JP6993329B2 - 三次元培養皮膚シート、その製造に使用するための細胞培養容器及びその製造方法 - Google Patents
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Description
[1] 少なくとも表皮細胞を含み、基底部の少なくとも一部に凹凸を有する、三次元培養皮膚シート。
[2] 該表皮細胞が、ケラチノサイトである、[1]に記載の三次元培養皮膚シート。
[3] 該三次元培養皮膚シートの内部の少なくとも一部に、さらに、表皮細胞非存在領域を含む、[1]又は[2]に記載の三次元培養皮膚シート。
[4] 該三次元培養皮膚シートの厚さの平均が、20μm以上である、[1]~[3]のいずれか1に記載の三次元培養皮膚シート。
[5] 該凹凸の高さが平均1μm~300μmである、[1]~[4]のいずれか1に記載の三次元培養皮膚シート。
[6] 該凹凸の高さが、平均1μm~90μmである、[1]~[4]のいずれか1に記載の三次元培養皮膚シート。
[7] 該凹凸の隣接する間隔幅が、平均1μm~300μmである、[1]~[6]のいずれか1に記載の三次元培養皮膚シート。
[8] 該凹凸の間隔幅が、平均1μm~100μmである、[1]~[6]のいずれか1に記載の三次元培養皮膚シート。
[9] さらに、該基底部と接触した凸部を有する多孔性膜を備える、[1]~[8]のいずれか1に記載の三次元培養皮膚シート。
[10] 前記凸部が、非生体物質からなる、[9]に記載の三次元培養皮膚シート。
[12] 非生体物質からなる、[11]に記載の細胞培養容器。
[13] 該凸部の高さが、平均1μm~300μmである、[11]又は[12]に記載の細胞培養容器。
[14] 該凸部の高さが、平均1μm~90μmである、[11]又は[12]に記載の細胞培養容器。
[15] 該凸部の隣接する間隔幅が、平均1μm~300μmである、[11]~[14]のいずれか1に記載の細胞培養容器。
[16] 該凸部の隣接する間隔幅が、平均1μm~100μmである、[11]~[14]のいずれか1に記載の細胞培養容器。
[17] 該凸部が、ビーズ形状、角柱形状、錐体形状、錐台形状、釣鐘型、及び/又は、格子状からなる、[11]~[16]のいずれか1に記載の細胞培養容器。
[19] さらに、(3)前記細胞培養容器内の培地を除去して、前記皮膚細胞を空気に暴露し、培養する工程、を含む、[18]に記載の製造方法。
[20] 前記凸部が、非生体物質からなる、[18]又は[19]に記載の製造方法。
[21] 該凸部の高さが、平均1μm~300μmである、[18]~[20]のいずれか1に記載の製造方法。
[22] 該凸部の高さが、平均1μm~90μmである、[18]~[20]のいずれか1に記載の製造方法。
[23] 該凸部の隣接する間隔幅が、平均1μm~300μmである、[18]~[22]のいずれか1に記載の製造方法。
[24] 該凸部の隣接する間隔幅が、平均1μm~100μmである、[18]~[22]のいずれか1に記載の製造方法。
[25] 該凸部が、ビーズ形状、角柱形状、錐体形状、錐台形状、釣鐘型、及び/又は、格子状からなる、[18]~[24]のいずれか1に記載の製造方法。
[26] 該表皮細胞が、生体組織から単離培養後、継代回数2以上の表皮細胞を含む、[18]~[25]のいずれか1に記載の製造方法。
[27] 前記表皮細胞が、ケラチノサイトである、[18]~[26]のいずれか1に記載の製造方法。
図1は、本実施形態で使用する細胞培養容器1、及び、その一部の培養表面断面拡大部6を示す断面図である。細胞培養容器1は、細胞を播種するセルカルチャーインサート2と、セルカルチャーインサート2の外部に培地を満たすためのボトムウェル4とを含む。セルカルチャーインサート2は多孔性膜3を備えている。多孔性膜3上の細胞へ、多孔性膜3を通してセルカルチャーインサート2の外部を満たす培地5から、栄養分及び酸素等を供給することが可能である。本発明の実施形態において、多孔性膜3の表面には、本発明の三次元培養皮膚シート10に凹凸を形成するための凸部7を備えている。本発明の細胞培養容器1に表皮細胞を播種して培養することで、表皮細胞が重層化され、三次元培養皮膚シート10の基底部11(図2参照、太線)の少なくとも一部に凹凸、及び/又は、三次元培養皮膚シートの内部の少なくとも一部に表皮細胞非存在領域を有する、三次元培養皮膚シート10が得られる。
本発明の三次元培養皮膚シートを作製するための細胞培養容器の概念図は前述の図1に示している。細胞培養容器1に設けられた凸部7の改変例を図3~図5に示す。
本発明の三次元培養皮膚シートを作製するための細胞培養容器の概念図は前述の図1に示している。細胞培養容器1に設けられた凸部7の他の改変例を図6及び7に示す。
本発明の実施形態において、表皮細胞の播種数については、公知の方法に従えばよい。例えば、表皮細胞を、0.01×106~10.0×106個/cm2、好ましくは0.05×106~5.0×106個/cm2、より好ましくは0.1×106~1.0×106個/cm2の量で播種する。表皮細胞の培養に用いられる培地(培養液ともいう)としては、通常使用される培地、例えばKG培地、EpilifeKG2(クラボウ社)、Humedia-KG2(クラボウ社)、アッセイ培地(TOYOBO社)、CnT-Prime, Epithelial culture medium(CELLnTEC社)などを用い、約37℃で0~14日間かけて行うことができる。培地としては、その他にDMEM培地(GIBCO社)又は2-0-a-D-グルコピラノシル-L-アスコルビン酸含有KGMとDMEMを1:1混合した培地などが使用できる。表皮細胞の三次元化(重層化)には、CnT-Prime、3D barrier medium(CELLnTEC社)を用いても良い。その他、培地を使用することが可能である。
本発明に用いられる表皮細胞は、新生児由来ケラチノサイト(以下、「ケラチノサイト」。クラボウ社、製品名:凍結NHEK(NB)、カタログ番号:KK-4009)を使用した。継代培養は、販売会社から提供されたインストラクションに従い行った。
(1)松本油脂製薬株式会社製プラスチックビーズ(10μm:M-310,30μm:M-503)10mgをpoly-D-リジン(1mg/mL Millipore)1mLに分散したものを、12-Well Millicell Hanging Cell Culture inserts 0.4μm PET(Millipore社、以下、「セルカルチャーインサート」)に、10μL滴下し、70℃で24時間乾燥させた。
(2)CELLstart CTS (gibco社)をDPBS(gibco社)で50倍希釈し、1つのセルカルチャーインサートに86μL滴下し、2時間37℃の条件に維持した。
(3)CELLstart CTSを除去し、継代回数4の新生児由来ケラチノサイト22~25万個をCnT-Prime,Epithelial culture medium(CELLnTEC社) 500μLに分散し、セルカルチャーインサート内に滴下、同じ培地(CnT-Prime, Epithelial culture medium)を1mLセルカルチャーインサート外部に滴下し、72時間37℃、CO2インキュベーターで培養した。
(4)セルカルチャーインサート内外のCnT-Prime、Epithelial culture mediumを除去し、CnT-Prime、3D barrier medium(CELLnTEC社)で置き換え、16時間37℃CO2インキュベーターで培養した。
(5)セルカルチャーインサート内外の培地を除去し、セルカルチャーインサート内は空気に曝露し、セルカルチャーインサート外に500μL CnT-Prime、3D barrier mediumを入れた。
(6)毎日セルカルチャーインサート外の500μL CnT-Prime、3D barrier mediumを交換しながら37℃CO2インキュベーターで7日間培養した。
(7)セルカルチャーインサート内膜ごと培養表皮を切り取り、4%パラフォルムアルデヒドPBS溶液で固定し、組織切片標本を作製して公知の方法従ってヘマトキシリン・エオジン(HE)染色を行い、顕微鏡にて観察した。
(1)12-Well Millicell Hanging Cell Culture inserts 0.4μm PET(Millipore社、「セルカルチャーインサート」)に、直径12mmのポリエステル製のメッシュを敷いた。以降の手順は、実施例1の(2)~(7)と同一の手順にて行った。
細胞培養容器の凸部の幅、間隔幅、高さの変化が、三次元培養皮膚シートの厚さにどのような変化をもたらすかを観察するための実験を行った。
(1)12-Well Millicell Hanging Cell Culture inserts 0.4μm PET(Millipore社、「セルカルチャーインサート」)に、上述のNo.255又はNo.300の繊維をウエルの形状にカットして敷いたもの(「255布」、「300布」という)、カットしたNo.255又はNo.300の繊維を紫外線硬化樹脂(Henkel社、LOCTITE(登録商標)AA3554)で接着させたもの(「255布接着」、「300布接着」という)を準備した。また、コントロールとして、布により凸部を設けていないウエルを使用した。さらに、コントロールとして、ヒト皮膚(ケー・エー・シー株式会社(京都、日本)を介してBiopredic International社(レンヌ、フランス)より購入)を使用した。以降の手順は、実施例1の(2)~(6)と同一の手順にて行った。実験はトリプリケートで行った。
バリア機能の評価は以下の手順に従って行った。
2 セルカルチャーインサート
3 多孔性膜
4 ボトムウェル
5 培地
6 培養表面断面拡大部
7 凸部
8 表皮細胞
9 角層
10 三次元培養皮膚シート
11 基底部(太線)
71、71a、71b、72、72a、72b、73~77、77a、77b、78 凸部
B2 表皮細胞非存在領域底部
C、C’ 凸部交点の最上部
H、H1、H2 凸部の高さ
H’1 三次元培養皮膚シートの凹凸の高さ
H’2 表皮細胞非存在領域の高さ
H3~H5、H7a 凸部の高さ
T1 三次元培養皮膚シート凸部
T2 表皮細胞非存在領域頂部
Va、Vb 表皮細胞非存在領域
W、W1、W1a、W1b 凸部間隔幅
W’1、W’2 三次元培養皮膚シート凸部間隔幅
W2、W2a、W2b、W3~W8 凸部間隔幅
Y、Y1~Y8 凸部幅
Y’ 三次元培養皮膚シート凸部幅
Claims (14)
- 少なくとも表皮細胞を含み、基底部の少なくとも一部に凹凸を有する、三次元培養皮膚シートであって、
前記三次元培養皮膚シートの厚さの平均が、80μm以上であり、
前記凹凸の高さが、平均30μm~75μmであり、
前記凹凸の間隔幅が、平均10μm~200μmである、三次元培養皮膚シート。 - 前記表皮細胞が、ケラチノサイトである、請求項1に記載の三次元培養皮膚シート。
- 前記三次元培養皮膚シートの内部の少なくとも一部に、さらに、表皮細胞非存在領域を含む、請求項1又は2に記載の三次元培養皮膚シート。
- さらに、前記基底部と接触した凸部を有する多孔性膜を備える、請求項1~3のいずれか1項に記載の三次元培養皮膚シート。
- 前記凸部が、非生体物質からなる、請求項4に記載の三次元培養皮膚シート。
- 培養表面の少なくとも一部に設けられた多孔性膜と、
前記多孔性膜上に配置され、三次元培養皮膚シートの基底部に凹凸を形成するための凸部と、
を有する、請求項1~5のいずれか1項に記載の三次元培養皮膚シートの製造に使用される細胞培養容器であって、
前記凸部の高さが、平均30μm~75μmであり、
前記凸部の隣接する間隔幅が、平均10μm~200μmである、細胞培養容器。 - 前記凸部が、非生体物質からなる、請求項6に記載の細胞培養容器。
- 前記凸部が、ビーズ形状、角柱形状、錐体形状、錐台形状、釣鐘型、及び/又は、格子状からなる、請求項6又は7に記載の細胞培養容器。
- (1)培養表面の少なくとも一部に設けられた多孔性膜と、前記多孔性膜上に配置され、三次元培養皮膚シートの基底部に凹凸を形成するための凸部と、を有する細胞培養容器内に、培地に懸濁した表皮細胞を含む細胞を播種する工程、
(2)前記細胞培養容器の多孔性膜の外側に培地を接触させて培養する工程、
を含む、三次元培養皮膚シートの製造方法であって、
前記三次元培養皮膚シートの厚さの平均が、80μm以上であり、
前記凸部の高さが、平均30μm~75μmであり、
前記凸部の隣接する間隔幅が、平均10μm~200μmである、製造方法。 - さらに、
(3)前記細胞培養容器内の培地を除去して、前記表皮細胞を空気に暴露し、培養する工程、
を含む、請求項9に記載の製造方法。 - 前記凸部が、非生体物質からなる、請求項9又は10に記載の製造方法。
- 前記凸部が、ビーズ形状、角柱形状、錐体形状、錐台形状、釣鐘型、及び/又は、格子状からなる、請求項9~11のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記表皮細胞が、生体組織から単離培養後、継代回数2以上の表皮細胞を含む、請求項9~12のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記表皮細胞が、ケラチノサイトである、請求項9~13のいずれか1項に記載の製造方法。
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