d、台阶1150、台阶的最大宽度尺寸1150a、基底120、第一支撑件122、通孔1200、表面122b、培养空间1201、通孔壁1220、长方体1202、第二支撑件123、第三支撑件124、中空壳体1240、分割腔1241、进口130、出口140、立管组件200、连接部201、管腔体202、连接口203、泵300、阀400、阀螺母401、连接套402、阀空间4020、突出部4021、阀球403、密封圈404、连接螺母405、软管500、三维细胞球体600、细胞培养装置800。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
应当理解，当元件被称为“连接”到另一元件时，它可直接连接或耦合到另一元件或者可存在中间元件。相较之下，当元件被称为“直接连接”到另一元件时，不存在中间元件。用于描述元件之间的关系的其它措辞可以以类似的方式解释(例如，“在…之间”与“直接在…之间”、“相邻”与“直接相邻”等)。
这里使用的术语仅是用于描述特定实施例的目的并且不旨在限制示例性实施例。如这里所用的，单数形式“一”、“一个”和“一种”也旨在包括复数形式，除非上下文清楚地另外指明。还应当理解，术语“包括”、“包含”在这里使用时表明存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或部件，但是不排除存在或增加一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、元件、部件和/或其群组。
除非另行定义，这里使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与示例性实施例所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。还应当理解，例如在常用字典中定义的那些术语应当解释为具有与在相关技术的语境中它们的含义一致的含义，并且不应当以理想化或过分正式的意义来解释，除非这里明确地这样定义。
本领域技术人员应当理解，本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
需要注意的是，本申请实施例所描述的“上”、“下”、“左”、“右”等方位词是以附图所示的角度来进行描述的，不应理解为对本申请实施例的限定。此外，在上下文中，还需要理解的是，当提到一个元件连接在另一个元件“上”或者“下”时，其不仅能够直接连接在另一个元件“上”或者“下”，也可以通过中间元件间接连接在另一个元件“上”或者“下。在本申请实施例的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”、“第五”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
现在将参照附图更全面地说明各示例性实施例，附图中图示了一些示例性实施例。图中，为了清楚起见，线、层和/或区域的厚度可以放大。因此，尽管示例性实施例能够采取各种修改和替代形式，附图中通过示例的方式示出其实施例，并且这里将详细说明。然而，本领域技术人员应当理解，没有将示例性实施例限定为所公开的特定形式的意思，而是相反，示例性实施例旨在覆盖落在本发明的范围内的所有修改、等同物和替代。贯穿附图的说明，相同的附图标记是指相同或相似的元件。
相较于二微培养方式(如细胞培养皿，96孔板等方式)，三维细胞培养方法能够产生多细胞结构，其在生理学上更精确，并且相比于实验室中的模拟条件更逼真地代表细胞可在实际生命应用中存在和生长的环境。例如，发现三维细胞培养物更接近地提供模拟“体内”(即，在活体内，在真实环境中)细胞生长的真实环境；而发现二维细胞培养物提供模拟“体外”(即，在玻璃中，在实验室环境中)细胞生长的环境，其不能那么好地代表实验室外发生的真实环境。通过与三维细胞培养物的相互作用以及观察其性质和行为，可实现关于以下方面的细胞理解的进步，例如，疾病和毒理学研究，药剂和治疗的功效，肿瘤特性、生物体、遗传学以及细胞和与细胞相关的其他科学、生物学和化学原理。
图1示出了现有的细胞培养容器中的微腔体阵列中的微腔体的结构，其导致了不均匀的细胞培养方式。例如在细胞培养室103中容纳的三维细胞球体600可以沉降并且具有微腔体160中，但是由于微腔体160成孔穴结构，当三维细胞球体600沉降在微腔体160中，三维细胞球体600几乎将孔穴结构的微腔体160填满，液体仅能从微腔体160的上端流动进入或流出该微腔体160，微腔体160内部的液体(例如与三维细胞球体600之间间隙或三维细胞球体600所需液体或代谢产生的液体)向微腔体160外部流动受阻。通过在微腔体160形成的微腔体阵列160上方的液体流动或扰动，对微腔体160内部的液体流动干预作用较小，从而在需要为三维细胞球体600提供新鲜的培养液或者需要排除其代谢产生的废液时，不利于液体的流动。
为此，如图2～9所示，本申请实施例公开了一种细胞培养容器100，其包括至少一个微腔体阵列110、基底120、进口130和出口140。微腔体阵列110具有多个微腔体111，微腔体111具有第一开口112、第二开口113以及于第一开口112和第二开口113之间延伸的第一侧壁114，第一开口112具有第一宽度112a，第二开口113具有第二宽度113a，第一宽度112a大于第二宽度113a以将细胞限制在微腔体111中。基底120提供形成微腔体阵列110的结构基础。进口130在细胞培养容器100的一侧上提供了通到微腔体111的口。出口140在细胞培养容器100的相对侧上提供了通到微腔体111的口。其中，基底120包括第一支撑件122和第二支撑件123。第一支撑件122具有多个通孔1200和两个相互平行的表面122b，多个通孔1200贯通第一支撑件122的两个相互平行的表面122b以形成微腔体阵列110。第二支撑件123连接第一支撑件122，并与第一支撑件122围合形成至少一个培养空间1201。
本申请实施例提供的细胞培养容器100，其通过具有第一开口112、第二开口113以及于第一开口112和第二开口113之间延伸的第一侧壁114的微腔体111去容纳三维细胞球体600，相当于在三维细胞球体600的两端分别形成了便于液体流入或流出微腔体111的通道，从而通过进口130向培养空间1201中注入三维细胞培养物(例如细胞团、球体)或细胞培养液，通过出口140从培养空间1201中导出细胞代谢物或培养废液。该细胞培养容器100提供三维细胞球体600更好的生长环境和条件，使得其更接近其体内的三维生长环境，细胞的生长状态更佳，尤其是在培养干细胞时能够最大程度地保持干细胞的“干性”，也即减少其“自发”分化趋势。如图13所示，图1中的方式(对比例1)，采用图1提供的微腔体160结构进行人胎盘间充质干细胞的培养，其细胞自我更新能力减弱，有“自发”分化为脂肪细胞的趋势，并且，细胞的干性转录因子其Nanog、Sox2和Oct4相对表达量均低于实施例1和2，细胞干性降低。而采用图2提供的微腔体111结构(实施例1～2)进行人胎盘间充质干细胞的培养，细胞能够长期自我更新，代谢功能正常，分化趋势减弱，利于对该干细胞长期培养，对于体外干细胞培养具有显著优势。
在一些实施例中，第一开口112意指微腔体111的一端开放部位，而不是封闭的结构。第一开口112具有的第一宽度112a是指靠近微腔体111一端的最小宽度，例如如图2～4所示，第一宽度112a可以是微腔体111的第一开口112的边缘最小宽度，也可以是第一开口112靠近第一侧壁114内部最小宽度。同样地，第二开口113意指微腔体111相对一端开放部位，而不是封闭的结构。第二开口113具有的第二宽度113a可以是靠近微腔体111相对一端的最小宽度(例如，第二开口113大致呈矩形)，如图3、4所示，第二宽度113a还可以是微腔体111的第二开口113边缘的一般宽度(例如，第二开口113大致呈圆形)。在一些实施例中，第二宽度113a应当具有一定的限度，以便于将三维细胞培养物(例如细胞团、球体)保持在微腔体111内。
由于在培养细胞时，容器可填充有促进三维细胞培养物(例如细胞团、球体)的生长的材料(例如，培养基、固体、液体、气体)。例如，可向容器的细胞培养室添加包含悬浮在液体中的细胞的培养基。悬浮的细胞可被聚集在多个微腔体中并且可形成(例如，生长)为细胞组或细胞簇，形成三维细胞球体600。这些三维细胞球体600可具有约50μm至约5000μm的尺寸(例如直径)，以及在约50μm至约5000μm范围内涵盖的任何尺寸或尺寸范围。在一些实施方式中，可提供比所公开的确切尺寸更大或更小的尺寸，因此，除非另有说明，否则比所公开的确切尺寸更大或更小的尺寸被认为是在本公开的范围内。在一些实施例中，人胎盘间充质干细胞形成的三维细胞球体600尺寸(例如)直径在50～200μm之间。
在一些实施方式中，为适应这些球体或类器官球体的尺寸，第一宽度112a的尺寸应当大于球体的尺寸，第二宽度113a的尺寸应当小于球体的尺寸。例如，第二宽度113a可以是约15μm至约50μm的尺寸，例如15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm，在10μm至50μm的范围中涵盖的任何尺寸或尺寸范围。第一宽度112a可以是包括约100微米(μm)至约5000μm的尺寸。在一些实施方式中，第一宽度112a可包括以下尺寸：100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm、1500μm、2000μm、2500μm、3000μm、3500μm、4000μm、4500μm、5000μm，在约100μm至约5000μm的范围中涵盖的任何尺寸或尺寸范围。
在一些对比例中，第二宽度113a的尺寸约为10～20μm，例如(对比例2)，采用具有10μm尺寸第二宽度113a的微腔体111构造的细胞培养容器100对人胎盘间充质干细胞形成的三维细胞球体600进行培养，结果细胞的生长更新速度受限，并且，细胞的干性转录因子其Nanog、Sox2和Oct4相对表达量均低于实施例1和2，细胞干性降低。在一些对比例中，第二宽度113a的尺寸约为70μm～200μm，例如(对比例3)，采用具有70μm尺寸的第二宽度113a的微腔体111构造的细胞培养容器100对人胎盘间充质干细胞形成的三维细胞球体600进行培养，结果三维细胞球体600在注入至为微腔体111的2h后存在形变，有球体的部分由于重力作用或者细胞生长迁移作用或其他原因从第二开口113中溢出，并且，细胞的干性转录因子其Nanog、Sox2和Oct4相对表达量均低于实施例1和2，细胞干性降低。
在一些实施例中，如图3、4所示，第二支撑件123对通孔1200的两端进行封堵，以在通孔1200内形成一个培养空间1201，而微腔体111包裹于培养空间1201内。如此，通过向培养空间1201内注入三维细胞球体600或培养液，能够将三维细胞球体600注入并保持在微腔体111中，从而使得细胞更便于以培养空间1201内的营养液，同时也更方便排除废液。第二支撑件123由气体可渗透、液体不可渗透的材料构成。使用这种材料增加了气体通过气体可渗透、且液体不可渗透的材料进入到容纳球体的微腔体111中进行气体交换。这种气体可渗透材料使得容器更加通用。例如，如果以非灌注模式使用，则在无灌注培养基的情况下，细胞接触氧气。然而，如果灌注系统处于运行中，则氧气可被输送至溶于循环培养基的细胞。由此，容器既可用作灌注系统又可用作静态系统。
气体可渗透、液体不可渗透的第二支撑件123可以由本领域已知的一个或多个膜组成。用作膜的合适材料包括例如：聚苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚烯烃、乙烯乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚砜、聚四氟乙烯(PTFE)或相容的含氟聚合物、硅橡胶或共聚物、聚(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯)或这些材料的组合。膜可以具有任何厚度，优选在约25μm和250μm之间，但理想地在约25μm和125μm之间。膜允许气体在培养空间1201内部和外部环境之间自由交换，并且可以采用任何尺寸或形状，只要膜支持细胞生长即可。
在一些实施例中，第一支撑件122包括用于围合形成所述通孔1200的通孔壁1220。通孔壁1220包括第一侧壁114和第二侧壁115。第一侧壁114由第一开口112向第二开口113延伸收窄形成。第二侧壁115连接第一侧壁114。在一些实施例中，第一侧壁114围合形成微腔体111，第一侧壁114的第一端形成第一开口112、另一端形成第二开口113。第二侧壁115具有两个，一个由第一开口112延伸至通孔1200的一端，另一由第二开口113延伸至通孔1200的另一端。如此，将微腔体111包裹在培养空间1201中央，起到了对微腔体111中细胞的很好保护作用，也能减少对细胞培养的干扰。
在一些实施例中，第一侧壁114由第一开口112向第二开口113延伸收窄，使得形成的微腔体大致梯形。第一侧壁114由第一开口112只第二开口113的深度尺寸114a大致为三维细胞球体600的尺寸(例如直径)的1.5～5倍。
在一些实施例中，由第一开口112延伸至通孔1200一端的第二侧壁115的厚度尺寸(如图中115a)大致为约1000微米(μm)至约10000μm的尺寸，其宽度尺寸(如图中115b)大致为约3000微米(μm)至约10000μm的尺寸，其厚度尺寸115a和宽度尺寸115b可以在上述限定的范围内任意选择。同样地，由第二开口113延伸至通孔1200另一端的第二侧壁115的厚度尺寸115c大致为为约2000微米(μm)至约5000μm的尺寸，其宽度尺寸115d大致为约3000微米(μm)至约10000μm的尺寸，其厚度尺寸115c和宽度尺寸115d可以在上述限定的范围内任意选择。在这些实施例中，由第二开口113延伸至通孔1200另一端的第二侧壁115的厚度尺寸115c大致为由第一开口112延伸至通孔1200一端的第二侧壁115的厚度尺寸115a的1.5～2倍。
在一些对比例4中，由第二开口113延伸至通孔1200另一端的第二侧壁115的厚度尺寸115c等于由第一开口112延伸至通孔1200一端的第二侧壁115的厚度尺寸115a。例如，如图13所示，厚度尺寸115a和115c均为1000μm，采用如此厚度尺寸的第二侧壁115以构造第一支撑件122，并形成细胞培养容器100，并对人胎盘间充质干细胞形成的三维细胞球体600进行培养，结果细胞的生自我更新能力不如采用实施例1提供的细胞培养容器，细胞的干性转录因子其Nanog、Sox2和Oct4相对表达量均低于实施例1和2，出现了不可能避免的“自发”分化为脂肪细胞的趋势,。
在一些实施例中，第二侧壁115由第一开口112延伸至通孔1200一端延伸形成的截面形状和由第二开口113延伸至通孔1200另一端形成的截面形状均大致成梯形或喇叭形。在一些实施例中，围合形成微腔体111的第一侧壁114为大致成具有两个缺口(即第一开口112和第二开口113)圆形、椭圆形、抛物线形、双曲线形、人字形、倾斜的或其他截面轮廓形状中的一种或多种形状。在一些实施例中，第二侧壁115包括在第一开口112的外周形成的台阶1150，如此对对于未落入微腔体111的三维细胞球体600起到阻挡作用，以保证仅有一个或少量几个三维细胞球体600落入微腔体111，减少三维细胞球体600微腔体111内的堆积。
在一些实施例中，如图8、9所示，一个微腔体阵列110包围该微腔体阵列1201的培养空间大致成长条形分布，镶嵌于图8、9中的长方体中。如此，当向该长方体1202中的培养空间1201的一端内注入三维细胞球体或培养液时，细胞或培养液能够充满该培养空间1201和各个微腔体111，而三维细胞球体600能够自动落入并保持在微腔体111中。
在一些实施例中，第一侧壁114和第二侧壁115的表面均形成有无粘性涂层，这些涂层对细胞具有超低结合性，能够避免细胞粘附，对细胞形成一种排斥作用，无粘性涂层的材料可选择全氟聚合物，烯烃，琼脂糖，非离子性水凝胶，例如聚丙烯酰胺，聚醚，例如聚环氧乙烷，多元醇，例如聚乙烯醇，或者它们的混合物。
在一些实施例方式中，在图8、9中所示的长方体1202中大致布置一个微腔体阵列110，其包括线性阵列、对角阵列、矩形阵列、圆形阵列等。在一些实施例中，如图5、6、9所示，每一第一开口112外周处均形成一台阶1150。在一些实施例中，台阶1150在第一支撑件122的厚度方向与第一开口112的形状适应，且略大于第一开口112的尺寸，例如，第一开口112的尺寸(第一宽度112a)约为200μm，台阶1150的最大宽度尺寸1150a(例如直径)为250μm。
在一些实施例中，细胞培养容器100包括多个于竖直方向层叠的微腔体阵列110，上层的微腔体111的第二开口113于竖直方向对应于下层的微腔体111的第一开口112。如此形成的多层微腔体阵列110，能够扩大细胞培养量，对其进行高通量的三维培养。在这些实施例中，第二支撑件123可以覆盖在最上一层微腔体阵列110上表面和最下一层微腔体阵列110下表面，如此将多层微腔体阵列110包裹在中间，形成一个包裹有多层微腔体阵列110的培养空间1201。如此设置不仅能增加对三维细胞球体600的培养量，还能便于从该细胞培养容器100的侧方注入或排斥三维细胞球体600及其培养液。
进而，在一些实施例中，细胞培养容器100还包括第三支撑件124。第三支撑件124连接培养空间1201，并形成至少一个进口130和至少一个出口140，用于向培养空间1201内灌入和/或灌出细胞和/或细胞培养液。
在一些实施例中，第三支撑件124由第一支撑件122的外围边缘延伸形成，并且内部中空。优选地，如图7所示，第三支撑件124从第一支撑件122的两个侧边外围边缘延伸形成一个中空的壳体构造，并且在其两边分别封闭后形成至少一个进口130和至少一个出口140，进口130竖直向上弯折，出口140竖直向下弯折。优选地，如图7所示，第三支撑件124从第一支撑件122形成每一大致长方体1202(大致成长方体形状，如图8、9所示)的侧边外围边缘延伸形成一个中空壳体1240，并且从其一边向上弯折形成进口130，另外一侧边外围边缘延伸形成另一中空壳体，并且从另一边向下弯折形成出口140。优选地，如图所示，第三支撑件124从第一支撑件122的一个侧边外围边缘延伸形成一个中空壳体1240，第三支撑件124还包括在中空壳体1240内部形成的与每一大致长方体1202侧边对应的分割腔1241。从而，当向第三支撑件124内部注入或灌出三维细胞球体600或液体时，能够使得这些液体从这些分割腔1241中均匀分布至每一大致长方体1202对应的培养空间1201中，从而便于均匀向培养空间1201内的微腔体阵列110注入液体或三维细胞球体600。
本文中，细胞培养容器100中的第一支撑件122和第三支撑件124可由某种材料制造一体成型，所述材料包括但不限于聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚苯乙烯共聚物、含氟聚合物、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯丁二烯共聚物、完全氢化的苯乙烯类聚合物、聚碳酸酯PDMS共聚物和聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚丙烯共聚物和环烯烃共聚物。在附图中，第一支撑件122、第二支撑件123和第三支撑件124例示为由清澈(例如透明)材料制造，可先将第一支撑件122和第三支撑件124铸造成型，在将由透明或半透明的膜材料构成的第二支撑件122胶黏形成细胞培养容器，以便于对细胞培养容器100内的细胞培养状态进行观察和拍照。
微腔体阵列110的第一开口112、第二开口113、第一侧壁114、第二侧壁115、台阶1150等微观细胞培养表面可以通过例如胶粘、激光蚀刻、超声焊接、3D打印或某种其他方法结合于细胞培养容器的壁。例如，通过向一个平板型的基材(第一支撑件122的前身)的厚度方向照射和扫描，对基材进行激光蚀刻，等间距地(例如5000μm)形成如上所示的培养空间1201，然后再形成台阶1150，然后再台阶1150中心逐步扫描和激光照射形成规则的微腔体111，最终形成微腔体111。最后再将现有的第二支撑件123(例如透明聚丙烯模板胶合至第一支撑件122的两个表面上)，从而完成对细胞培养容器100的构造过程。在本实施方式中，在利用激光来形成第一开口112、第二开口113、第一侧壁114、第二侧壁115、台阶1150等微观细胞培养表面时，激光光源使用CO2激光，激光以输出10W、照射速度6100mm/min进行脉冲照射。另外，通过调节激光的照射位置、输出量等照射条件，能够调节接近的微观细胞培养表面的尺寸，例如，第一宽度112a、第二宽度113a、第一侧壁114的厚度尺寸114a、第二侧壁115的厚度尺寸115c等。
另外，如图10，本申请实施例还提供了一种细胞培养装置800，其包括上述实施例提供的细胞培养容器100和至少两个立管组件200。每一立管组件200具有至少一个连接部201，用于将第三支撑件124的进口130或出口140连接至所述立管组件200中。在一些实施例中，立管组件200还包括一立式的管腔体202，管腔体202沿竖直方向均匀分布多个连接部201，与便于将多个细胞培养容器100连接层叠连接在两个立管组件200之间，组装形成一个细胞培养装置800。如图10所示，细胞培养装置800还可以包括泵300、阀400和软管500，以便于与细胞培养容器100、立管组件200组成一连接的细胞培养系统，能够持续向细胞培养容器100中灌入或泵出液体。
在一些实施例中，如图7，由第三支撑件124在进口130和出口140处均形成管状体，连接部201包括在管腔体201上竖直方向均匀形成多个连接口203，进口130或出口140形成的管状体通过密封圈404和覆盖连接口203与进口130或出口140形成的管状体的连接螺母405紧密连接，同时也便于对细胞培养容器100进行拆卸。
在一些实施例中，如图11、12所示，阀400还包括设置于连接部201的阀螺母401、连接套402、阀球403。连接套402成套管状，两端外壁形成有外螺纹，内壁形成一个能够将阀球403限制在内并使得阀球403沿其中心轴线移动的阀空间4020，并且阀球403直径小于阀空间4020径向的直径，使得阀球403在移动至阀空间4020中央时，能够使得其与阀空间4020内壁的孔隙能够流动液体。例如，连接套4020的内壁在两端形成突出部4021，以将阀球403限制在阀空间4020内。其中，阀球403由永磁体制成，阀螺母401一部分或全部由永磁体制成。阀螺母401与连接套402外壁中间部位螺纹连接，阀螺母401的通过其与阀球403的磁相互排斥作用，使得阀球403在阀空间4020内移动，比如抵靠在突出部4021上，以切断液体的流通。
在一些实施例中，多个细胞培养容器100通过如图10或11所示的结构与立管组件连接从而能够将这些细胞培养容器100进行单独控制。例如单独填充细胞或培养液，能够实现高通量细胞培养更方便，也能在其他细胞培养容器100培养过程中，将其中某一细胞培养容器100从细胞培养装置800中取出，便于进行细胞收集、细胞观察和检测等活动。
另外，本申请实施例还提供了一种在所述的细胞培养容器中培养细胞的方法，包括通过进口130将含有细胞和培养基的液体引入细胞培养室中；使细胞通过重力沉降到微腔体111中；以及培养细胞。
下方将应用上述的细胞培养容器100及细胞培养装置800进行人胎盘间充质干细胞的培养。
(实施例1)
通过激光刻蚀如图2所示的细胞培养容器100，其第一开口112的第一宽度112a尺寸为250μm，第二开口113的第二宽度113a尺寸为40μm，台阶1150的最大宽度尺寸1150a为350μm，第一侧壁114的厚度尺寸114a为250μm。由第一开口112延伸至通孔1200一端的第二侧壁115的厚度尺寸115a为1500μm，其宽度尺寸115b为5000μm。由第二开口113延伸至通孔1200另一端的第二侧壁115的厚度尺寸115c为2000μm，其宽度尺寸115d为7000μm。
人脐带间充质干细胞购自武汉普诺赛公司，货号：CP-H204，规格：5×105Cells/T25培养瓶。采用人间充质干细胞无血清培养基(货号：CM-SC01，武汉普诺赛公司)对其进行培养。
先将T25培养瓶中的细胞溶液从进口130灌入中细胞培养容器100的培养空间1201中，直至出口140流出液体，例如可将细胞培养容器100与立管组件200、泵300、阀400、软管500组成成细胞培养装置800，以便于对其进行无菌罐装，待细胞溶液灌入后，将细胞培养容器100置于水平台面上静置于95％空气、5％ CO2的环境中培养，期间可每2～3填更换一次新鲜培养基，连续培养8天后，收获细胞，检查细胞干性。
其中，细胞干性以其干性转录因子的表达量进行评价，采用RT-PCR方法对其干性转录因子Nanog、Sox2和Oct4的表达量进行检测。采用PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒(全式金，北京)进行，其中以GAPDH为内参，以2-ΔΔCT计算得到各组基因的相对表达量，每个实验重复5次。其中，检测GAPDH的引物为F1:GGAAAGCTGTGGCGTGAT,SEQ ID NO.1所示，R1:AAGGTGGAAGAATGGGAGTT,SEQ ID NO.2所示。检测Nanog的引物为F2:AAAGAATCTTCACCTATGCC,SEQ ID NO.3所示，R2:GAAGGAAGAGGAGAGACAGT,SEQ ID NO.4所示。检测Sox2的引物为F3:TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA,SEQ ID NO.5所示，R3:CTGGGGCTCAAACTTCTCTC,SEQ ID NO.6所示。检测Oct4的引物为F4:CCCCTGGTGCCGTGAA,SEQID NO.7所示，R4:GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG,SEQ ID NO.8所示。结果如图13所示，其Nanog、Sox2和Oct4相对表达量大致为1650、1200和93左右。
(实施例2)
通过激光刻蚀如图1所示的细胞培养容器100，其第一开口112的第一宽度112a尺寸为250μm，第二开口113的第二宽度113a尺寸为50μm，台阶1150的最大宽度尺寸为350μm，第一侧壁114的深度尺寸114a为350μm。由第一开口112延伸至通孔1200一端的第二侧壁115的厚度尺寸115a为1000μm，其宽度尺寸115b为5000μm。由第二开口113延伸至通孔1200另一端的第二侧壁115的厚度尺寸115c为1500μm，其宽度尺寸115d为5000μm。
利用该细胞培养容器100组装成细胞培养装置800，采用与实施例1相同的方法流程进行人胎盘间充质干细胞的培养，检测细胞干性转录因子的表达量。结果如图13所示，其Nanog、Sox2和Oct4相对表达量大致为1730、116和106左右。
(对比例1)
采用如图1所示的细胞培养容器进行人胎盘间充质干细胞的培养，检测细胞干性转录因子的表达量。结果如图13所示，其Nanog、Sox2和Oct4相对表达量大致为175、123和23左右。
(对比例2)
采用激光刻蚀如图1所示的细胞培养容器100，其第一开口112的第一宽度112a尺寸为250μm，第二开口113的第二宽度113a尺寸为10μm，台阶1150的最大宽度尺寸为350μm，第一侧壁114的深度尺寸114a为350μm。由第一开口112延伸至通孔1200一端的第二侧壁115的厚度尺寸115a为1500μm，其宽度尺寸115b为5000μm。由第二开口113延伸至通孔1200另一端的第二侧壁115的厚度尺寸115c为2000μm，其宽度尺寸115d为7000μm。
采用与实施例1相同的方法流程进行人胎盘间充质干细胞的培养，检测细胞干性转录因子的表达量，结果如图13所示，其Nanog、Sox2和Oct4相对表达量大致为206、142和29左右。
(对比例3)
采用激光刻蚀如图1所示的细胞培养容器100，其第一开口112的第一宽度112a尺寸为250μm，第二开口113的第二宽度113a尺寸为70μm，台阶1150的最大宽度尺寸为350μm，第一侧壁114的深度尺寸114a为350μm。由第一开口112延伸至通孔1200一端的第二侧壁115的厚度尺寸115a为1500μm，其宽度尺寸115b为5000μm。由第二开口113延伸至通孔1200另一端的第二侧壁115的厚度尺寸115c为2000μm，其宽度尺寸115d为7000μm。
采用与实施例1相同的方法流程进行人胎盘间充质干细胞的培养，检测细胞干性转录因子的表达量，结果如图13所示，其Nanog、Sox2和Oct4相对表达量大致为300、260和37左右。
(对比例4)
通过激光刻蚀如图1所示的细胞培养容器100，其第一开口112的第一宽度112a尺寸为250μm，第二开口113的第二宽度113a尺寸为50μm，台阶1150的最大宽度尺寸为350μm，第一侧壁114的深度尺寸114a为350μm。由第一开口112延伸至通孔1200一端的第二侧壁115的厚度尺寸115a为1000μm，其宽度尺寸115b为5000μm。由第二开口113延伸至通孔1200另一端的第二侧壁115的厚度尺寸115c为1000μm，其宽度尺寸115d为5000μm。
利用该细胞培养容器100组装成细胞培养装置800，采用与实施例1相同的方法流程进行人胎盘间充质干细胞的培养，检测细胞干性转录因子的表达量，结果如图13所示，其Nanog、Sox2和Oct4相对表达量大致为1200、704和58左右。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种细胞培养容器，其特征在于，包括：
至少一微腔体阵列，其具有多个微腔体，所述微腔体具有第一开口、第二开口以及于所述第一开口和所述第二开口之间延伸的第一侧壁，所述第一开口具有第一宽度，所述第二开口具有第二宽度，第一宽度大于第二宽度以将细胞限制在所述微腔体中；
基底，其提供形成所述微腔体阵列的结构基础；
进口，其在所述细胞培养容器的一侧上提供了通到所述微腔体的口；
出口，其在所述细胞培养容器的相对侧上提供了通到所述微腔体的口；
其中，所述基底包括：
第一支撑件，具有多个通孔和两个相互平行的表面，所述通孔贯通所述第一支撑件的两个表面以形成所述微腔体阵列；
第二支撑件，连接所述第一支撑件，并与所述第一支撑件围合形成至少一个培养空间。
2.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其特征在于，第一宽度的尺寸为100μm至约5000μm，第二宽度的尺寸为15μm至约50μm。
3.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其特征在于，所述第二支撑件由气体可渗透、液体不可渗透的材料构成，所述第二支撑件封堵于所述通孔的两端并在所述通孔内形成一个培养空间，所述微腔体包裹于所述培养空间中。
4.根据权利要求3所述的细胞培养容器，其特征在于，第一支撑件包括用于围合形成所述通孔的通孔壁，所述通孔壁包括所述第一侧壁和第二侧壁；
所述第一侧壁由所述第一开口向所述第二开口延伸收窄形成，所述第二侧壁连接所述第一侧壁；
所述第一侧壁和所述第二侧壁表面均形成有无粘性涂层。
5.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其特征在于，所述第一开口外周处形成台阶，所述台阶在所述第一支撑的厚度方向与所述第一开口的形状适应，且所述台阶的尺寸大于所述第一开口的尺寸。
6.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其特征在于，包括多个于竖直方向层叠的微腔体阵列，上层的所述微腔体的第二开口于竖直方向对应于下层的所述微腔体的所述第一开口。
7.根据权利要求6所述的细胞培养容器，其特征在于，还包括：
第三支撑件，所述第三支撑件连接所述培养空间，并形成至少一个所述进口和至少一个所述出口，用于向所述培养空间内灌入和/或灌出细胞和/或细胞培养液。
8.根据权利要求7所述的细胞培养容器，其特征在于，所述第三支撑件由所述第一支撑件的外周边缘延伸形成，并且内部中空。
9.一种细胞培养装置，其特征在于，包括：
至少一个如权利要求1～8任一所述的细胞培养容器；以及
至少两个立管组件，所述立管组件具有至少一个连接部，所述连接部用于将所述第三支撑件形成的所述进口和/或所述出口连接至所述立管组件中。
10.一种人胎盘间充质干细胞的三维培养方法，其特征在于，采用如权利要求1-8中任一项所述的细胞培养容器或权利要求9所述的细胞培养装置培养，所述三维培养方法包括：
通过所述进口将含有细胞和培养基的液体引入细胞培养室中；
使细胞通过沉降到微腔体中；以及
培养细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202310636166.1A CN116515631A (zh) | 2023-06-01 | 2023-06-01 | 细胞培养容器、细胞培养装置及细胞培养方法 |
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