JP2001258555A - 細胞および組織の三次元培養系 - Google Patents

細胞および組織の三次元培養系

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Abstract

(57)【要約】 【構成】 内皮細胞によって橋かけされた隙間を有する
三次元構造物へと構成された、生物適合性の非生存物質
から成る枠組みに付着しかつ実質的に該枠組みを覆って
いる集密的な小型の血管内皮細胞を含んでなる生存間質
組織上で、ニューロン細胞および星状細胞を培養してな
る三次元培養物。 【効果】インビボ組織と同等な類似構造を形成するため
の増殖および適正な細胞成熟が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】本出願は、１９８８年９月８日出
願の同時係属出願第07／242,096号の一部継続出願であ
る；この出願は１９８７年４月１４日出願の第038,110
号の一部継続出願である；この出願は１９８７年４月３
日出願の第036,154号の一部継続出願であり、これは１
９８８年１月２６日付で米国特許出願第4,721,096号と
して許可された；これは１９８６年４月１８日出願の放
棄した出願第853,569号の継続出願である；これらの出
願の各々は、その全体が参考文献として本文にとり込ま
れる。 １．序 論 本発明は細胞および組織の三次元培養系に関する。この
培養系は、インビボで観察される環境にいっそう近接し
た環境で細胞および組織を長期間インビトロ増殖させる
のに使用できる。本文記載の培養系により、インビボ組
織と同等な類似構造を形成するための増殖および適正な
細胞成熟が提供される。
【０００１】生成する培養物のインビボでの移植あるい
は埋め込みからインビトロでの細胞毒性化合物および医
薬化合物のスクリーニングに至るまで、さらに「バイオ
リアクター」における生物学的に活性な分子の生産に至
るまでの範囲の、様々な適用用途を有する。本発明は、
骨髄、皮膚、肝臓、粘膜上皮、膵臓、および腺ガンの三
次元培養を説明する実施例、およびさらに細胞毒性アッ
セイ、血液−脳関門モデル系および皮膚移植組織におけ
る三次元培養系の使用を示す実施例によって、説明す
る。 ２．発明の背景 脊椎動物細胞のインビトロ培養物の大多数は、栄養培地
に浸した人工基質上で、単層として増殖する。単層が増
殖する基質の性質は、プラスチックのような固体または
コラーゲンまたは寒天のような半固形ゲルでありうる。
使い捨てプラスチックが現今の組織または細胞培養に使
用される好ましい基質となっている。
【０００２】二、三の研究者が、基底膜成分に関連した
天然基質の使用を探究した。基底膜は糖タンパク質およ
びプロテオグリカンの混合物を含んでなり、これらはイ
ンビボでほとんどの細胞を取り囲んでいる。例えば、Re
idおよび Rojkund（1979, Methods in Enzymology,第５
７巻、Cell Culture, JakobyおよびPasten編、New Yor
k, Acad. Press, pp263-278）；Vlodavskyら、（1980,
Cell 19:607-617)；Yangら、（1979, Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. 78：3401）は肝細胞、上皮細胞および
内皮組織を培養するのにコラーゲンを使用している。浮
遊性コラーゲン上（Michalopoulos およびPitot, 1975,
Fed. Proc. 34：826)およびニトロセルロース膜上（Sa
vageおよびBonney, 1978, Exp, Cell Res. 114:307-31
5)の細胞増殖が最終分化を促進する試みに用いられた。
しかしながら、長期間にわたる細胞の再生およびかかる
系に於ける上記組織の培養はこれまで達成されていな
い。
【０００３】マウス胚繊維芽細胞の培養物を用いて特に
低濃度で細胞増殖が増強された。この効果は、部分的に
は培地の追加によっていると考えられるが、また細胞産
物による基質の馴化のせいである可能性もある。これら
の系に於いて、繊維芽細胞の支持細胞層は他の細胞の付
着に適した表面を形成する集密単層として増殖する。例
えば、正常胎児腸の集密的支持細胞層上での神経膠腫の
増殖が報告されている（Lindsay, 1979, Nature 228:8
0）。
【０００４】二次元的細胞の増殖は培養細胞を調製し、
観察し、研究するためには便利な方法であり、それによ
り細胞を迅速に増殖させることができるが、インビボの
完全な組織の特徴である細胞−細胞および細胞−マトリ
ックス相互作用に欠ける。かかる機能的および形態学的
相互作用を研究するために、少数の研究者はコラーゲン
ゲル（Douglasら、1980, In Vitro 16:306-312; Yang
ら、1979, Proc. Natl.Acad. Sci. 76:3401；Yangら、1
980, Proc. Natl. Acad. Sci. 77:2088-2092;Yangら、1
981, Cancer Res. 41:1021-1027); セルローススポン
ジ単独（Leightonら、1951, J. Natl. Cancer Inst. 1
2:545-561）またはコラーゲンで被覆したもの（Leighto
nら、1968, Cancer Res, 28:286-296； ゼラチンスポ
ンジ，Gelfoam （Sorourら、1975, J. Neurosurg. 43:7
42-749）のような三次元基質の使用を探究してきた。
【０００５】一般に、これら三次元基質に培養すべき細
胞を接種する。細胞タイプの多くはマトリックスに侵入
して「組織様の」組織構造を確立することが報告されて
いる。例えば、三次元コラーゲンゲルを利用して、乳房
上皮（Yangら、1981, CancerRes. 41:1021-1027）およ
び交感神経ニューロン（Ebendal, 1976, Exp. Cell Re
s. 89:159-169）が培養されている。さらに、分散され
た単層培養物から組織様の構造物を再生させる様々な試
みが行われてきた。Kruse および Miedema(1965,J. Cel
l Biol. 27:273）は、灌流された単層が１０細胞以上の
深さまで増殖し得ること、および適当な培地を供給し続
けるならば、器官様の構造物が多層培養物中に生じるこ
とを報告した（Schneiderら、1963, Exp. Cell Res. 3
0:449-459および Bellら、1979, Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. 76:1274-1279も参照）：Green(1978, Scienc
a 200:1385-1388)は、ヒト表皮の表皮ケラチン細胞がト
ランスファーなしで数週間維持されるならば、デマトグ
リフス（摩擦辺縁）を形成できることを報告している；
Foikman および Haudenschild(1980, Nature 288:551-5
56）は内皮増殖因子および腫瘍細胞馴化培地の存在下で
培養した血管内皮細胞の培養物における毛細管の形成を
報告した；さらにSiricaら（1979, Proc. Natl.Acad. S
ci. U.S.A. 76:283-287；1980, Cancer Res. 40:3259-3
267）はコラーゲンの薄層で被覆したナイロンメッシュ
上で、初代培養肝細胞を約１０−１３日維持した。しか
しながら、かかる系に於ける細胞の長期間培養および増
殖は達成されていない。
【０００６】実際、骨髄のような組織の長期間培養の確
立が試みられてきた。様々な種類の細胞を含有する間質
細胞層は速やかに形成されるが、有意な造血機能が実際
にはいかなる時もまったく維持され得なかったという点
で、全体として結果は失望であった（総説として、Dext
erら、Long Term Bone Marrow Culture, 1984, AlanR.
Liss, Inc., pp.57-96 参照）。 ３．発明の要約 本発明は種々の異なる細胞および組織をインビトロで長
期間培養するのに使用できる三次元細胞培養系に関す
る。本発明によれば、所望の組織由来の細胞を予め確立
された間質支持体マトリックスに接種し、増殖させる。
間質支持体マトリックスは、三次元マトリックス上で活
発に増殖中の、繊維芽細胞のような間質細胞を含んでな
る。間質細胞はまた内皮細胞、マクロファージ／単球、
含脂肪細胞、周細胞、骨髄間質にみられる細網細胞など
のような、疎性結合組織に見られる他の細胞をも包含し
うる。間質マトリックスは培養細胞の長期間にわたる活
発な増殖を支えるのに必要な支持体、増殖、因子、およ
び調節因子を提供する。この三次元系で増殖させる場合
には、増殖中の細胞が適正に成熟および分離して、イン
ビボで見られる対応組織に類似した成体組織の成分を形
成する。
【０００７】本発明は、部分的には、間質細胞の三次元
的な増殖が培養細胞の活発な増殖を単層系よりも長期間
にわたって支えるであろうという知見に基づく。これは
部分的には三次元マトリックスの表面積の増加によって
いる可能性があり、その結果間質細胞の活発な増殖期間
が延長されるのであろう。これら増殖中の間質細胞は間
質細胞、および間質マトリックス上に接種された組織−
特異的細胞、の両者の長期間の増殖を支えるのに必要な
タンパク質、増殖因子および調節因子を作り出す。さら
に、マトリックスが三次元的であることによって、イン
ビボでの条件により近似した空間的分布が可能になり、
したがって細胞の成熟および移動を促す微小環境の形成
が可能となる。この支持体の存在のもとでの細胞増殖
は、タンパク質、糖タンパク質、グリコサミノグリカ
ン、細胞マトリックス、およびその他の物質を支持体そ
れ自体に添加することによって、またはこれらの物質で
支持体を被覆することによってさらに増強できる。
【０００８】三次元支持体の使用により細胞が多層に増
殖することが可能となり、したがって、本発明の三次元
細胞培養系が形成される。多くの種類の細胞および組織
をこの三次元培養系で増殖させることができる。
【０００９】本発明の詳細な態様に於いては、骨髄、皮
膚、肝臓、膵臓、粘膜上皮、腺ガンおよび黒色腫組織を
三次元培養系で増殖させることができる。
【００１０】さらに、生成する培養物は、生理学的また
は病理的条件の研究のためのモデル系として使用でき
る。例えば、本発明の詳細な態様に於いては、三次元培
養系は血管−脳関門のモデルとして用いることができ
る。まう一つの詳細な態様に於いては、これに限定する
わけではないが、粘膜上皮の三次元培養物をヘルペスウ
イルスまたはパピローマウイルス感染を研究するための
モデル系として使用できる。生成する培養物は、培養物
中で増殖した細胞のインビボでの移植あるいは埋め込み
から、インビトロでの細胞毒性試験および化合物のスク
リーニング、およびインビトロで生物学的物質を生産す
るための「バイオリアクター」の設計に至るまでの範囲
にわたる様々な適用用途を有する。 3.1．定義および略号 本文に使用された以下の用語は、下記の意味を有するも
のとする： 付着層：三次元マトリックスに直接付着した細胞、また
はそれ自体がマトリックスに直接付着している細胞への
付着によって間接的に結びついた細胞。
【００１１】間質細胞：疎性結合組織に見られる、内皮
細胞、周細胞、マクロファージ、単球、形質細胞、肥胖
細胞、含脂肪細胞などを包含するがそれらに限定されな
い。他の細胞および／または要素を含むかあるいは含ま
ない繊維芽細胞。
【００１２】組織−特異的細胞または実質細胞：器官の
支持構造とは区別される、器官の必須で特徴的な組織を
形成する細胞。
【００１３】三次元マトリックス：（ａ）細胞を付着で
き（あるいは細胞を付着できるよう修飾されることがで
き）；そして（ｂ）細胞を単層をこえて増殖させること
ができる任意の物質および／または形状で構成される三
次元マトリックス。この支持体に間質細胞が接種されて
三次元間質マトリックスが形成される。
【００１４】三次元間質マトリックス：間質細胞を接種
された三次元マトリックス。集密的であるか、あるいは
亜集密的であるかに関わらず、本発明による間質細胞は
増殖と分裂を続ける。間質マトリックスは後から接種さ
れた組織−特異的細胞の増殖を支えて三次元細胞培養物
を形成しよう。
【００１５】三次元細胞培養物：すでに組織−特異的細
胞が接種され、培養された三次元間質マトリックス。一
般に、三次元間質マトリックスの接種に用いられる組織
特異的細胞はその組織にかかわる「幹」細胞（または
「貯蔵」細胞）を包含すべきである；すなわち、新たな
細胞を生成するこれら細胞は成熟して分化した細胞とな
り、その組織の実質を形成しよう。
【００１６】以下の略号は、下記の意味を有するものと
する： BFU-E ＝赤芽球コロニー形成細胞 CFU-C ＝顆粒球マクロファージコロニー形成細胞 CFU-GEMM＝顆粒球、赤芽球、単球、巨核球コロニー形成
細胞 EDTA ＝エチレンジアミンテトラ酢酸 FBS ＝ウシ胎児血清 HBSS ＝ハンクス平衡塩類溶液 HS ＝ウマ血清 LTBMC ＝長期骨髄培養物 MEM ＝最小必須培地 PBL ＝末梢血液白血球 PBS ＝リン酸緩衝溶液 RPMI 1640 ＝Roswell Park Memorial Institute 培地番
号1640（GIBCO, Inc., Grand Island, NY) SEM ＝走査型電子顕微鏡 ４．発明の詳細な説明：三次元細胞培養系 本発明は三次元マトリックス、および三次元多層細胞培
養系のための支持構造体としてのその使用に関する。こ
れまで知られている組織培養系では細胞は単層に増殖し
た。本発明による三次元間質支持体上で増殖した細胞は
多層に増殖して細胞性マトリックスを形成する。このマ
トリックス系は前記の単層組織培養系よりもはるかにイ
ンビボでみられる生理的条件に近い。この三次元細胞培
養系は種々の種類の細胞の増殖、および少数例をあげれ
ば骨髄、皮膚、肝臓、膵臓、腎臓、副腎および神経学的
組織を包含するがそれらに限定されない多数の様々な組
織の形成に適用可能である。
【００１７】この培養系は様々な適用用途を有する。例
えば、皮膚、腺などのような組織については三次元培養
物それ自体を生きた生物に移植または埋め込むことがで
きる。あるいはまた、骨髄のような散在性の組織につい
ては、増殖中の細胞を、移植のために培養系から単離す
ることができよう。三次元培養物はインビトロでの細胞
毒性テストおよび化合物のスクリーニングも使用でき
る。さらに別の応用では、三次元培養系は細胞生産物を
大量に生産させるための「バイオリアクター」として使
用できる。
【００１８】本発明によれば、所望の組織から得られた
細胞（本文では組織特異的細胞または実質細胞と称す
る）を、予め確立された三次元間質マトリックスに接種
し、そして培養する。間質マトリックスは、三次元マト
リックスまたは網状組織上で増殖した間質細胞を含んで
なる。間質細胞は、本文中でより完全に記載されるその
他の細胞および／または要素を含むかまたは含まない繊
維芽細胞を含んでなる。間質を含有する、繊維芽細胞お
よびその他の細胞および／または要素はその起源が胎児
であっても成人であってもよく、また皮膚、肝臓、膵臓
などのような好都合な起源から得ることができる。かか
る組織および／または器官は、適当なバイオプシーによ
って、また剖検で得ることができる。実際、遺体の器官
を用いて、間質細胞および要素を豊富に供給することが
できる。
【００１９】胎児繊維芽細胞は、多数の異なる細胞およ
び組織の三次元培養系での増殖を支えるであろう。した
がってこれをマトリックス上に接種し、様々な細胞およ
び組織の任意のものを培養するための「包括的な」間質
支持体マトリックスを形成することができる。しかしな
がら、ある種の場合には、「包括的」間質支持体マトリ
ックスよりむしろ「特異的」マトリックスを使用する方
が好ましい可能性があり、このような場合には間質細胞
および要素を特定の組織、器官、または個体から得るこ
とができる。例えば、インビボでの移植または埋め込み
の目的で三次元培養を使用する予定である場合には、そ
の移植または埋め込みを受ける予定の個体から間質細胞
および要素を得ることが好ましいであろう。この方法は
宿主の疾病に対し移植片の免疫学的拒絶反応が起こりそ
うな場合には特に好都合であろう。さらに、繊維芽細胞
および他の間質細胞および／または要素は三次元系中で
培養予定の組織と同じ種類のものから得ることができ
る。このことは、特定の間質細胞が特別の構造的／機能
的役割を担っているような組織を培養する場合に有用で
あろう；例えば、神経学的組織のグリア細胞、肝臓のク
ッパー細胞など。
【００２０】ひとたび三次元マトリックスに接種される
と、間質細胞はマトリックス上で増殖し、本発明の三次
元培養系に接種される組織−特異的細胞の増殖を支え
る。実際、組織−特異的細胞が接種されると、三次元間
質支持体マトリックスは、長期間にわたり培養物の活発
な増殖を支えるであろう。増殖および調節因子を培養物
に添加できるが、それらは間質支持体マトリックスによ
って産生されるので必要ではない。
【００２１】本発明によれば、特定の組織についてイン
ビボでみられる細胞の微小環境を培養時に再形成するこ
とが重要であるので、実質細胞の接種前に間質細胞を増
殖させる程度は、三次元組織培養で増殖させる予定の組
織の種類に応じて変動しうる。例えば、骨髄三次元培養
物では、造血細胞亜集密の間質マトリックスに接種する
のが好ましい。しかしながら、皮膚の三次元組織培養物
においては、皮膚の真皮成分の構造を再形成するため
に、本発明にしたがって、表皮ケラチン細胞および／ま
たはメラニン細胞の接種に先立ち、間質細胞を集密に到
達させることが好ましい。重要なことは、メッシュの開
口部が培養中の間質細胞の出口となりうるため、集密間
質培養物は接触阻止を示さず、そして間質細胞は増殖、
分裂を続け、機能的に活性であり続けるということであ
る。
【００２２】本発明は、部分的には、三次元における間
質細胞の増殖が、間質細胞および組織特異的細胞の両者
の活発な増殖を単層系よりもずっと長期間支えるであろ
うという知見に基づく。さらに、この三次元系はインビ
トロ増殖細胞の成熟、分化、および分離を支え、インビ
ボでみられる対応する組織に類似した成体組織の成分を
形成する。
【００２３】出願人は、本発明が機能するメカニズムを
説明する義務も責務もないが、三次元培養系に固有の多
数のファクターがその成功に貢献している可能性があ
る：すなわち （ａ）三次元マトリックスは、タンパク質が付着するた
めの、そしてその結果間質細胞が付着するための、より
広い表面積を提供する。
【００２４】（ｂ）集密まで増殖し、接触阻止を示しそ
して増殖および分裂を留める単層培養物の細胞とは対照
的に、間質細胞はマトリックスの三次元ゆえに活発に増
殖を続ける。間質細胞を複製することによる増殖および
調節因子の産生は培養細胞の増殖刺激と分化調節の部分
的な原因となりうる。
【００２５】（ｃ）三次元マトリックスによって、イン
ビボの対応する組織にみられる分布により類似した細胞
要素の空間的分布が可能になる。
【００２６】（ｄ）三次元系に於ける細胞増殖可能な容
積の増加によって、細胞成熟に導く局所的微小環境を確
立できよう。
【００２７】（ｅ）三次元マトリックスは、付着層内の
マクロファージ、単球、および場合によってはリンパ球
のような移動細胞の動きにいっそう大きな可能性を与え
ることによって、細胞−細胞相互作用を最大にする。
【００２８】（ｆ）分化した細胞表現型の維持には、増
殖／分化因子のみならず適当な細胞間相互作用が必要で
あることが認識されている。本発明は効果的に組織の微
小環境を再形成する。
【００２９】三次元間質支持体、培養系それ自体、およ
びその維持、ならびに三次元培養物の様々な利用を、よ
り詳細に以下のサブセクションで説明する。 4.1．三次元間質マトリックスの確立 三次元支持体は以下のような任意の物質および／または
形状を有することができる：（ａ）その支持体に細胞を
付着させることができる（または、細胞を付着できるよ
う修飾されることができる）；および（ｂ）一層をこえ
て細胞を増殖させることができる。多数の様々な物質を
用いてマトリックスを形成することができ、これらにナ
イロン（ポリアミド）、ダクロン（ポリエステル）、ポ
リスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリ
ビニル化合物（例えば、ポリ塩化ビニル）、ポリカーボ
ネート（PVC)、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE；テ
フロン（登録商標））、サーマノックス（TPX)、ニトロ
セルロース、綿、ポリグリコール酸（PGA)、腸縫合系、
セルロース、ゼラチン、デキストラン、などが包含され
るがそれらに限定されない。これら物質の任意のものを
メッシュに織ることができ、例えば、三次元マトリック
スを形づくることができる。ナイロン、ポリスチレン、
などのようなある種の物質は、細胞の付着には好ましく
ない基質である。これらの物質を三次元支持体マトリッ
クスとして用いる場合には、間質細胞のマトリックスへ
の付着を増強するために、間質その接種前にマトリック
スを前処理するのが得策である。例えば、間質細胞の接
種に先立ち、ナイロンマトリックスを０．１Ｍ酢酸で処
理しそしてポリリジン、ＦＢＳ、および／またはコラー
ゲン中でインキュベートしてナイロンを被覆することが
できよう。ポリスチレンも硫酸を用いて同様に処理でき
よう。
【００３０】三次元培養物自体をインビボで移植しよう
とする場合には、例えばポリグリコール酸、腸縫合糸材
料、またはゼラチンのような生物分解性マトリックスを
使用することが好ましいであろう。培養物を長期間維持
するか、または低温で保存しようとする場合には、ナイ
ロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポ
リビニル、テフロン、綿、などのような非分解物質が好
ましいであろう。本発明にしたがって使用することがで
きる便利なナイロンメッシュは、平均細孔サイズ２１０
μｍおよび平均ナイロン繊維直径９０μｍのナイロン濾
過メッシュ、Nitex、である（＃3-210/36, Tetko, In
c., N. Y.）。
【００３１】以下に述べる他の細胞および要素を伴うか
または伴わない繊維芽細胞を含んでなる間質細胞をマト
リックス上に接種する。これら繊維芽細胞は皮膚、肝
臓、膵臓などのような器官から、バイオプシー（妥当な
場合）または剖検によって得ることができる。実際、任
意の適当な遺体の器官から、かなり都合よく繊維芽細胞
を大量に得ることができる。前に説明したように、胎児
の繊維芽細胞を用いて種々の異なる細胞および／または
組織の増殖を支える「包括的」三次元間質マトリックス
を形成することができる。しかしながら、培養すべき組
織と同一タイプから得られた繊維芽細胞、および／また
は本発明の三次元系による培養で増殖した細胞および／
または組織を後で受容することになる特定の個体から得
られた繊維芽細胞、を三次元マトリックスに接種するこ
とによって、「特異的」間質マトリックスを調製でき
る。
【００３２】繊維芽細胞は、繊維芽細胞の供給源として
使用予定の適当な器官または組織を解離することによっ
て容易に単離できる。これは、当業者に知られた技法を
用いて容易に達成できる。例えば、組織または器官を機
械的にばらばらにする、および／または消化酵素および
／またはキレート剤で処理することができる。これら
は、隣接する細胞間の結合を弱め、明らかな細胞破壊を
伴うことなく組織を個々の細胞の懸濁液に分散すること
を可能にする。酵素的解離は、組織を細断し、この細断
された組織を多数の消化酵素の任意の一つを用いて単独
のまたはいくつかを組み合わせて用いて処理することに
よってできる。これらにはトリプシン、キモトリプシ
ン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、および／またはヒア
ルロニダーゼ、ＤＮアーゼ、プロナーゼ、ジスパーゼな
どが包含されるが、それらに限定されない。少数例をあ
げればグラインダー、ブレンダー、篩、ホモジナイザ
ー、加圧細胞、またはインソネーターなどが包含される
が、それらに限定されない数多くの方法によって機械的
破壊を行うこともできる。組織解離の方法の総説として
は、Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of
Basic Technique,第２版、A. R. Liss, Inc., New Yor
k, 1987, Ch.9, pp.107-126参照。
【００３３】ひとたび組織を破壊して個々の細胞の懸濁
液となすと、その懸濁液を小集団に分画することがで
き、その小集団から繊維芽細胞および／または他の間質
細胞および／または要素を得ることができる。これも細
胞分離のための標準的技法を用いて行うことができる。
このような技法には、特定の細胞タイプのクローニング
および選択、不必要な細胞の選択的破壊（ネガティブ選
択）、混合集団に於ける細胞凝集能の差に基づく分離、
凍結−解凍操作、混合集団に於ける細胞の付着性の差、
濾過、通常の遠心分離およびゾーン遠心分離、遠心傾瀉
法（向流遠心分離）、単位重量分離、向流分配法、電気
泳動および蛍光活性化細胞選別が包含されるがそれらに
限定されない。クローン選択および細胞分離技法の総説
についてはFreshney, Culture of Animal Cells, A Man
ual of Basic Technique,第２版、A. R. Liss, Ins., N
ew York, 1987, Ch.11 および12,pp.137-168 参照。
【００３４】繊維芽細胞の分離は例えば以下のようにし
て行うことができる：すなわち新鮮な組織試料を十分に
洗浄し、血清を除去するためにハンクス平衡塩類溶液
（HBSS）中で、細断する。細断された組織はトリプシン
のような解離酵素の新たに調製した溶液中１〜１２時間
インキュベートする。このインキュベーションの後、解
離した細胞を懸濁させ、遠心によってペレットとしそし
て培養皿上に塗布する。すべての繊維芽細胞は他の細胞
に先立って付着してから、それゆえ適当な間質細胞を選
択的に単離して増殖させることができる。次に、単離さ
れた繊維芽細胞を集密まで増殖させ、この集密培養物か
ら釣り上げそして三次元マトリックス上に接種できる
（Naughtonら、1987, J. Med. 18(3&4). 219-250参
照）。例えば、約１０6 から５×１０7 細胞／mlの高濃
度の間質細胞を用いて三次元マトリックスを接種する
と、比較的短期間で三次元間質支持体が確立されよう。
【００３５】繊維芽細胞の他に他の細胞を添加して、長
期間の培養での増殖を支えるのに必要な三次元間質マト
リックスを形成することができる。例えば、疎性結合組
織に見いだされる他の細胞を繊維芽細胞とともに三次元
支持体に接種することができる。かかる細胞には、内皮
細胞、周細胞、マクロファージ、単球、形質細胞、肥胖
細胞、含脂肪細胞などが包含されるがそれらに限定され
ない。これら間質細胞は皮膚、肝臓などのような適当な
器官から、上記のような当業上知られた方法を用いて、
容易に得ることができる。本発明の一つの態様に於いて
は、培養すべき特定の組織のために分化した間質細胞を
繊維芽細胞間質に添加できる。例えば、繊維芽細胞、内
皮細胞、マクロファージ／単球、含脂肪細胞および細網
細胞を包含するがそれらに限定されない造血組織の間質
細胞を用いて、インビトロで骨髄を長期間培養するため
の三次元亜集密間質を形成できよう。
【００３６】造血間質細胞は骨髄懸濁液中に形成される
「バフィーコート（軟層）」から、例えば３０００×ｇ
の低速遠心によって容易に得ることができる。肝臓の間
質細胞には繊維芽細胞、クッパー細胞、および血管およ
び胆管内皮細胞が包含されうる。同様に、グリア細胞は
神経学的細胞および組織の増殖を支える間質として使用
できよう；この目的のためのグリア細胞は胚または成体
脳のトリプシン消化、またはコラゲナーゼ消化によって
得ることができる（PontenおよびWestermark,1980, Fed
erof, S. Hertz, L. 編、“Advance in Cellular Neuro
biology”，第１巻、New York, Academic Press, pp.20
9-227)。
【００３７】繰り返すが、培養された細胞をインビボで
移植あるいは埋め込みに使用する予定である場合には、
患者自身の組織から間質細胞を得ることが好ましい。タ
ンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊
維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、
ヘパラン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コントロイ
チン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸な
ど）、細胞性マトリックス、および／またはその他の物
質を三次元間質支持体マトリックスに添加することによ
って、またはこれらを用いてマトリックス支持体を被覆
することによって、三次元マトリックスの存在下での細
胞増殖をさらに増殖できる。
【００３８】間質細胞の接種後、その三次元マトリック
スを適当な栄養培地中でインキュベートすべきである。
RPMI 1640 、フィッシャー培地、イスコープ培地、マッ
コイ培地などの多くの市販の培地が使用に適していると
考えられる。増殖活性を最大にするためには、インキュ
ベーション期間中は三次元間質マトリックスが培地中に
懸濁されている。または浮遊していることが重要であ
る。さらに、使用済み培地を除去し、放出された細胞を
減らし、そして新鮮な培地を添加するために、定期的に
培養物に「供給」すべきである。
【００３９】インキュベーション期間中、間質細胞は三
次元マトリックスに沿って線状に増殖し、マトリックス
を覆うであろう。その後、マトリックスの開口部内への
増殖が始まる。組織特異的細胞を間質マトリックスに接
種するに先立ち細胞を適度に増殖させることが重要であ
り、その増殖程度はインビボ組織に存在する間質細胞量
を反映する。
【００４０】マトリックスの開口部は、間質細胞がその
開口部を横切って伸長できるのに適当な大きさでなけれ
ばならない。マトリックスを横切って伸長する活発に増
殖中の間質細胞を維持することは、その間質細胞によっ
て作られる増殖因子の生産を増強し、したがって長期間
培養を支持することになろう。例えば、開口部が小さす
ぎる場合、間質細胞は速やかに集密に達しうるが、容易
にメッシュから出ることはできないであろう；捕捉され
た細胞は接触阻止を示し、そして増殖を支持しかつ長期
間の培養を維持するのに必要な適当な因子の生産を止め
るであろう。もし開口部が大きすぎる場合には、間質細
胞は開口部を横切って伸長することができないであろ
う；このこともまた、増殖を支持しかつ長期間の培養を
維持するのに必要な適当な因子の間質細胞による生産を
減少させるであろう。本文に例示した種類のメッシュの
マトリックスを用いた場合、約１５０μｍから約２２０
μｍまでの範囲内の開口部が使用上満足できることが見
出されている。しかしながら、マトリックスの三次元構
造および込み入った状態に応じて、他の大きさも同じよ
うにうまく機能しよう。実際、間質細胞が伸長し、複製
を続け、そして長期間増殖することを可能にする任意の
形状または構造が、本発明にしたがって、機能するであ
ろう。
【００４１】マトリックス上に沈着した種々の種類のコ
ラーゲンの割合の違いが、その後に接種される組織特異
的細胞の増殖に影響しうる。例えば、造血細胞の最適な
増殖のためには、マトリックスは好ましくはコラーゲン
III 、IVおよびＩ型をおよそ６：３：１の割合で当初の
マトリックス中に含有すべきである。三次元皮膚培養系
については、コラーゲンＩおよびIII 型が当初のマトリ
ックスに沈着するのが好ましい。適当なコラーゲン型を
産生する繊維芽細胞を選択することによって、沈着した
コラーゲンの型の割合を操作または増強できる。これは
補体を活性化する能力を有する適当なイソタイプまたは
サブクラスの、特定のコラーゲン型を限定するモノクロ
ーナル抗体を用いて達成できる。これらの抗体および補
体は所望のコラーゲン型を発現する繊維芽細胞をネガテ
ィブ選択するのに使用できる。あるいはまた、マトリッ
クス接種に用いる間質は、所望の適当なコラーゲン型を
合成する細胞の混合物であることもできる。５種類の型
のコラーゲンの分布および起源を表Ｉに示す。 ──────────────────────────────── 表Ｉ ５つの型のコラーゲンの分布および起源 コラーゲンの型 主要な組織分布 起源の細胞 ──────────────────────────────── Ｉ 疎および密な通常の結 繊維芽細胞および細網； 合組織； 平滑筋細胞 コラーゲン線維 線維軟骨 骨 骨芽細胞 ぞうげ質 ぞうげ芽細胞 II ヒアリンおよび弾性 軟骨細胞 軟骨眼の硝子体 網膜細胞 III 疎性結合組織； 繊維芽細胞および 細網細胞 細網線維 真皮乳頭層 平滑筋細胞； 血管 内皮細胞 IV 基底膜 上皮および内皮 細胞 眼の水晶体包 水晶体線維 Ｖ 卵膜；胎盤 繊維芽細胞 基底膜 骨 平滑筋 平滑筋細胞 ──────────────────────────────── こうして、培養しようとする組織および希望するコラー
ゲン型に応じて、三次元マトリックスに接種するための
適当な間質細胞が選ばれる。
【００４２】三次元間質支持体のインキュベーションの
間に、増殖している細胞がマトリックスから遊離するこ
とがある。これらの遊離細胞は培養容器の壁に付着し、
そこで増殖し続けて集密的細胞単層を形成する。これ
は、例えば培地の供給時に遊離細胞を除去するか、また
は三次元間質マトリックスを新しい培養容器へ移すこと
により、阻止もしくは最小限に抑制すべきである。容器
内に集密的細胞単層が存在すると、三次元マトリックス
および／または培養系での細胞の増殖が止まるであろ
う。集密的細胞単層の除去または新しい容器内の新鮮培
地へのマトリックスの移動は三次元培養系の増殖活性を
回復させるであろう。このような除去または移動は２５
％の集密度を越える間質細胞単層をもつ培養容器におい
てなされるべきである。これとは別に、遊離細胞が付着
するのを防ぐために培養系を攪拌したり、あるいは周期
的に培地を供給する代わりに、新鮮培地がその系を通っ
て連続的に流れるように培養系を設定することもでき
る。三次元培養系内での増殖を最大限に高め、かつマト
リックスから遊離した細胞を洗い流して除去するように
流速が調節されると、結果的にそれらは容器の壁に付着
して集密的に増殖することがなくなるであろう。どんな
場合でも、遊離した間質細胞は回収し、後で使用するた
めに凍結保存することができる。 4.2．三次元間質マトリックスへの組織特異細胞の接種
および培養物の維持 ひとたび三次元間質マトリックスが適度な増殖を遂げた
ら、培養を希望する組織特異細胞（実質細胞）を間質マ
トリックスに接種する。接種物中の細胞の高濃度は低濃
度よりも一層速やかに増殖を高めるであろう。接種用に
選ばれる細胞は培養すべき組織に左右され、これらの組
織には、いくつかの名を挙げれば、骨髄、表皮、肝臓、
膵臓、腎臓、神経組織、副腎などが含まれる。
【００４３】例えば、制限するつもりではないが、種々
の上皮細胞は三次元生存間質支持体上で培養することが
できる。このような上皮細胞の例には口腔粘膜および胃
腸（ＧＩ）管細胞が含まれ、これらに限定されない。こ
の種の上皮細胞は当分野で知られた方法に従って組織の
酵素処理により分離され、続いて培地でこれらの細胞を
増殖させ、その後三次元間質支持細胞マトリックス（新
粘膜下組織）へ上皮細胞を適用する。粘膜下組織の存在
は、口腔粘膜細胞およびＧＩ管内層細胞の正常な分裂・
分化を促進する増殖因子や他の蛋白を供給する。この方
法論を使用することにより、鼻上皮、気道上皮、膣上
皮、および角膜上皮を含む他の上皮細胞も上首尾に増殖
させることができる。
【００４４】三次元生存間質支持体上でいろいろな腫瘍
を増殖させてもよい。このような腫瘍の例には原発また
は転移部位から誘導される腺癌および悪性黒色腫が含ま
れるが、これらに限定されない。この種の培養物は他の
三次元上皮培養物と類似した方法により確立される。簡
単に述べると、患者の腫瘍または正常組織から、あるい
は同種異系源から誘導された間質細胞をメッシュの上に
定着させる。ほぼ全面成長に達した後、間質細胞に腫瘍
細胞を接種する。腫瘍細胞は速やかに分裂し続けて、三
次元固形腫瘍を形成するであろう。このような三次元支
持体上で増殖させた腫瘍細胞はインビボ状態に近い形態
をとり、しかも固形腫瘍と似通った方法で表面抗原を発
現する；細胞単層において増殖させた悪性細胞はインビ
ボ腫瘍組織との同程度の類似性を示さない。このような
腫瘍細胞の生理学的増殖は新しい化学療法剤、個別的化
学療法、および転移のメカニズムの研究・開発への応用
を可能にする。さらに、このような腫瘍培養物は個別的
免疫療法に有用でありうる。これに関して、51ＣＲ放出
研究を用いた実験は、Ｌａｋ細胞が三次元で増殖させた
腫瘍細胞に対して、単層培養した細胞と比べて、より強
力な応答を誘起することを示した。免疫細胞は慣例的な
フェレーシス技法により患者から採取し、三次元培養系
で増殖させた患者自身の腫瘍細胞に感作する。
【００４５】一般に、この接種物はその組織の“幹”細
胞（“保存”細胞とも呼ぶ）を含むべきである；すなわ
ち、これらの細胞は組織の種々の成分をつくる特殊な細
胞へ成熟する新細胞を形成する。
【００４６】接種物中で使用する実質細胞または組織特
異細胞は、上記セクション５．１で間質細胞を得るため
に記述した標準技法を使って、目的の組織を解離するこ
とにより調製した細胞浮遊液から得られる。全細胞浮遊
液それ自体を三次元間質支持体マトリックスに接種する
ために使うことができる。その結果、ホモジネートに含
まれる再生細胞はマトリックス上で適切に増殖し、成熟
し、分化するが、非再生細胞はしないだろう。別法とし
て、上記セクション５．１で間質細胞を分画化するため
に記述した標準技法を使って、細胞浮遊液の適当な画分
から特定の細胞型を単離することもできる。“幹”細胞
または“保存”細胞を簡単に分離できるときは、これら
を三次元間質支持体に優先的に接種する。例えば、骨髄
を培養する場合は、三次元間質に新鮮なサンプルまたは
凍結保存サンプルから誘導された骨髄細胞を接種する。
皮膚を培養する場合は、三次元間質にメラニン細胞およ
び表皮ケラチン細胞を接種する。肝臓を培養する場合
は、三次元間質に肝細胞を接種する。膵臓を培養する場
合は、三次元間質に膵臓内分泌細胞を接種する。種々の
組織由来の実質細胞を得る方法を調べるには、Freshne
y, Culture of AnimalCells. A Manual of Basic Techn
ique, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York,1987, Ch.
20, pp.257-288を参照されたい。
【００４７】インキュベーションの間、三次元細胞培養
系は栄養培地中につりさげるか、または浮かばせる。培
養物には周期的に新鮮培地を供給すべきである。この場
合も、培養物から放れた細胞が容器の壁に付着し、そこ
で増殖して集密的細胞単層を形成しないように注意を払
うべきである。三次元培養物からの細胞の遊離は、構造
化した組織とは対照的に、散らばった組織を培養すると
き一層容易に起こると思われる。例えば、本発明の三次
元皮膚培養物は組織学的にも形態学的にも正常である；
明確に区別できる真皮および表皮層は周囲の培地に細胞
を放出しない。対照的に、本発明の三次元骨髄培養物
は、この種の細胞がインビボで骨髄に放出されるよう
に、成熟非付着細胞を培地中に放出する。前に説明した
ように、放出された細胞が培養容器に付着して集密的細
胞単層を形成すると、三次元培養物の増殖は止まるであ
ろう。このことは、培地の供給中に遊離細胞を除去する
か、三次元培養物を新しい容器に移しかえるか、容器壁
への遊離細胞の付着を防ぐために培養物を攪拌するか、
または培養物に栄養分を補給しかつ遊離細胞を除去する
のに十分な速度で新鮮培地を連続的に流すことにより回
避することができる。いずれの場合にも、遊離した成熟
細胞は回収して、その後の使用のために凍結保存してお
く。
【００４８】増殖因子および調節因子は、これらの型の
因子が三次元間質細胞によって作り出されるので、培地
に添加する必要はない。しかしながら、このような因子
の添加または他の特殊細胞の接種は培養物の増殖および
細胞成熟を高め、変更し、調節するために使用できる。
培養細胞の生育および活動はインシュリン、成長ホルモ
ン、ソマトメジン、コロニー刺激因子、エリトロポエチ
ン、表皮増殖因子、肝造血因子（ヘパトポエチン）、お
よび肝細胞増殖因子のような種々の増殖因子により影響
される。増殖および／または分化を調節する他の因子に
はプロスタグランジン、インターロイキン、および自然
界に存在するケイロンが含まれる。 4.3．三次元培養系の使用 本発明の三次元培養系はいろいろな用途に使用される。
これらには、制限するものではないが、いくつかの例を
挙げると、マトリックスから得られた培養細胞もしくは
培養マトリックスそれ自体のインビボでの移植（transp
lantation)または植え込み（implantation）；細胞毒化
合物、アレルゲン、増殖／調節因子、医薬化合物などの
インビトロスクリーニング；病気の発生過程の解明；薬
物および／または増殖因子の作用機構の研究；患者の癌
の診断および監視；遺伝子治療；並びに生物学的に活性
な物質の生産が含まれる。
【００４９】インビボでの移植または植え込みの場合
は、培養物から得られた細胞もしくは全三次元培養物
が、関係した組織の型に応じて、移植されるだろう。例
えば、三次元骨髄培養物はインビトロで長期間維持する
ことができる；これらの培養物から分離した細胞は移植
に用いられ、これに対し全培養物は植え込まれる。対照
的に、皮膚培養物では、全三次元培養物が火傷、皮膚の
潰瘍形成、外傷などを治療するためにインビボで移植さ
れる。
【００５０】三次元組織培養移植物は、本発明によれ
ば、現存の組織を取り替えたり、強化するために、新組
織または改変組織を導入するために、人工補装具を修正
するために、あるいは生物学的組織または構造体を一緒
に接合するために使用される。例えば、制限するもので
はないが、本発明の特定の実施態様には（ｉ）化学療法
により治療中に破壊された骨髄を取り替えるために使用
される三次元骨髄培養移植物；（ii）肝硬変患者の肝機
能を増強するために使用される三次元肝臓組織移植物；
（iii)三次元培養物上で増殖させた遺伝子改変細胞（例
えば、インシュリンをコードする組み換え遺伝子を発現
する繊維芽細胞の三次元培養物）；（iv）軟骨の三次元
培養物を被覆した股関節補装具；（ｖ）口腔粘膜の三次
元培養物に結合させた義歯が含まれるであろう。
【００５１】三次元培養物は細胞毒化合物、増殖／調節
因子、医薬品などの多種多様の化合物をスクリーニング
するためにインビトロで使用される。このためには、培
養物をインビトロで維持して、試験すべき化合物にさら
す。細胞毒化合物の活性は培養細胞に損傷を与えたり、
それを死滅させるその能力により測定できる。これは生
体染色技法を使って簡単に評価できる。増殖／調節因子
の効果は、マトリックスの細胞含有量を分析することに
より、例えば全細胞カウント数または示差細胞カウント
数により評価される。これは型特異細胞抗原を規定する
抗体を使う免疫細胞化学的手法の使用を含む標準細胞学
および／または組織学的手法を用いて達成される。三次
元培養系で培養した正常細胞に対する種々の薬物の作用
も評価できる。例えば、赤血球の形成を増す薬物は三次
元骨髄培養物で試験される。コレステロール代謝に、例
えばコレステロールの生産を低下させることにより、影
響を及ぼす薬物は三次元肝臓系で試験されるだろう。腫
瘍細胞の三次元培養物は、例えば抗腫瘍薬の効力を調べ
るための、モデル系として使用される。
【００５２】本発明の三次元培養物は生理学または病理
学的状態を研究するためのモデル系として使用される。
例えば、本発明の特定の実施態様において、三次元培養
系は血液脳関門のモデルとして使用され、このようなモ
デル系は血液脳関門を通過する物質の侵入を研究する上
で有用である。別の特定実施態様において、制限するも
のではないが、粘膜上皮の三次元培養物はヘルペスウイ
ルスやパピローマウイルスを研究するためのモデル系と
して使用され、このようなモデル系は抗ウイルス薬の効
力を調べる上で有用である。
【００５３】また、三次元細胞培養物は悪性腫瘍や疾病
の診断・治療を補助するために使用される。例えば、悪
性腫瘍の疑いがある患者から組織（例．骨髄、皮膚、肝
臓など）の一部切除（バイオプシー）を行う。このバイ
オプシー細胞が本発明の三次元系で培養されるならば、
悪性腫瘍細胞は培養増殖中にクローンとして増えるであ
ろう。このことは悪性腫瘍を検出する機会を増やし、ひ
いては診断の正確さを高めるであろう。これは感染細胞
集団がインビボで失われるエイズのような疾病に特に有
用である。さらに、患者の培養物は細胞毒化合物および
／または医薬化合物をスクリーニングするためにインビ
トロで使用され、これにより最も有効なもの、すなわち
悪性細胞または病気にかかった細胞を死滅させて正常細
胞に害を与えないものが同定される。これらの薬剤はそ
の後患者を治療するために使用されるだろう。
【００５４】本発明によれば、患者から比較的少量の骨
髄が採取される（患者の骨髄は化学療法または放射線に
より破壊）。その後、骨髄サンプルは適当な化学療法剤
を使って病気の細胞をパージし、インビトロで増やし、
患者に再度投与される。比較的少量の病気にかかった骨
髄を治療して効果的なパージを可能にし、続いてインビ
トロで増やすことに加えて、三次元培養系は比較的大量
のパージした骨髄にも利用できる。大部分のパージ剤の
副作用は正常造血細胞の破壊であり、これは長い移植期
間としばしば二次感染による患者の死をもたらす。急性
非リンパ球性白血病の場合に利用される有効なパージ剤
は悪性細胞の２対数死を引き起こす４−ヒドロペルオキ
シオヨロホスファミド（４ＨＣ）である。通常の処置で
は、病気にかかった骨髄５００−１０００ｍｌを６０−
１００ｎｇの４ＨＣ／ｍｌと生体外でインキュベーショ
ンすることにより治療する。その後、骨髄は凍結保存さ
れ、２−３週間の臨床化学療法の後で患者に再注入され
る。本発明によれば、匹敵する量の骨髄を採取し、４Ｈ
Ｃでパージし、その後三次元培養物を使ってインビトロ
で増やすことにより、より迅速な移植期間と患者の死の
減少が可能となる。
【００５５】インビトロ方法論は動物（マウスの骨髄移
植）とヒト（同種異系の表皮移植）の両方において移植
に使用した細胞の拒絶反応を低下させるのに有用であっ
た。三次元骨髄培養物はさらに外来抗原に対する細胞の
寛容を増すために使用することができる。これに関連し
て、提供者の造血細胞は受容者からの三次元間質細胞で
増殖させる。この種の培養物は、骨髄系のリンパ球の成
熟をうながす別の増殖因子および分化因子を供給する三
次元胸腺培養物の存在下で増殖させてもよい。造血細胞
が増殖して成熟するにつれて、それらは受容者の細胞抗
原を“自己”として認めるように教育され、それにより
これらの“外来”細胞に対して寛容になることができ
る。
【００５６】増殖細胞および組織の意図する用途に応じ
て、種々の特殊細胞が三次元培養物に加えられる。例え
ば、三次元培養物での骨髄細胞の長期増殖は、培養物へ
のある種の単核細胞集団の添加により、培地への増殖因
子の添加により、あるいは所望の増殖因子を生産するよ
うに遺伝子操作された間質細胞の使用により促進され
る。これらの培養物から集めた細胞は輸液、移植および
バンキング（banking)に使用される。三次元皮膚培養物
への患者由来のリンパ球の添加は、自己免疫病のような
免疫疾患の評価および診断に役立つ。同様に、三次元皮
膚培養物への患者由来のリンパ球および肥満細胞の添加
は、患者をアレルゲンにさらすことなく、種々のアレル
ゲンに対する患者のアレルギー反応を評価する上で役立
つ。このために、患者のリンパ球と肥満細胞を含む三次
元皮膚培養物はいろいろなアレルゲンにさらされる。肥
満細胞へのリンパ球生成１ｇＥの結合は、患者が感じや
すいアレルゲンで“架橋”したとき、ヒスタミンのよう
な血管作動性メディエーターを放出させるであろう。三
次元培養物のアレルゲンへの暴露に応答した、このよう
なメディエーターの放出を測定して、患者のアレルギー
反応の指標とすることが可能であるだろう。そして、危
険かつ有害でありうるアレルゲンに個体をさらすことな
く、アレルギー試験を実施することができるだろう。こ
の系は同様にインビトロでの化粧品の試験にも使用され
るだろう。
【００５７】本発明の三次元培養系は遺伝子治療用の遺
伝子および遺伝子産物をインビボで導入するためのベヒ
クルを提供する。例えば、組み換えＤＮＡ技術を使っ
て、患者に欠損している遺伝子をウイルスまたは組織特
異プロモーターの支配下におくことができる。この遺伝
子を含む組み換えＤＮＡ構築物を使って宿主細胞を形質
転換またはトランスフェクトし、この細胞をクローニン
グした後に三次元培養系でクローンとして増殖させる。
活性遺伝子産物を発現する三次元培養物はその産物を欠
損している個体に移植されるだろう。
【００５８】遺伝子治療での三次元培養物の使用は多く
の利点をもっている。第一に、培養物が真核細胞である
ので、遺伝子産物は適切に発現されて、活性産物を形成
するように培養下でプロセッシングされるだろう。第二
に、遺伝子治療技術はトランスフェクトされた細胞の数
を臨床上価値があるように、妥当であるように、さらに
役立つように実質的に増加しうる場合だけ有用である；
本発明の三次元培養物はトランスフェクトされた細胞の
数の増加およびトランスフェクトされた細胞の（細胞分
裂による）増幅を可能にする。
【００５９】好ましくは、使用する発現調節要素は生体
内で必要な場合だけ産物を合成するように遺伝子の調節
発現を可能にすべきである。選ばれるプロモーターは培
養する組織および細胞に幾分か左右されるだろう。蛋白
を分泌できる細胞および組織（例えば、たくさんの粗面
小胞体とゴルジ複合体により特徴づけられるもの）が好
ましい。このために、肝臓および他の腺組織が選ばれる
だろう。肝細胞を用いる場合、Ｂ型肝炎ウイルス要素の
ような肝臓特異ウイルスプロモーターが外来遺伝子を肝
細胞に導入しかつこの遺伝子の発現を調節するために使
用される。これらの細胞はその後本発明の三次元系で培
養されるだろう。また、アルブミンプロモーターのよう
な肝臓特異プロモーターも使用できる。
【００６０】すでに記載されて、使用しうる組織特異性
を示す転写調節領域の例としては、制限するものではな
いが、膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ
遺伝子調節領域（Swiftら、1984, Cell 38:639-646; Or
nitzら、1986, Cold SpringHarbor Symp. Quant. Biol.
50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:42S-51
S)；膵臓β細胞において活性であるインシュリン遺伝子
調節領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122)；リン
パ細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子調節領
域（Grosschedlら、1984, Cell 38:647-658; Adamsら、
1985, Nature 318:533-538; Alexanderら、1987, Mol.
Cell. Biol. 7:1436-1444）；肝臓において活性である
アルブミン遺伝子調節領域（Pinkertら、1987, Cenes a
nd Devel. 1:268-276）；肝臓において活性であるα−
フェトプロテイン遺伝子調節領域（Krumlaufら、1985,
Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648；Hammerら、1987, Scie
nce 235:53-58)；肝臓において活性であるα−１−アン
チトリプシン遺伝子調節領域（Kelseyら、1987, Genes
and Devel. 1:161-171)；骨髄細胞において活性である
β−グロビン遺伝子調節領域（Magramら、1985, Nature
315:338-340; Kolliasら、1986, Cell 46:89-94) ；脳
の乏突起神経膠細胞において活性であるミエリン塩基性
蛋白遺伝子調節領域（Readheadら、1987, Cell 48:703-
712）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺
伝子調節領域（Shani, 1985, Nature314:283-286)；視
床下部において活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモ
ン遺伝子調節領域（Masonら、1986, Science 234:1372-
1378)を挙げることができる。
【００６１】本発明の別の実施態様では、三次元培養物
は遺伝子導入を促進するために使用される。例えば、制
限するものではないが、組み換えウイルス発現ベクター
を含む繊維芽細胞間質の三次元培養物は、インビボでの
ウイルス伝染をまねて、組み換えウイルスを間質マトリ
ックスと接触状態にある細胞に移行させるために使用す
ることができる。三次元培養系は最近のＤＮＡトランス
フェクション技法よりも一層効果的な遺伝子導入法であ
る。
【００６２】本発明のさらに別の実施態様では、三次元
培養系が生物学的産物を高収量で生産するためにインビ
トロで使用されるだろう。例えば、自然界で特定の生物
学的産物（例．増殖因子、調節因子、ペプチドホルモ
ン、抗体など）を大量に生産する細胞、または外来遺伝
子産物を生産するように遺伝子工学的に操作された宿主
細胞は、三次元培養系を使ってインビトロでクローンと
して増殖させることができる。形質転換細胞が遺伝子産
物を栄養培地中に分泌する場合は、標準的な分離技法
（例えば、２，３の例を挙げると、ＨＰＬＣ、カラムク
ロマトグラフィー、電気泳動法）を使って使用済みまた
はならし培地からその産物を簡単に分離できる。インビ
トロで三次元培養物を供給する連続流動法を利用する
“バイオリアクター”を考案してもよい。本質的に、新
鮮培地が三次元培養物を通過するとき、遺伝子産物は培
養物から遊離した細胞と共に培養物から流出されるだろ
う。この遺伝子産物は使用済みまたはならし培地の流出
物から（例えば、ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィ
ー、電気泳動などにより）分離される。
【００６３】本発明の種々の具体例は以下のセクション
で説明する。単に説明だけのために、制限としてではな
く、本発明の三次元培養系はいろいろな系で使用する組
織および細胞の型に基づいて記載される。これらの記載
には骨髄、皮膚、肝臓および膵臓が含まれるが、これら
に限定されず、三次元培養系は他の型の細胞および組織
にも使用できることが明白である。本発明はまた記載し
たそれぞれの系でもたらされた特性データを示す実施例
によって例示される。５．三次元骨髄培養系本発明の三
次元培養物は生理学的条件に匹敵する系での骨髄細胞の
インビトロ複製をもたらす。重大なことには、この系で
複製した骨髄細胞は、培養を開始するのに使用したもと
の骨髄接種物中に全部の細胞型が存在していたと仮定し
て、正常骨髄に存在する細胞を全部含んでいる。
【００６４】骨髄細胞は単独で培養したとき増殖に限り
があるが、間質細胞またはそれらの分泌産物が存在する
ときだけこれらの培養物の長期増殖が可能である。例え
ば、Long-Term Bone Marrow Culture, D.G. Wright &
J.S. Greenberger, eds., A.R. Liss, New York, (198
4)pp.141-156 を参照されたい。
【００６５】本発明によれば、骨髄細胞は（胎児または
骨髄由来の）繊維芽細胞から成る間質細胞もしくは骨髄
の間質成分（繊維芽細胞、マクロファージ、細網細胞お
よび脂肪細胞を含む）から成る細胞型の混合物との同時
培養下に三次元支持体上で増殖させる。場合により、脾
臓および／または肝臓マクロファージ培養物の培地か
ら、あるいは間質細胞のサブセットから誘導された因子
をこの培養物に添加してもよい。本発明の三次元培養系
は、骨髄が内因性のまたは環境媒介の病気により、ある
いは化学療法および／または放射線によるこの種の病気
の治療により破壊された場合に、骨髄再生能を有する多
能性造血幹細胞の増殖を最大限に高めると考えられる。
【００６６】通常の単層細胞培養法を使用するときに
も、骨髄再生活性（ＭＲＡ）をもつ幹細胞は長期のネズ
ミ骨髄培養物中に残存して複製することが分かってい
る。このような系では、しかしながら、成熟造血細胞の
出現は主として骨髄および単球系統に限られる。ヒトお
よびヒト以外の霊長類の骨髄細胞の単層培養物は検出可
能な前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＢＦ
Ｕ−Ｅなど）の一定の減衰を示す。例えば、ネズミ系で
は、これらの単層培養物から出現する主な成熟細胞は顆
粒球である。対照的に、本発明の三次元間質系では、全
部の血液細胞系統の造血前駆細胞および造血前駆体が複
製・増殖すると思われる。さらに、分化が生理学的方法
で進むと思われる。例えば、赤血球系、骨髄系、リンパ
系、マクロファージ系、および巨核球系コロニーは、本
発明により教示された下記の系を使うことにより、同一
培養物中に連続して発生しうる。この系での幹細胞の複
製は前駆細胞の持続した増殖から推定することができ
る。 5.1．骨髄細胞を得る 接種物として使用する骨髄細胞は提供者から直接採取す
るか、または凍結保存より回収する。これらの細胞は初
めに物理的手段によってそれらの細網細胞から分離す
る。従って、提供者の腸骨稜から少量（１０−１５ｃｃ
の骨髄／末梢血懸濁体）が吸引される。移植を目的とす
る場合、この方法の結果は：（ａ）個体が彼／彼女の骨
髄を培養および／または凍結保存のために採取する時点
で４０歳以下である；および（ｂ）患者が病気にかかっ
ていない；ときに最良となる。しかしながら、本発明は
これらの基準に限定されない。提供者から骨髄を吸引す
る方法は当分野でよく知られている。骨髄を吸引する装
置および方法の例は米国特許第４４８１９４６号と同第
４４８６１８８号に開示されている。
【００６７】転移性疾患または血液の悪性疾患をもつ患
者を治療するために骨髄を培養しようとする場合、患者
から採取した骨髄は、培養に先立って、物理的または化
学療法手段により悪性細胞を“パージ”する必要があ
る。現在、物理的または化学療法パージ法は、これらの
方法が悪性細胞と正常細胞の両方を無差別に死滅させる
ので大量のサンプルを必要とする。しかしながら、選択
的パージ法が目下開発されつつある。例えば、悪性細胞
を毒性物質の標的にして、それだけを特異的に殺そうと
して、悪性細胞に対し特異的な抗体が試験されつつあ
る。このような選択的パージ法はサンプルの大きさが小
さい場合に効果的であるだろう。本発明の三次元培養系
は、小さいサンプルを効率よくパージしかつ残りの健康
な細胞を増やすことを可能にするものである。提供者か
ら採取した骨髄は複製されるか、またはあとで複製する
ために保存される。骨髄を保存する場合は、コンピュー
タを備えた低温技術装置を使って骨髄を漸増的に凍結す
ることができる。例えば、新鮮な骨髄／血液懸濁体は無
菌Nuncチューブに等量ずつ小分けして、凍結保存室が同
様の温度（４℃）になるまで砕いた氷のビーカーに入れ
ておく。標本を凍結保存室に入れる直前に、無菌技術を
使って、溶液を各Nuncチューブに、凍結保護剤のジメチ
ルスルホキシドおよびグリセロールがそれぞれ約７％お
よび５％の最終濃度となるように、添加する。凍結プロ
グラムは標本の導入直後に開始される。GryoMed 1010型
コントローラーによる凍結プログラム番号１が使用され
る。
【００６８】この技術を使って、凍結および８０℃水浴
中での急速解凍を行った後の細胞の生存能は、トリパン
ブルー排除法で検定したとき９０％を越える。さらに、
８０％以上のもとのコロニー形成単位培養物（ＣＦＵ−
Ｃ）を凍結後に回収できる。予め算定した温度および時
間曲線に従って骨髄および生物学的物質を凍結させるシ
ステムの例は米国特許第４１０７９３７号および同第４
１１７８８１号に開示されている。好ましくは、骨髄細
胞はすべての細胞代謝活性がやむ−１９６℃の液体窒素
の液相中に貯蔵される。 5.2．三次元間質マトリックスの確立 骨髄懸濁体から誘導された間質細胞は他の骨髄成分から
分離すべきである。これは当分野で知られた適当な方法
を使って達成される。例えば、骨髄懸濁体を低遠心力
（例えば、３０００×ｇ）で２０分間遠心すると、マク
ロファージ、繊維芽細胞、脂肪細胞、単核血液細胞、細
網細胞、内皮細胞を含む細胞の白色ベース（すなわち、
“バッフィコート”）が得られる。バッフィコートの細
胞はＦＢＳ、ＨＳ、ヒドロコルチゾンヘミスクシネー
ト、および適当な抗生物質を含んでいてもよいＲＰＭＩ
１６４０培地のような適当な培地に懸濁される。
【００６９】その後、細胞を三次元マトリックス上にま
く。接種物として高濃度の間質細胞を使用する場合、間
質支持マトリックスは比較的短期間に適当なサブ集密度
を達成するであろう。例えば、ｍｌ当たり約１０6 −１
０7 個の間質細胞がペトリ皿または他の適当なチャンバ
ー（例．Titer-Tek容器）に収容した無菌ナイロンメッ
シュ（米国ニューヨークのTetko社製）のような三次元
マトリックス上にまかれる。
【００７０】接種したメッシュはその後適量の栄養培地
を含む培養フラスコに入れる。三次元培養物を浮かせる
か、または培地表面より下に部分的に沈める。この培養
物は約５％ＣＯ2 ／空気中で約３５−３７℃、約９０％
以上の相対湿度にてインキュベートする。主に繊維芽細
胞である間質細胞が最初に増殖し、メッシュ開口へ増殖
し始める前に全部のナイロン繊維を完全に取り囲む。接
種物として用いた細胞の濃度により、この過程は約５−
１８日かかる。間質細胞のサブ集密度は造血細胞の接種
に先立って図１に示したものと一致すべきである。
【００７１】三次元マトリックスで増殖させた間質細胞
は骨髄細胞について先に述べたものと同じ手法を使って
凍結保存することができる。メッシュ上のサブ集密的細
胞の凍結保存の場合は、ナイロンメッシュを巻き、ＲＰ
ＭＩ１６４０（ジメチルスルホキシドおよびグリセロー
ルのような凍結保護剤をそれぞれ約５％および１５％の
最終濃度で補給した）のような適当な培地を含むNuncチ
ューブに挿入する。メッシュ上の間質細胞の凍結は＋１
℃から−４０℃まで−１℃／分の初期冷却速度で達成さ
れる。−８４℃の最終段階温度に到達するまでは、−２
ないし−３℃／分の冷却速度が最適である。このプロセ
スの間に、約２０−２５％の間質細胞がナイロンメッシ
ュから剥がれ落ちるだろう。 5.2.1．骨髄間質細胞の増殖を促進する 骨髄間質細胞の増殖における一次律速要因は、骨髄間質
細胞中に含まれる、比較的低い有糸分裂指数の繊維芽細
胞である。これらの細胞の増殖およびそれらの細胞外マ
トリックス成分の付着は、ヒドロコルチゾンヘミスクシ
ネートおよび／または自己調節増殖因子（細胞分裂速度
の速いヒト胎児繊維芽細胞の培地から誘導された）を加
えることにより促進される。
【００７２】メッシュ上の繊維芽細胞の付着および増殖
はまた、メッシュに前もって可溶化コラーゲンＩ−IV型
を被覆するか、またはヒト胎児繊維芽細胞により、ある
いはコラーゲン型を合成する能力に基づいてサブセッテ
ィングされた成人繊維芽細胞（以後“増殖促進繊維芽細
胞”と記す）により分泌されたコラーゲンを被覆したま
たは埋め込んだメッシュを使用することにより促進され
る。これに関して、増殖促進繊維芽細胞は集密的増殖に
達した時点（ヒト胎児繊維芽細胞の場合は５−７日、成
人繊維芽細胞の場合は１４−１８日）で温和なトリプシ
ン処理によりメッシュから持ち上げ、その後上述したよ
うに間質骨髄細胞を接種するか、あるいは今後の使用の
ために凍結保存する。
【００７３】本発明の一実施態様では、コラーゲンおよ
び他の細胞外マトリックス成分を合成している増殖促進
繊維芽細胞をサブ集密的増殖に達するまでメッシュ上で
増殖させる。その後、造血細胞と間質骨髄細胞の混合物
をサブ集密的増殖促進繊維芽細胞メッシュ製作物に接種
する。
【００７４】増殖促進繊維芽細胞を増やし、サブセッテ
ィングし、凍結保存する方法は次の通りである。
【００７５】（ａ）増殖促進繊維芽細胞の培養 適当な
方法はどれも増殖促進繊維芽細胞を培養するために使用
できる。例えば、繊維芽細胞は２−１０％ＦＢＳまたは
２−１０％ＨＳを補給したＲＰＭＩ１１６４０（１μｇ
／ｍｌヒドロコルチゾンヘミスクシネートおよび２μｇ
／ｍｌゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシ
ン、フンギゾンのような抗生物質が加えてある）のよう
な適当な培地で生育させる。この培養物は約５％ＣＯ2
／空気中で約３５−３７℃、約９０％以上の相対湿度に
て増殖させる。
【００７６】（ｂ）増殖促進繊維芽細胞のサブセッティ
ング 増殖促進繊維芽細胞をサブセッティングするため
に多数の方法を使用することができる。例えば、骨髄懸
濁体のバッフィコート、真皮繊維芽細胞、または死体肝
臓由来の繊維芽細胞から誘導された約５．０×１０6 繊
維芽細胞をマイクロタイターウェル（１ｍｍ2 ）にま
き、集密的に増殖させる。これらの細胞を、Ｃａ++また
はＭｇ++を含まないハンクスの平衡塩類溶液で反復洗浄
（通常、４−５回）して培養ウェルから取り出す。マイ
クロタイタープレートに残っているマトリックスは、直
接または間接標識で視覚化された種々のマトリックス成
分に対するモノクローナル抗体を利用する間接免疫蛍光
法により調べることができる。例えば、特定のマトリッ
クス成分に特異的な未標識マウスＩｇＧモノクローナル
抗体の結合は、存在するコラーゲン型を確かめるため
に、酵素で標識したまたはフルオレセインイソチオシア
ネートで標識したウサギ抗マウス免疫グロブリンＧを用
いて視覚化される。その後、ネガティブ選択が多くの技
法により達成される。例えば、懸濁細胞を、補体（例．
ＩｇＧ、ＩｇＭなど）を活性化することができかつ特定
のマトリックス成分（例．コラーゲンＩ−IV型、エラス
チン、トロポエラスチン、またはフィブロネクチン）を
規定するアイソタイプのモノクローナル抗体で処理し
て、それぞれの産物を合成しうる細胞のサブ集団を分離
する。その後、これらの細胞をモルモット補体で処理す
ると、モノクローナル抗体が結合している細胞は損傷を
受けるか、破壊されるだろう。サンプル中に残存する生
存細胞は先に述べたようにマイクロタイターウェルに再
度まき、集密的に増殖させ、そして取り出す。この分離
技術の効率は、生き残っている細胞が分泌したマトリッ
クスを、直接または間接標識により視覚化した適当なモ
ノクローナル抗体を用いて調べることにより立証され
る。
【００７７】造血細胞の最適増殖のためには、初期マト
リックスはコラーゲンIII 型、IV型およびＩ型をだいた
い６：３：１の比で含むべきである。
【００７８】（ｃ）増殖促進繊維芽細胞の凍結保存 増
殖促進繊維芽細胞は間質細胞について先に述べたものと
同じ手法を使って凍結保存することができる。間質細胞
と同様に、若干の増殖促進繊維芽細胞も凍結の間にメッ
シュから離れるだろう。しかしながら、このマトリック
スはまだ骨髄間質細胞の付着に寄与し、それ故に造血細
胞の増殖へ導くマトリックスの確立に要する時間を短縮
する。 5.3．造血細胞の接種 骨髄細胞は適当な栄養培養（例えば、ＦＢＳ、ＨＳ、ヒ
ドロコルチゾンを補給したＲＰＭＩ／１６４０、適当な
抗生物質を使用できる）に浮遊させ、三次元間質支持体
に接種する。これらの細胞は新鮮であるか、または例え
ば８０℃の温水浴中で急速融解した凍結保存サンプルか
ら誘導される。適切な濃度の細胞がサブ集密的間質細胞
メッシュ製作物に接種される。例えば、１０6 −１０7
細胞を２５ｍｍ2 プラスチック培養フラスコ内の三次元
間質マトリックスに接種し、約３３−３４℃および５％
ＣＯ2 ／空気で生育させることができる。これらの培養
物の相対湿度は約９０％以上である方がよい。３日後、
培養物の温度は約３５−３７℃に上げる。
【００７９】一般に、造血細胞はサブ集密的間質細胞に
より形成された天然ポケット内で増殖し、前駆細胞は細
胞付着層に残るだろう。この付着層はメッシュに直接付
着した細胞、またはメッシュに直接付着した細胞に付着
することにより接合された細胞である。造血コロナイゼ
ーションは速やかに起こるけれども、接種物からの造血
細胞は主に間質支持マトリックスが存在する場所に接種
するので、間質の接種が造血の律速段階であると考えら
れる。コロナイゼーションは部分的に発生した間質層に
より形成された天然間隙に起こり、さらにマトリックス
の最も外側の表面にも見られる。表面コロニーはマトリ
ックス内のものよりもやや小さく、往々にして非付着ゾ
ーンの一部であるように見える。実際には、それらはゆ
るく結合しており、培地の供給後に残存する。これらの
細胞（単層型ＬＴＢＭＣにも常に存在する）は“擬似付
着層（pseud-adherent layer）”と名付けられた（Coul
ombelら、1983, Blood 62:291-297）。
【００８０】４−５日後、成熟顆粒球、単核細胞および
赤血球がサイトスピン調製によって観察されるように非
付着層に現れる。７−１０日後、多数の造血コロニーが
メッシュ間隙に観察され、形態学的にＣＦＵ−Ｃ、混合
コロニーおよびリンパ系コロニーと一致する。巨核球の
増殖は限られるが、このマトリックスにも観察される。
平均３．６ｃｍ2 培養物は週あたり４５０−９５０のＣ
ＦＵ−Ｃをつくるだろう。
【００８１】同一個体由来の間質細胞および造血細胞か
ら成る培養物（自系）は週に２回培地を供給されるべき
である。別の個体から誘導した間質細胞メッシュ製作物
に接種された患者の骨髄から成る培養物（同種異系）
は、非付着層からの成熟免疫能細胞の十分な脱集合（de
population）を確実なものとするために、週に３回培地
を供給されるべきである。 5.4．三次元骨髄培養物の長期増殖 場合により、三次元骨髄培養物は長期増殖を促すために
単核細胞を接種することができる。末梢血単核細胞はフ
ィコール−ハイパク（Ficoll-hypaque）またはパーコー
ル（Percoll)を使ってヘパリン処理懸濁体から調製され
る。末梢血細胞および骨髄造血細胞は好ましくは同一個
体（自系）に由来すべきである。これらは静脈穿刺によ
り得られ、骨髄標本が採取される時に凍結保存される。
必要ならば、培養中に追加の末梢血細胞を患者から採取
することもできるだろう。しかしながら、転移性疾患が
疑われる場合には、初めにサンプルを上記のようなパー
ジに付すべきである。単核細胞は骨髄細胞の接種後まも
なく三次元培養物に接種される。例えば、５×１０5 −
１０6 単核細胞（単球サブ集団がこの段階の単核細胞層
の中で好適な細胞型である）を、骨髄造血細胞の初期接
種の４−５日後、その後は３週毎にメッシュ製作物に接
種する。この方法は、週基準で観測したとき、造血機能
を１０−１３％高めることができる。
【００８２】我々の経験では、集密的間質細胞培養物は
造血をサポートしないか、サポートしたとしても不十分
であるだろう。ヒト造血前駆細胞の限りない増殖は、そ
れらが必要な間質誘導増殖／調節因子を供給される場合
に、可能である。本発明の三次元培養系は、間質細胞が
サブ集密状態を維持して、造血に必要な因子を長期間に
わたって生産することを可能にする。しかしながら、こ
の期間は三次元培養系の更なる操作によって引き延ばす
ことができる。
【００８３】例えば、初期骨髄サンプルを多数のアリコ
ート（各アリコートは約１０6 造血細胞を含む）に分け
る。これらの各々をサブ集密的間質細胞メッシュ製作物
に接種する。この培養物は倒立顕微鏡を使った直接観察
により、あるいはそれぞれの培地供給後に使用済み培地
のサイトスピン調製において観察される非付着細胞の鑑
別計数によりモニターされる。集密的増殖に達する前
に、培養物をコラゲナーゼで処理し、穏やかな超音波処
理下に約６−１０分間おく。培養物から解離された造血
細胞および間質細胞は、例えば密度勾配法により、分画
化することができる。造血細胞は血球計を使って計数
し、約５０％を先に述べた方法を用いて凍結保存する。
造血細胞の残りの５０％はそれぞれ約１０6 細胞から成
るアリコートに分割され、平行して振とう・増殖させた
サブ集密的間質細胞培養物に接種される。これらが集密
的増殖に達し始めたら、同じ方法を繰り返し行う。この
技術は（ａ）必要な増殖因子をつくる微小環境を与える
ことにより造血細胞の増殖を永久のものにする、（ｂ）
移植に適した数が達成されるまで造血前駆細胞を預ける
ための連続バンクを形成する。 5.5．三次元長期骨髄培養物での造血の調節 ヒト骨髄の種々の細胞成分は三次元系で別々の培養物と
して継代培養することができる。マクロファージ、細網
細胞、脂肪細胞および繊維芽細胞を別々に増殖させ、い
ろいろな物質での処理によりそれらの分泌活動を変更で
きる。繊維芽細胞活動の調節は前に記載した通りであ
る。
【００８４】三次元メッシュ製作物による長期ヒト骨髄
培養物での造血はまた、以下の方法で培養下に増殖させ
たときの骨髄外マクロファージ（クッパー細胞）の分泌
によっても調節される。クッパー細胞（Kupffer cell）
は、例えばプロナーゼ消化により、それらの器官間質か
ら分離できる。簡単に述べると、組織標本をプロナーゼ
溶液〔０．２％プロナーゼ（Calbiochem）およびゲイス
の平衡塩類溶液（ＢＳＳ）〕中で穏やかに攪拌しながら
１時間インキュベートする。この溶液のｐＨは例えば１
Ｎ ＮａＯＨを用いて７．３−７．５に保持すべきであ
る。上記方法のあいだ３０分間隔でデオキシリボヌクレ
アーゼ（０．５ｍｇ；Calbiochem）を加え、得られた細
胞懸濁体を濾過し、３５０×ｇで１０分遠心する。ペレ
ットはゲイスのＢＳＳに再懸濁させ、パーコール（Phar
macia)勾配を使って沿岸細胞（littoral cell ；マクロ
ファージおよび内皮細胞）を細胞破片および成熟血液細
胞から分離する。得られた細胞画分は、例えば１０％ウ
シ胎児血清を加えた修飾タルベッコ培地を用いて、３分
間ずつ３回洗浄し、プラスチック培養皿に約３−４×１
０6 細胞を含む量でまく。
【００８５】１日のインキュベーション後、培地で洗っ
て非付着細胞を除き、付着細胞を約６％ＣＯ2 ／空気の
混合気体中で３３℃、約８０％を越える相対湿度にて維
持する。これらの細胞の増殖および／または分泌活動は
（ａ）ＣＯ2 ：Ｏ2 比を変える、（ｂ）培養物をラテッ
クスビーズで処理する、（ｃ）培養物をシリカで処理す
る、（ｄ）培地にプロスタグランジンＥ2 、Ｅ1 または
Ｆ2 αを加える、および（ｆ）培地にインターロイキン
１またはインターロイキン２を補給することにより刺激
することができる。マクロファージ分泌産物はこれらの
方法／物質により調節される。
【００８６】これらのマクロファージ分泌産物で調整さ
れた培地は、長期骨髄培養物の赤血球形成／顆粒球形成
比を調節するために使用される。 5.6．三次元骨髄培養系の使用 5.6.1．移 植 本発明の三次元骨髄培養物は、健康な骨髄細胞を破壊す
るか又はそれらの機能を弱める病気もしくは症状を治療
するために使用される。この方法は特に血液学的悪性腫
瘍や骨髄に移転する他の新生物の治療に有効である。本
発明のこの面はさらに、骨髄が環境因子（例えば、放射
線、毒素など）、骨髄を直接冒さない病気により必要と
された化学療法および／または放射線療法により悪影響
を受けた患者を治療する際にも有効である。これらの場
合に、もし万一患者が骨髄を直接破壊する病気またはそ
の治療が骨髄に悪影響を及ぼす病気にかかったら、健康
そうな患者から骨髄細胞を採取し、保存し、その後複製
させて再注入することができる。
【００８７】本発明の三次元培養系は骨髄移植を必要と
する患者に対していくつかの利点をもっている。患者が
彼または彼女自身の細胞を受け取っている場合、これは
自系移植と呼ばれる；このような移植は拒絶反応をほと
んど起こさない。自系移植は骨髄移植の拒絶反応の主要
原因、すなわち対宿主移植片反応を排除する。骨髄が悪
性細胞または病気にかかった細胞を含む場合、小さいサ
ンプルは本発明の三次元培養系を使うとき一層効果的に
パージされる。先に説明したように、悪性細胞または病
気の細胞をパージする選択的方法は小容量の骨髄細胞に
おいて最もうまくゆくであろう。ここに記載した三次元
培養系はこれを実行可能にするものである。従って、患
者から採取した小サンプルは悪性細胞を死滅させるが正
常細胞を助ける選択的方法を用いてより効果的にパージ
される。残存する正常細胞はその後本発明の三次元培養
系を使ってかなりの程度に増やすことができる。さら
に、本発明方法は化学療法剤および放射線による新生物
疾患のより積極的な治療を可能にする。現在のところ、
これらの治療の程度は骨髄毒性によりしばしば制限され
る。 5.6.2．患者の症状をモニターする 癌または他の病気をもつ患者では、患者の骨髄の一部を
吸引し、そのサンプルを試験することにより、患者の症
状をモニターすることが往々にして効果をあげている。
この方法では、転移や再発が臨床的に明らかになる前に
検出できる。骨髄細胞を調べることにより検出しうる他
の疾患をもつ患者もこの方法でモニターすることができ
る。
【００８８】本発明の三次元系を使用する場合、パージ
していない吸引骨髄標本から誘導された細胞の長期増殖
は、染色体異常をもつクローン転移性細胞および造血細
胞の検出可能性を高める。この種の細胞は本発明の三次
元培養系でクローンとして増やされるために、一層簡単
に検出できるだろう。これらの細胞は吸引したての（未
培養の）骨髄の普通の標本では検出を逃れるかもしれな
い。 5.6.3．化合物のスクリーニング 医薬品、抗癌剤、発癌物資、食品添加物および他の物質
の骨髄に対する細胞毒性は本発明のインビトロ骨髄複製
系を使うことにより試験される。
【００８９】初めに、安定した、増殖しつつある骨髄細
胞培養物（間質細胞と造血細胞の両方を含む）を確立す
る。次に、この培養物をいろいろな濃度の被検物質にさ
らす。被検物質とインキュベーション後、培養物を位相
差顕微鏡で観察して最大許容量（ＨＴＤ）−最初に形態
学的異常が現れる被検物質の濃度−を決定する。細胞毒
性試験は、当分野でよく知られた技法により、この三次
元系で細胞生存能を評価するために種々の超生体色素を
使って行われる。ＨＴＤの決定は更なる試験のための濃
度範囲を与える。
【００９０】ひとたび試験範囲が確立されると、いろい
ろな濃度の被検物質が、当分野でよく知られた手法によ
り、骨髄培養物を構成する様々な細胞型の生存能、増殖
および／または形態に対するそれらの影響について試験
される。
【００９１】同様に、薬物の有益な効果がインビトロで
三次元培養系を使って評価される；例えば、増殖因子、
ホルモン、赤血球形成を促進する薬物などが試験される
だろう。この場合も、安定した増殖しつつある培養物を
被検物質にさらす。インキュベーション後、培養物は被
検物質の効能の指標として生存能、増殖、形態、細胞型
などを調べる。いろいろな濃度の薬物が用量−反応曲線
を引き出すために試験される。
【００９２】本発明により開示された他の三次元細胞培
養系も細胞毒性試験および薬物のスクリーニングでの使
用に適している。細胞毒性検定での三次元骨髄培養物の
使用の例は以下のセクション１８に示してある。 ６．三次元皮膚培養物系 本発明の三次元培養系は、生理学的条件に匹敵する系で
の上皮および真皮要素のインビトロ複製を与える。重要
なこととして、この系で複製する細胞は適切に分離（se
gregate）して、形態学的および組織学的に正常な上皮
および真皮成分を形成する。
【００９３】上皮および真皮細胞の増殖における三次元
同時培養系の使用は、現在用いられている単層系と比べ
て多くの利点をもっている。このモデルは正常な細胞−
細胞相互作用、天然増殖因子の分泌、およびインビボで
見られるものと殆ど同じ結合組織網状構造の確立を可能
にする；特に、間質細胞は型特異および種特異コラーゲ
ンをつくり出す。完全に分離しうるこのメッシュ製作物
は移植されるか、凍結保存されるか、または細胞毒性お
よび薬物の作用機序の研究において標的組織として使用
される。さらに、このモデルは真皮同等物を形成するた
めの繊維芽細胞単独の増殖、あるいは完全な厚さの皮膚
同等物を形成するための表皮ケラチン細胞およびメラニ
ン細胞と一緒の繊維芽細胞の増殖を可能にする。この三
次元系中の細胞はすべて代謝的に活性のままであり、し
かも他の多くのモデルと比べて大きな利点である有系分
裂を受ける。
【００９４】本発明の三次元皮膚培養物は、化合物のス
クリーニングのための基質としてのその使用、移植およ
び皮膚移植、皮膚病の研究および治療を含めて多種多様
の用途をもっている。例えば、有毒でありうる化学物質
の徹底的な試験の必要性が一般的に認められており、さ
らに薬物、化粧品、食品添加物および殺虫剤を評価する
ための感度のよい、再現性のある、短期インビトロ検定
を開発することが明らかに必要である。ここに記載した
三次元皮膚モデルは検定基質としての組織同等物の使用
を可能となし、インビボ状態にきわめて似ている系での
正常細胞相互作用の利点をもたらす。
【００９５】火傷の患者のための皮膚置換の必要性もま
た明白である。米国やヨーロッパの数カ所のセンター
は、火傷や慢性潰瘍を永久にカバーするために、培養し
たヒト表皮ケラチン細胞同種異系移植片および自己移植
片を利用している（Eisingerら.,1980, Surgery 88:287
-293; Greenら.,1979, Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:5665
-5668; Cuonoら，1987, Plast.Reconstr. Surg. 80:626
-635）。これらの方法はしばしば不成功に終わり、最近
の研究は、移植上皮層の下に形成された１つ以上の結合
組織成分に異常があるために、治癒移植物に水疱形成お
よび／または皮膚ぜい弱性が見られることを明らかにし
た（Woodleyら，1998, JAMA 6:2566-2571）。本発明の
三次元皮膚培養系は上皮および真皮の両方の皮膚同等物
を提供し、広く用いられている培養表皮ケラチン細胞移
植片に特有の諸問題を解決するであろう。細胞毒性およ
び皮膚置換に加えて、三次元皮膚培養物は皮膚病を研究
して新薬および治療法を開発するためのモデルとして、
または天然に分泌される薬理活性物質の供給源として、
多くの産業分野で応用することができる。 6.1．三次元間質支持体の確立および真皮同等物の形成 三次元マトリックスへの繊維芽細胞の接種およびそれら
のサブ集密的増殖は真皮同等物の形成へ導く。本発明の
好適な実施態様では、全部の増殖支持体が覆われるまで
繊維芽細胞を増殖させる；繊維芽細胞は集密的増殖に達
した後でさえも、三次元培養物が細胞の退去を可能にし
て接触阻止を抑制するので、繊維芽細胞は分裂し続ける
ことに留意されたい。接触物としてどのような繊維芽細
胞を使用してもよいが、皮膚繊維芽細胞は適当な型のコ
ラーゲンを生産しかつ他の真皮構成成分をつくるので、
それらを使用することが有利である。繊維芽細胞は同種
異系か自系であり、真皮組織の機械的および／または酵
素的解離により調製した細胞懸濁体から容易に得ること
ができる。得られた細胞懸濁体をまく場合、繊維芽細胞
は他の細胞より速やかに付着するだろう。これらは集密
的に増殖させ、温和な酵素処理で取り出して、先に述べ
た三次元マトリックスに接種することができる。
【００９６】ひとたび三次元マトリックスに接種すれ
ば、繊維芽細胞の付着がすぐに（例えば、数時間以内
に）見られ、そして繊維芽細胞は数日以内にマトリック
ス開口部を横切って広がり始める。これらの繊維芽細胞
は代謝的に活性であり、細胞外マトリックスを分泌し、
活動的な細胞芽細胞とコラーゲンから成る真皮同等物を
速やかに形成する。あとで接種される上皮細胞の増殖を
助けるためには、三次元マトリックス上に約６０％の集
密度の繊維芽細胞が必要とされる。
【００９７】繊維芽細胞単独の使用は真皮同等物として
機能する三次元間質マトリックスを形成するのに十分で
あるが、別の型の間質細胞を三次元マトリックスに接種
してもよい。これらには、制限するものではないが、内
皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、リンパ球、
形質細胞、脂肪細胞などが含まれる。 6.2．真皮同等物への上皮細胞の接種 完全な厚さの皮膚、すなわち上皮層と真皮層の両方から
成る皮膚を培養するためには、上皮細胞を真皮同等物に
接種すべきである。このために、メラニン細胞と表皮ケ
ラチン細胞を同時に、または好ましくは順々に接種され
る。例えば、間質マトリックスに前もって接種されたサ
ブ集密約メラニン細胞に表皮ケラチン細胞を接種する。
【００９８】メラニン細胞と表皮ケラチン細胞は線維芽
間質細胞との関係において同種異系か自系であり、真皮
層と上皮層を分離するためにトリプシンのような消化酵
素中で皮膚をインキュベートすることを含む既知方法を
使って、皮膚から分離することができる。
【００９９】例えば、制限としてではなく、メラニン細
胞とケラチノサイトは次のように分離される。組織サン
プル（例えば、包皮）は全表面が抗生物質にさらされる
ように形を整える。初めに、組織を濃厚な抗生物質溶液
中で２０分間洗い、続いて１０分間ずつ２回洗う。その
後、組織の外側部分は小片に切断し、０．１５％トリプ
シン溶液（カルシウムまたはマグネシウムを含まないＰ
ＢＳ中）にいれ、すばやく取り出し、同一のトリプシン
溶液の新しい容器に（全部の組織が溶液で覆われるよう
に）いれ、約２−８℃で一晩冷却する。翌日、組織片を
トリプシン溶液から取り出し、曲がった鉗子を使って真
皮から上皮を分離する。上皮はコニカルチューブにい
れ、ＰＢＳ（カルシウムまたはマグネシウム不含）中の
約０．１５％トリプシンを使って組織を消化し、単細胞
懸濁体を得る：この方法を促進するために、サンプルを
パスツールピペットから繰り返し吸ったり出したりす
る。サンプルが単細胞懸濁体であると見えたら、それを
１４４０×ｇで約７分遠心し、その後メラニン細胞を選
択する増殖培地または０．０１ｍｇ／ｍｌのＰＭＡを含
む増殖培地に再懸濁する。こうして、表皮ケラチン細胞
またはメラニン細胞の培養物が得られる。上皮細胞は懸
濁して、真皮同等物に接種するために使われる。別法と
して、上皮細胞懸濁体をプレートにまき、メラニン細胞
と表皮ケラチン細胞をそれらの異なる付着特性に基づい
て分離することもできる。分離したメラニン細胞は初め
に真皮同等物に接種し、表皮ケラチン細胞の接種に先立
って２，３日増殖させる。この“組織”は速やかに増殖
し、外因性増殖因子を含まない栄養培地中に維持するこ
とができる。
【０１００】すべての皮膚置換の欠点は移植面に毛包、
汗腺および皮脂腺が不足することである。この欠陥によ
り、患者は温度調節ができず、重症の乾燥肌となり、ま
たコントロールできない程に激しい動悸を起こす。この
問題を軽減するために、影響をうけていない皮膚面から
バイオプシーを切除し、これを真皮同等物に移植する。
これらのバイオプシーを戦略的に位置づけることによ
り、毛包と関連した腺が移植部位に導入される。バイオ
プシーはその大きさが好ましくは約４−８ｃｍの範囲で
あり、標準的なベイカーのパンチ（Baker's punch）に
より切除しうる。その後、同じ大きさのバイオプシーを
真皮移植物から取り出し、毛包含有移植物と置き換え、
これにより組織学的に正常で、機能的に正常な皮膚と類
似した移植部位をつくることができる。
【０１０１】例として、制限としてではなく、三次元皮
膚細胞培養系は次のようにつくられる： （ａ）インビトロ骨髄複製系で使われる増殖促進繊維芽
細胞に関して先に記載したように、繊維芽細胞をメッシ
ュに付着させ、約７−９日間培養してサブ集密的増殖を
達成させ、そしてコラーゲンＩおよびIII型を沈着させ
る； （ｂ）メラニン細胞をこの間質メッシュにまき、約５日
間サブ集密的に増殖させる； （ｃ）表皮ケラチン細胞をサブ集密的メラニン細胞に接
種する。
【０１０２】本発明の好適な実施態様では、三次元皮膚
細胞培養系は以下のように作製される： （ａ）繊維芽細胞をメッシュに付着させ、約１４日間培
養して集密的増殖を達成させ、そしてコラーゲンＩおよ
びIII型を沈着させる； （ｂ）メラニン細胞をこの間質メッシュにまき、約５日
間サブ集密的に増殖させる； （ｃ）表皮ケラチン細胞をサブ集密的メラニン細胞に接
種する。
【０１０３】本発明の特定の実施態様では、例えば、火
傷の患者に対して、負傷後直ちに傷をカバーで覆うこと
が有利である；このような場合は、大部分が繊維芽細胞
から成りかつ真皮に対応する本発明の三次元細胞培養物
（以後新真皮（neodermis）と呼ぶ）を負傷部の上に載
せ、その後メラニン細胞と表皮ケラチン細胞を加える。
新真皮は患者に対して自系または同種異系の細胞であり
うる。上皮細胞は患者に対して同種異系であってもよい
が、好ましくは自系である。本発明は、インビボまたは
インビトロで上皮細胞を加えることのできる、増殖しつ
つある新真皮の移植を包含する；また、患者自身の細胞
が移植した新真皮に植え込まれてもよい。 6.3．三次元皮膚培養物の形態学的特性決定 三次元間質の形態学的特性決定により、マトリックスに
接種された繊維芽細胞は開口部を横切って広がり、マト
リックス沈着を示し、そしてメッシュ間隙に移行するこ
とが分かる。図１は、繊維芽細胞が天然に分泌されたコ
ラーゲン束の間に平行層にそれら自体を配列する能力を
もつことを示す。これらの繊維芽細胞は迅速な細胞分裂
と蛋白分泌を示す。メラニン細胞は、それらが樹状突起
の形成を示し、色素を産生し、色素を移行させる能力を
保持するという点で三次元系において正常に増殖するで
あろう（図６−８参照）。
【０１０４】完全な厚さの皮膚は空気を接触させるいろ
いろな方法で増殖させることができる。表皮ケラチン細
胞を空気にさらすと、表皮ケラチン細胞のより速やかな
分化とケラチン層のより豊富な分布（皮膚浸透実験にお
いて非常に重要である）が促進される。
【０１０５】皮膚科学的研究および移植実験に通常使用
される方法と比べたときのこの細胞培養系の主な利点
は、先に述べたように、サブ集密的または集密的な、三
次元マトリックスの繊維芽細胞が代謝的に活発であり、
天然増殖因子と自然界に存在するコラーゲンＩおよびII
I型を分泌するということである。これらの細胞の正常
な代謝活動のために、この系は細胞毒性検定およびコラ
ーゲン分泌に直接影響を与える疾患の研究、または真皮
細胞と上皮細胞間の相互作用が病気と一致した病理学的
変化をもたらす疾患の研究に使用することが特に有利で
ある。 6.4．インビボ移植 移植または植え込みのためには、生物分解性の材料（例
えば、腸線縫合糸、ゼラチンなど）から作製された三次
元マトリックスを使用することが好ましい。これらは三
次元系の利点をすべて可能にし、しかもメッシュが生体
によって自然に分解・吸収され、その領域に移行する正
常細胞と置き換わるのに対し、移植した“組織”をその
まま残すことができる。
【０１０６】三次元間質マトリックスをつくるために
は、移植を受けようとする患者から得られた皮膚繊維芽
細胞を用いることが好ましい。また、胎児繊維芽細胞あ
るいは胎児繊維芽細胞と患者の繊維芽細胞の混合物も使
用できる。しかしながら、本発明によれば、自系、同種
異系、または異種系の供給源に由来する繊維芽細胞も使
用される；実施例セクション１９には、本発明に従って
ヒト繊維芽細胞を培養し、ブタに上首尾で移植した本発
明の特定の実施態様が示してある。しかしながら、より
重要なこととして、あとで接種される上皮細胞は移植の
拒絶反応のリスクを最小限に抑えるために患者から誘導
することが有利である。
【０１０７】本発明のこの面の別の実施態様では、新真
皮を形成する三次元間質支持マトリックスそれ自体が患
者の損傷部に移植される。この場合、損傷部の患者自身
の上皮細胞が間質マトリックスに侵入し、この間質マト
リックス上でインビボ増殖して、完全な厚さの皮膚（す
なわち、上皮層と真皮層の両方）を形成するであろう。
これとは別に、新真皮の上に上皮細胞をまいたり、上皮
細胞のシートを載せることもできる。大きな負傷面をカ
バーしようとする場合は、完全な三次元皮膚培養物を移
植すること、または新真皮と完全な厚さの皮膚培養物の
両方を併用することが好適である。例えば、増殖および
治癒を促進しかつ傷痕の形成を最小限にくい止めるため
に、新真皮は傷の縁部に移植され、完全な厚さの培養物
は傷の中心部に移植されるであろう。 6.5．三次元皮膚培養物のインビトロ使用 三次元皮膚培養物はインビトロで維持することができ、
毒性についての化合物のスクリーニング、薬物の作用機
序の研究、皮膚病の研究など、いろいろな目的に使用さ
れる。
【０１０８】三次元皮膚培養物は化合物や他の物質の細
胞毒性を試験するための基質として利用される。例え
ば、細胞毒性検定で使用するために、９６−ウェル平底
組織培養マイクロテストプレートに置いて適当な培地を
供給したメッシュ（６ｍｍのディスクに切断）上でヒト
細胞を増殖させる。その後、各サンプルに被検物質を加
える。被検物質は限界希釈法により有利に添加され、こ
の場合には、毒性物質の濃度範囲を試験することができ
る。３通りのデータを得るために、それぞれの組織型は
３列のメッシュにより表される。適切な制御された検定
は次のように行われるであろう：メッシュ単独；繊維芽
細胞を接種したメッシュ；繊維芽細胞と表皮ケラチン細
胞を接種したメッシュ；繊維芽細胞とメラニン細胞を接
種したメッシュ；および繊維芽細胞、表皮ケラチン細胞
およびメラニン細胞を接種したメッシュ。これらの基質
のそれぞれに化学物質を加え、例えば２４時間インキュ
ベートする。この種の物質の細胞毒性作用は多くの方法
を使って評価される。例えば、慣用方法である、よく知
られたニュートラルレッド検定がこの系で使用するのに
適しているだろう。このために、培地を除去した後、各
ウェルを洗い、ニュートラルレッド色素の０．４％水性
原液を加える。異なる時間の経過後、色素を除き、細胞
を４．０％ホルムアルデヒド、１．０％ＣａＣｌ2 で速
やかに洗う。約２０分後、各組織サンプル中に存在する
色素の量を、５４０nmフィルターを備えたＤｙｎａｔｅ
ｃｈマイクロプレートリーダーで吸光度を読み取って測
定する。吸収された生体色素の量はウェル中に存在する
生存細胞の数に直接比例する。読み取った値を平均し
て、結果を対照培養物の基底線レベルに対する観察され
た吸光度として表す。
【０１０９】最近の研究は、皮膚が免疫系の欠くことの
できない活性要素であることを示した（Cooperら., 198
7, The mechanobullous diseases. In:Dermatilogy in
General Medicine, 3d. Ed., McGraw Hill, NY, pp.610
-62）。いろいろな免疫活動の原因となる主要な皮膚細
胞の１つはランゲルハンス細胞である。これらの細胞を
新鮮な皮膚サンプルから調製し、三次元皮膚培養物に加
えて免疫学的に完成した組織系をつくることが可能であ
る。これらの細胞を通常の組織培養技術で長期間培養下
に増殖させることは困難である。三次元系でこれらの細
胞を増殖できることは、移植、細胞毒性および病気の機
構を含むあらゆる研究面で非常に重要であるだろう。こ
のタイプの皮膚培養系は直接または間接の皮膚病変を伴
う自己免疫疾患（エリテマトーデス、水疱性類天疱瘡な
ど）に関連した研究に最大の効果を発揮するであろう。
【０１１０】先に説明したように、三次元皮膚培養物は
アレルゲンに対する感受性を試験する際にも使用され
る。アレルギー試験の場合には、皮膚培養物に患者由来
の肥満細胞およびリンパ球（または形質細胞）を接種す
る。肥満細胞に結合したＩｇＥ抗体（リンパ球により生
産された）を“架橋”するアレルゲンにこの培養物をさ
らすと、肥満細胞によってヒスタミンのような血管作動
性メディエーターが放出される。培養物におけるヒスタ
ミンの放出を測定して、試験したアレルゲンに対する患
者のアレルギー反応と相関させる。 ７．三次元肝臓組織培養系 肝細胞はヒト肝臓生検または剖検材料に適合する慣用方
法（Berry and Friend, 1969, J.Cell Biol, 43:506-52
0）により単離される。簡単に説明すると、カニューレ
を門脈または門脈枝に挿入し、組織が青白く見えるよう
になるまで肝臓にカルシウム不含またはマグネシウム不
含緩衝液を灌流する。その後、この器官にコラゲナーゼ
溶液のような蛋白分解酵素を適度な流速で灌流する。こ
れは結合組織の枠組を消化するはずである。次に、肝臓
を緩衝液で洗い、細胞を分散させる。細胞懸濁体は７０
μｍナイロンメッシュを通して濾過し、細胞破片を取り
除く。肝細胞は２回または３回の分別遠心により細胞懸
濁体から選別する。
【０１１１】切除したヒト肝臓の個々の小葉の灌流にお
いては、ＨＥＰＥＳ緩衝液が使用される。ＨＥＰＥＳ緩
衝液中のコラゲナーゼの灌流は約３０ｍｌ／分の速度で
達成される。単細胞懸濁体はコラゲナーゼと３７℃で１
５−２０分間さらにインキュベートすることにより得ら
れる（Guguen-Guillouzo and Guillouzo, eds, 1986,
“Isolated and Culture Hepatocytes”Paris, INSERM,
and London, John Libbey Eurotext, pp.1-12; 1982,
Cell Biol. Int. Rep, 6;625-628）。
【０１１２】その後、単離した肝細胞は三次元間質に接
種する。接種した間質は骨髄および皮膚のところで記載
したように培養して、生理学的条件に匹敵する系で肝細
胞をインビトロ複製する。これは肝細胞による機能的発
現の増加をもたらすであろう。この方法で維持された肝
臓培養物は細胞毒性試験、薬物のスクリーニングなどを
含むいろいろな目的に利用される。１つの実施態様で
は、三次元肝臓培養物を使って、発癌物質および突然変
異原をインビトロでスクリーニングすることができる。
より詳細には、多数の化合物は細菌や真菌のような試験
生物において突然変異原として作用しないが、マウスの
ような動物では腫瘍を発生させることがよく知られてい
る。これは代謝活性化のためである；すなわち、一部の
化学物質は肝臓（Ｐ４５０オキシダーゼ系およびヒドロ
キシル化系）または他の組織で酵素により代謝され、突
然変異原性でかつ発癌性である新しい化合物を生成す
る。このような発癌物質を同定するために、Ａｍｅｓと
彼の共同研究者は、試験生物を代謝産物にさらす前に、
化学物質を肝臓抽出物とインキュベートすることを含む
スクリーニング検定を提案した（Amesら., 1975, Mut.R
es. 31:347-364）。Ａｍｅｓの検定法は、比較的精巧な
方法であるが、まだ感度に乏しい。対照的に、三次元肝
臓培養物は被検物質の突然変異原性または発癌性を調べ
るための代謝変換体および“試験生物”として利用する
ことができる。 ８．血液−脳関門のための三次元モデル系 本発明によれば、血液−脳関門のための三次元組織培養
モデル系が作製される。簡単に説明すると、初めに三次
元メッシュで脳の小血管から誘導された内皮細胞を集密
的に増殖させることにより、中枢神経系を血流から分離
する内皮細胞バリヤーを作製する。最初に星状細胞を、
次に神経細胞を、内皮細胞により形成された集密的間質
マトリックスに加える。その結果として、内皮細胞は培
養物の一面（上）と神経細胞（下）の間にバリヤーを形
成する。内皮細胞表面に加えられた物質は、下方の神経
細胞に達するためには、内皮細胞層を通って侵入しなけ
ればならない。
【０１１３】例えば、内皮細胞はＬａｒｓｏｎらの方法
（1987, Micro-vasc,Res, 34:184）に従って脳の小血管
から分離し、標準方法を使ってインビトロで培養してそ
れらの数を増やす。その後、小血管内皮細胞を適当なメ
ッシュ（例えば、Tetko 社で作製されたナイロン濾過ス
クリーン；＃３−２１０／３６）に接種し、完全集密的
に増殖させる；銀染色を使って、小血管内皮に特有で、
内皮の“バリヤー”機能と関連した密着結合複合体の存
在を確かめる。
【０１１４】神経細胞と星状細胞はその後胎児または周
生期ラットから採取し、標準方法を使って互いに分離す
る（Hattanら., 1988, J.Cell Biol. 106:）。例えば、
神経細胞は支持体に対する分別付着により星状細胞から
分離でき、星状細胞は１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リ
シンを塗布した皿に付着し、神経細胞は５００μｇ／ｍ
ｌのポリ−Ｄ−リシンを塗布した皿に付着する。
【０１１５】星状細胞は集密的内皮細胞三次元間質マト
リックスに接種し、約５日間培養した後神経細胞をさら
に接種する。
【０１１６】多重層三次元組織培養系は１つの小血管内
皮細胞層ともう１つの星状細胞と神経細胞の層から成
り、インビボで見られる血液−脳関門の構造（ここで
は、血液中の物質は脳の神経組織に達するために小血管
の内皮を通過しなければならない）を再現する。この系
は血液−脳関門を通過する物質の能力を試験するために
用いられる。多くの物質はこの関門を通過することがで
きないので、被検物質の通過能力を迅速にスクリーニン
グするためのインビトロ系の必要性が存在する。例え
ば、多くの抗生物質は血液−脳関門を通過することがで
きない。新たに開発された抗生物質をそれらの通過能力
について迅速にスクリーニングできることは有益である
だろう；中枢神経系の感染症の治療に用いられる抗生物
質は比較的少数しかなく、その多くはペニシリンに関係
しているため、アレルギー反応の危険性を伴うので、新
しいＣＮＳ作動薬が早急に開発される必要がある。 ９．三次元膵臓組織培養系 膵臓腺房細胞の懸濁液は、他の研究者により記載された
技術を適合させることにより製造しうる（RuoffおよびH
ay,1979，Cell Tissue Res. 204:243-252; およびHay,
1979,“Methodological Surveys in Bioche-mistry 第
８巻、Cell Populations.”London, Ellis Hornwood, L
td., 第143-160頁）。簡単に述べると、細胞を細断し、
カルシウム不含、マグネシウム不含緩衝液中で洗う。細
断された組織断片をトリプシンおよびコラゲナーゼの溶
液中でインキュベートする。解離した細胞は２０μｍナ
イロンメッシュを使用して濾過し、ハンクス平衡塩類溶
液のような適当な緩衝液中に再懸濁し、そして遠心にて
ペレットにしうる。得られた細胞ペレットは最小量の適
切な媒質中に再懸濁して前述のようにして調製された三
次元間質上に接種しうる。腺房細胞はチモーゲン小滴封
入体に基づき確認できる。三次元間質系中における膵臓
腺房細胞の培養により培養中の細胞の生存が延長される
筈である。 10．実施例：三次元骨髄培養系 以下のサブセクションは、三次元培養系がヒト、ヒト以
外の霊長類（マカークザル）およびラットに対する長期
間骨髄培養物の確立に使用できることを示す。三次元培
養物は走査型電子顕微鏡により評価され、そして、細胞
性含量は多くの方法により評価した。前駆細胞含量はＣ
ＦＵ−Ｅにより、そして細胞性含量は種々の造血細胞系
に特異的な標識モノクーロナル抗体を使用する種々の計
測およびサイトフルオログラフィー分析により評価し
た。
【０１１７】この結果は、ヒト、マカークザルおよびラ
ット細胞の非付着および付着ゾーンの分画計測により証
明されるように、三次元培養系により数種の血液学的系
統の発現が支持されることを示している。三次元間質す
なわち付着ゾーンに付着した細胞のサイトフルオログラ
フィー分析により、初期および後期の骨髄性前駆体、成
熟顆粒球、ＢおよびＴリンパ球、巨核球／血小板および
単球／マクロファージの存在が明らかにされた。マトリ
ックス中に存在する前駆細胞の数は変動性であるが、こ
れは支持マトリックスを形成するのに用いられた間質細
胞のランダムな集団から生じた可能性がある。造血は、
増殖と関連する活性および支持細胞により生成された因
子の如何による可能性があるから、三次元培養物は間質
細胞の集密単層をも含有するフラスコ中で成長させた。
三次元培養系における造血細胞および間質細胞両者の抑
制は集密間質細胞の存在下で観察された；すなわち、フ
ラスコ内の間質細胞の集密単層は、三次元培養系を「シ
ャットアウト」すると思われる。三次元培養物を新しい
フラスコに移すと、造血が回復することが観察された。
この結果は、間質細胞産物が造血細胞ばかりでなく、他
の間質性要素にも影響することを示唆している。
【０１１８】以下のサブセクションにおいては、方法、
結果およびデータをより詳細に記載する。 10.1．骨髄試料の調製 10.1.1．ヒト骨髄 告知と同意後の血液学的に正常な成人志願者の背部腸骨
稜上の複数部位から骨髄を吸収した。標本はヘパリン添
加管に集め、そして１０％ＦＢＳおよび５〜１０％ＨＳ
で馴化し、ヒドロコルチゾン、フンギゾーン（fungizon
e）およびストレプトマイシを補充したＲＰＭＩ１６４
０培地８ｍｌ中に懸濁させた。細胞塊をばらばらにさせ
るに５×１０6 核形成細胞ずつに分割した。 10.1.2．非ヒト霊長類骨髄 無傷のシノモルグス マカークの大腿骨をCharles Rive
霊長類センター(Porter Washington, NY)から購入し
た。大腿骨の骨端を無菌条件下で骨幹から分離した。赤
色髄をとり出し、培地中に懸濁させ、そして５×１０6
核形成細胞ずつに分割した。 10.1.3．ラット骨髄 成体雄Long-Evansラット（225-400ｇ）をエーテルで麻
酔し、その大腿骨をとり出した後、ヘパリン添加注射器
を用いて腹部大動脈から放血させた。大腿骨を分割し、
骨髄内容物を１０％ ＦＢＳおよび１０％ＨＳで馴化し
ヒドロコルチゾン、フンギゾーン、ヘパリンおよび抗生
物質を補充したＦｉｓｃｈｅｒ 培地（Gibco, NY）３
ｍｌを含有する滅菌ペトリ皿にかき集めた（Naughton
ら、1987，J. Med．18:219-250）。５〜７×１０6 細
胞ずつが調製された。 10.2．三次元間質マトリックスの確立 以下の実施例において記載するすべてのＬＴＢＭＣを支
技するための鋳型として、ナイロン濾過スクリーン（＃
3-210/36，Tetko Inc.，NY）を使用した。このスクリー
ンは、直径９０μｍの繊維からなり、２１０μｍの篩開
口部を有するスクウェア織りパターンに組み立てられた
繊維から成っていた。間質細胞は以下のサブセクション
記載のプロトコルを用いて接種した。間質要素の付着お
よびその後の増殖は倒立位相差顕微鏡および走査型電子
顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して監視した。 10.2.1．ヒトのＬＴＢＭＣのためのスクリーンの調製お
よび間質細胞の接種 ８ｍｍ×４５ｍｍのスクリーン片を０．１Ｍ酢酸中に３
０分間浸漬しそして支持細胞の付着を高めるために１０
ｍＭポリリジン懸濁液で１時間処理した。これらを滅菌
ペトリ皿に入れ、５×１０6 個のヒト骨髄細胞又は同数
のヒト胎児繊維芽細胞（＃GM 1380，Coriell Institut
e，NY）を接種した。ヒト胎児繊維芽細胞は１０％、Ｆ
ＢＳ、５〜１０％ＨＳで馴化し、ヒドロコーチゾン、フ
ンキゾーンおよびストレプトマインシを補添したＲＰＭ
Ｉ1540培地を用い、３５℃、５％ＣＯ2 、および９０％
を越える相対湿度で単層に集密化するまで増殖させた。
これらの細胞をコラゲナーゼ（10μｇ／ｍｌで15分間）
を用いて上に上げそしてスクリーン上に移した。５％
ＣＯ2 で１〜２時間インキュべーション後、スクリーン
をコーニング２５ｃｍ2 培養フラスコに入れ、そしてさ
らに５ccの培地を用いて浮遊させた。骨髄間質細胞が接
種されたスクリーンを同様の方法で移した。 10.2.2．非ヒト霊長類ＬＴＢＭＣのためのスクリーンの
調製および間質細胞の接種 ２個のマトリックスをサルの細胞のＬＴＢＭＣに使用し
た：（上述のとおりの）ヒト胎児繊維芽細胞を接種した
ナイロンメッシュおよびシノモルグス マカークからの
５×１０6 個の大腿骨細胞を接種したナイロンメッシ
ュ。培養条件およびスクリーン前処理プロトコルは上述
したヒト培養物について用いられたと同一であった。 10.2.3．ラットＬＴＢＭＣのためのスクリーンの調製お
よび間質細胞の接種 ８ｍｍ×４５ｍｍのナイロンスクリーン片を０．１Ｍ酢
酸に３０分間浸漬しそして可溶化したIV型マウスコラー
ゲン（GLBCO labs，NY）を用いて１〜２時間被覆した。
このスクリーン５−７×１０6 個のLong-Evansラット大
腿骨髄細胞を接種し、３３℃、５％ ＣＯ2 で１−２時
間インキュベーション後のこのメッシュを２５ｃｍ2 培
養フラスコに移した。スクリーンを浮遊させるために、
５ｍｌの培地を添加した。 10.3．三次元間質基質への造血細胞の接種および培養の
確立 約７０％のメッシュ開口部が支持細胞により架橋された
ところで（ラット間質では１０−１４日、ヒト又はサル
間質では７−１３日、そしてヒト胎児繊維芽細胞では４
〜７日）、スクリーンを無菌ペトリ皿に移しそして５×
１０6 個のヒト又はサルの核形成した骨髄細胞又は２〜
５×１０6 個のラット大腿骨髄細胞をそれぞれ接種し
た。５％ ＣＯ2 中で２時間インキュベーション後、各
スクリーンを５ｍｌの培地を添加した２５ｍ2 コーニン
グフラスコ中で穏やかに浮遊させた。培養物には、消費
した培地を新しい培地で代えることにより５日毎に供給
した。培養容器を容器の壁面上の細胞単層の出現につい
て検査した。かかる単層が２５％以上の集密度で存在し
た場合には、三次元培養物を新しいフラスコに移した。 10.4．三次元骨髄培養物の評価 骨髄細胞の増殖および三次元培養物の細胞含量を分画計
測、ＣＦＵ−ＣおよびＢＦＵ−Ｅ分析、および以下に記
載するサイトフルオログラフィー分析により組織学的に
アッセイした。 10.4.1．組織学的評価 電子顕微鏡による検査には、培養物を間質細胞の第１回
の接種および造血細胞の第２回の接種に続いて種々の間
隔で殺した。簡単にいうと、ナイロンスクリーンを約４
個の等しい部分に切り、３％グルタルアルデヒドリン酸
塩緩衝液中で固定し、洗浄し、アセトン中で脱水しそし
てDenton Critical Point Dryer中に置いた。いくつか
の場合には、間質層を物理的に破壊させて下部に存在す
る細胞の増殖を可視化した（Naughtonら、1987，J. Me
d. 18:219-250）。標本を６０％金および４０％白金で
被覆しそしてＡｍｒａｙ ＳＥＭで検査した。
【０１１９】三次元ＬＴＢＭＣにおけるヒトおよびマカ
ークザル細胞の増殖パターンはラット骨髄についてのそ
れと同様であった。要約すると、間質細胞（骨髄由来又
は胎児ヒト繊維芽細胞のいずれかは線状に増殖しそして
メッシュの開口部にまたがり始める前に各ナイロン繊維
を包囲した（図１）。第２の接種の造血（および間質）
細胞は３．６ｃｍ2 メッシュ開口部の少なくとも７０％
に存在する間質細胞プロセスにより形成される自然の間
隙中に接種する（図２）。造血細胞はナイロンには直接
に結合しないで、むしろ支持細胞が付着した領域に結合
すると思われた。造血細胞の第２回接種の後３〜６日で
全ての培養物においてコロニー形成が明白であった。２
１０μｍの篩により赤血球性、骨髄性およびその他のコ
ロニーの発現にとって十分な領域が提供された（図
２）。造血はナイロンスクリーンＬＴＢＭＣの外側表面
上で観察されたが、生成中の支持細胞の間隙において最
も広範であった。 10.4.2．三次元ＬＴＢＭＣの使用済培地の全細胞計測及
びサイトスピン（cytospin）分析 全細胞計測およびサイトスピン調製物は培養物が提供さ
れた場合に（５日毎に）取り出された使用済みの培地を
用いてなされた。細胞計測は球計計数法を用いて実施さ
れた。サイトスピンはWright's-Giemsaを用いて染色さ
れそして分画計測はランダム視野で実施した。各供給後
に調製されたサイトスピンスライドの分析から、ヒトお
よびサルの培養物において赤血球性、骨髄性およびリン
パ球性系統の後期前駆体の存在が明らかになった（表I
I）。細胞型の相対的パーセントは変動するが、これら
は試験した各標本の培養期間中（ラットで３９週、霊長
類では１２．５週）存続した。ヒトの培養物の非付着ゾ
ーンに放出されたマクロファージ／単球／繊維芽細胞
は、骨髄細胞を主に犠牲にして、時間とともに増加した
（表II）。 ──────────────────────────────── 表II 非付着ゾーンの細胞含量* ヒ ト 培養時間 （週） 分画計測（％） ＭＹ Ｅ Ｌ ＭＡＣ／ＳＴＲ その他 0 63.9 19.0 10.8 3.6 2.7 1 59.0 14.0 8.6 14.9 3.5 2 48.5 14.4 9.9 23.7 3.9 3 51.9 9.2 9.6 24.7 4.6 4 41.2 10.4 6.1 33.9 8.4 5 41.9 12.7 10.3 29.0 6.1 6 45.2 11.2 8.0 27.2 8.4 7 39.8 10.1 6.3 34.8 9.0 8 38.6 9.8 6.5 37.1 8.0 9 40.3 5.6 6.6 38.4 9.1 10 35.9 5.5 6.8 40.6 11.2 11 31.3 6.7 5.4 43.2 13.4 12 30.1 5.0 4.1 44.6 16.2 マカークザル ─────────────────────────────── 培養時間 （週） 分画計測（％） ＭＹ Ｅ Ｌ ＭＡＣ／ＳＴＲ その他 0 64.8 14.2 10.1 8.2 2.7 1 60.2 16.0 6.8 12.9 4.1 2 57.4 14.9 7.5 16.4 3.8 3 49.7 12.4 10.0 23.5 4.4 4 49.7 9.9 7.9 26.2 6.3 5 43.0 10.7 6.1 32.0 8.2 6 39.2 8.0 6.0 36.7 10.1 7 ND ND ND ND ND 8 38.8 4.3 8.4 39.2 9.8 9 27.6 7.7 8.6 46.1 10.0 10 35.5 6.2 7.7 42.0 10.6 11 ND ND ND ND ND 12 35.4 6.0 6.9 39.2 12.5 ＊結果は３−５の培養物の平均を反映。各培養物は３．６ｃｍ2 のナイロンスク リーン１個を含有した。 ＭＹ＝骨髄性、Ｅ＝赤血球性、Ｌ＝リンパ球性、ＭＡＣ／ＳＴＲ＝マクロファー ジ、単球および繊維芽細胞、その他＝巨大核細胞、未確認芽細胞。 ND＝測定せず 10.4.3．三次元ＬＴＢＭＣの付着ゾーンの全細胞計測お
よびサイトスピン分析 付着ゾーンの細胞計測はコラゲナーゼおよびトリプシン
の１：１混合物（10μｇ／ｍｌ）でスクリーンを処理し
そして穏やかな超音波処理によりＬＴＢＭＣの種々の間
隔で実施した。ヒトおよびシノモルグス マカークＬＴ
ＯＭＣの付着ゾーンにおけるかかる分析により、造血細
胞に対する間質細胞の相対的パーセントが培養物中に時
間とともに増加することが明らかになった（表III）。
特に、造血細胞コロニー形成が進行するにつれて、間質
要素の相対的パーセントが低下した。しかしながら、Ｌ
ＴＢＭＣの後期における間質細胞の増殖は造血を犠牲に
して起こる。 ──────────────────────────────── 表III 付着ゾーンでの細胞含量* ヒ ト 培養時間 （週） 分画計測（％） 間質 Ｅ ＭＹ その他 1 66.4 6.2 20.4 7.0 2 60.0 5.4 26.4 8.2 3 54.2 6.6 29.2 10.0 4 62.6 6.8 24.5 6.1 5 65.1 2.7 25.2 7.0 6 65.4 6.1 21.6 6.9 7 59.7 7.7 25.4 7.2 8 64.3 5.1 24.0 6.6 9 72.9 2.7 18.4 6.0 10 73.2 3.7 17.7 5.4 11 71.3 3.0 19.6 6.1 12 74.7 2.9 17.4 5.0 マカークザル 培養時間 （週） 分画計測（％） 間質 Ｅ ＭＹ その他 1 53.1 8.0 35.7 3.2 2 66.0 8.3 19.2 6.5 3 68.6 7.4 18.1 5.9 4 57.0 5.1 29.2 8.7 5 56.6 5.8 27.5 10.1 6 63.1 3.9 24.0 9.0 7 ND ND ND ND 8 68.1 4.8 20.2 6.9 9 59.3 4.0 27.3 9.4 10 70.0 4.4 17.3 8.3 11 ND ND ND ND 12 65.3 4.2 21.9 8.6 付着ゾーンの細胞は酵素処理により非凝集化した。間質
には、繊維芽細胞、マクロファージ、含脂肪細胞様細
胞、内皮が包含される；Ｅ＝赤血球性、ＭＹ＝骨髄性；
その他＝リンパ球性、血栓性、未確認芽細胞。 ND＝未測定。 細胞増殖は数週間の培養後定常状態に達した；ＬＴＢＭ
Ｃを週毎に検査すると、付着および非付着ゾーンにおい
て同様の数の細胞が見い出された（図３）。培養後、最
初の１〜２週の非付着ゾーンにおける細胞数は、幾分間
違っていた。我々の実験において、培養初期の段階で培
地中に出現する細胞の多くは、マトリックスに以前はゆ
るやかに結合していた。これらは容易に脱着して、非付
着ゾーンに人口的に高い細胞数を生じる。同様に、相対
的に低い接種効率のゆえに、たとえ、接着容量が５×１
０6 細胞であっても５×１０5 から１０6 のみの細胞し
か当初はメッシュに付着しない。これは、培養の第１週
の間のメッシュ上で生ずる細胞増殖の２〜３倍を「隠し
ている」。10.4.4．三次元ＬＴＢＭＣの付着ゾーンのＣ
ＦＵ−ＣおよびＢＦＵ−Ｅ含量ラットＬＴＢＭＣの付着
ゾーンのＣＦＵ−Ｃ含量はＢｒａｄｌｅｙおよびＭｅｔ
ｃｌａｆの方法（1966，Austr. J. Exptl. Biol. Med.
Sci. 44:287-300）の改変を用いて測定した。簡単に言
うと、３７℃、７−７．５％ ＣＯ2 で４×１０4 細胞
を塗布しインキュベーションした。ヤマゴボウ マイト
ジェンラット脾臓細胞馴化培地をラットＣＦＵ−Ｃのた
めのコロニー刺激活性（ＣＳＡ）源として使用し、ＣＦ
Ｕ−Ｃは培養１４日後に計測した。ヒトのＣＦＵ−Ｃ
は、２０％ＦＢＳと補添したイスコープ改良ダルベッコ
培地中に１０5 個の核形成細胞／ｍｌずつ入れ、そして
０．５％寒天中の１０6 ＰＢＬ層上に塗布することによ
り測定した（Griffinら、1981, J. Clin. Invest. 68:9
32）。塗布後（３７℃、７％ ＣＯ2 ）、７日および１
４日目にコロニーを数えた。ヒトＢＦＵ−Ｅは、３０％
ＦＢＳ、１％ウシ血清アルブミン、１０-4Ｍ メルカ
プトエタノール、２．５〜５Ｉ．Ｕ．／ｍｌの部分精製
ヒト尿エリスロポエチン（Naughtonら、1985，J. Surg.
Oncol. 30:184-197）および４．５％フィトヘマグルチ
ニン−刺激ヒト白血球馴化培地（Cashmanら、1983, Blo
od, 61:876-884）を含有するイスコープ培地中の０．８
％メチルセルロース中で、ＬＴＢＭＣの種々の間隔後ア
ッセイした。
【０１２０】初期接種物中に存在するものに比較してか
なりの数のＣＦＵ−ＣがラットおよびヒトＬＴＢＭＣの
付着ゾーンから回収された（図４）。予備的な知見で
は、ヒトのＬＴＢＭＣにもＢＦＵ−Ｅが存続することが
示される（表IV）。 表IV ＬＴＢＭＣの種々の間隔における付着ゾーン中のＢＦＵ−Ｅ 培養時間 （週） ＢＦＵ−Ｅの数* 非培養骨髄 １９±６ ２ １４±４ ４ １２±５ ７ ８±３ ９ １１±６ １０ ８±３ ＊ １０5 個細胞当たりのコロニー：３〜４プレートの平均±ＳＥＭ 10.4.5．三次元ＬＴＢＭＣの付着ゾーンの細胞含量のサ
イトフルオログラフィー分析 ＥＰＩＣＳシステム（Coulter Electronics, Hialeah,
Fla）を使用して、ヒトおよびサルＬＴＢＭＣの付着ゾ
ーンの細胞含量のサイトフルオログラフィー分析を実施
した。造血細胞の接種後コラゲナーゼおよびトリプシン
を使用し、続いて十分に洗浄することにより種々の間隔
で細胞をナイロンスクリーンから分離した。次いで、Ｃ
ａ++又はＭｇ++を含有するハンクス平衡塩類溶液中にて
細胞を４５〜６０分間インキュベートした。これらはフ
ルオレセインイソチオシアネート（FITC）に接合した以
下のモノクローナル抗体：Ｍｏ−１，Ｔ−３，Ｂ−１，
Ｐｌｔ−１，およびＭＹ−９と反応させた（Coulter Im
munology, Fla）。マウスＩｇＭ−ＦＩＴＣ−処理細胞
を対照として使用した。選別ウィンドー（sortingwindo
ws）はケイ光と光散乱ヒストグラムに基づき選択した。
０．２５５ウィンドーが適切にゲート制御され、細胞の
プロフィールが測定された。
【０１２１】２．７および１０．５週でヒト培養物の付
着ゾーンをサイトフルオログラフィー分析することによ
り初期（ＭＹ−９）および後期（Ｍｏ−１）骨髄様細
胞、Ｂ（Ｂ−１）およびＴ（Ｔ−３）リンパ球、巨大核
細胞／血小板（Ｐｌｔ−１）、および単球／マクロファ
ージ（Ｍｏ−１）の存在が確認された（表Ｖ）。 表Ｖ モノクローナル抗体と非培養骨髄および三次元ＬＴＢＭＣ からの細胞との平均パーセント反応性a ヒトb MAb ２週LTBMC ７週LTBMC 10.5週LTBMC 非培養 B-1 10.20±1.43 6.76±0.98 22.73±1.37 11.96±1.13 T-3 18.64±1.88 11.18±1.86 13.01±1.84 9.90±0.64 Plt-1 4.40±1.33 8.08±0.92 17.05±4.10 8.72±1.83 Mo-1 10.10±1.04 17.26±2.29 20.98±1.14 3.46±0.25 My-9 3.98±0.26 3.70±0.68 3.46±0.25 1.46±0.54 マカークザルc MAb ７週LTBMC 非培養 B-1 31.01 8.37±0.99 T-3 18.13 11.56±2.1 Plt-1 46.50 8.53±1.09 Mo-1 40.87 26.64±2.25 My-9 21.64 5.49±0.83 ａ 平均パーセント反応性は、マウス−ＩｇＭ−ＦＩＴ
Ｃ対照による非特異的標識化を引き算することにより計
算された。
【０１２２】Ｍａｂ＝モノクローナル抗体。 ｂ 結果は、４〜５培養物からのデータを反映している
（±１ ＳＥ）。
【０１２３】記載した時間は組織特異的細胞の接種以降
のものである。 ｃ ヒト胎児繊維芽細胞上に接種された２個の培養物の
平均。ヒトおよびサルのＬＴＢＭＣはヒト胎児繊維芽細
胞層上には確立できたが、このマトリックスはラットＬ
ＴＢＭＣの増殖は支持しないだろう。胎児繊維芽細胞は
亜集密の段階に到達し、これはその後の骨髄細胞の接種
を骨髄間質よりずっと速やかに行えるものとなすであろ
う。マカークザルの骨髄を胎児繊維芽細胞の床上で増殖
させると、付着ゾーンの表現型プロフィールは、我々の
検討した他の培養物よりも多くの細胞がＰｌｔ−１抗体
と反応するが、他の血液学的系統も表わされることを示
している（表Ｖ）。この所見がどの程度抗体の交差反応
性を反映しているか、又は胎児細胞により媒介される付
着ゾーンの細胞集団のシフトを反映しているかはわから
ない。10.4.6．三次元培養物における細胞増殖に及ぼす
集密的な間質細胞単層の効果Long-Evansラット又はシノ
モルグス マカークからの大腿骨髄細胞を、Ｂｏｓｗｅ
ｌｌおよびその共同研究者により記載されたようにして
充填Ｆｅｎｗａｌウールカラムを通して注いだ（Boswel
lら、1987, Exptl. Hematol. 15:46-53）。簡単に述べ
ると、１０7 〜１０8 個の大腿骨髄細胞を４ｍｌの培地
中に入れ、培地中３７℃で４５分間予備インキュベート
したナイロンウールカラムに注いだ。さらに４５分間イ
ンキュベーションした後、非付着細胞を排出させ、付着
細胞は十分な洗浄およびEDTA-Versene溶液（１：5000食
塩水中、GLBCO, Grand Island,NY）での溶出によりとり
出した。約１０7 個の細胞を並行して２５ｃｍ2 フラス
コ中に接種し、５０％および１００％集密となるまで増
殖させた。第２の接種後の時間に関して標準化された予
め確立されたナイロンスクリーンＬＴＢＭＣを各フラス
コ中に挿入した。ナイロンスクリーンＬＴＢＭＣ上で増
殖させ、単層を顕微鏡的に観察した。細胞の計測と非付
着ゾーンのサイトスピンを５日毎に実施した。酵素解離
された付着細胞のサイトスピン調製物の分画計測は、ナ
イロンスクリーンＬＴＢＭＣの挿入５日後に実施され
た。
【０１２４】集密間質細胞単層をナイロンスクリーンＬ
ＴＢＭＣとともに培養すると、付着間質のない（ｐは
０．０５以下）又は約５０％集密で間質細胞（ｐは０．
０５以下）を有するフラスコ内で懸濁されたＬＴＢＭＣ
に比較して、懸濁培養物上における造血および間質細胞
の両方の増殖が抑制された（表VI）。加えて、集密間質
単層との共培養により、メッシュ関連間質細胞の脱着お
よび非付着ゾーンへの放出が引き起こされる。造血コロ
ニーは癒着して増殖を止める。ＬＴＢＭＣを新しいフラ
スコに移すと、３〜５日で造血の回復がみられる。 表VI ラットの懸濁ナイロンスクリーンＬＴＢＭＣ中での細胞増殖 に及ぼす約５０％および１００％集密での間質単層の効果 細胞増殖に対する単層効果a 曝露時間 細 胞 （日）b ５０％集密 １００％集密 間質細胞c 7 0±2.5 −13.5±4.7 15 ＋3.3±2.0 −18.0±5.1 28 ＋1.7±0.9 −24.3±4.0 造血細胞d 7 −1.0±4.1 −17.3±3.2 15 ＋6.3±3.4 −30.8±7.7 28 ＋2.7±1.9 −49.9±10.2 ａ 結果は、フラスコ底部に付着細胞の存在しない状態
で増殖したＬＴＢＭＣに比較したときの平均パーセント
差異（＋／−）±１ ＳＥＭとして表わされる。
【０１２５】ナイロンスクリーン骨髄培養物は第２の接
種（造血細胞の）の後２週間目に検査した。 ｂ 約５０％又は１００％集密のいずれかにおける付着
細胞含有フラスコ中へのナイロンスクリーンＬＴＢＭＣ
導入後の時間。 ｃ 繊維芽細胞、マクロファージ、含脂肪様細胞、内皮
を含む。 ｄ 芽細胞およびすべての系統の後期前駆体を含む。 11．実施例：三次元皮膚培養系 以下のサブセクションはインビトロで皮膚を培養するた
めの本発明の三次元培養系を記載する。簡単に言うと、
繊維芽細胞の培養物を予め滅菌されたナイロンメッシュ
上に確立した。接種して６〜９日で、付着繊維芽細胞は
増殖開始して網様開口となり、平行的なコラーゲンの束
を沈着させた。モノクローナル抗体を使用した間接的免
疫蛍光では幾分かのIII型もあるが主にＩ型のコラーゲ
ンが示された。７日後に、ヒトのメラニン細胞と表皮ケ
ラチン細胞の共培養物を繊維芽細胞の網上に置いた。付
着層の亜集密的な繊維芽細胞により栄養因子が生成され
るゆえ、ＴＡＰおよびコレラトキシンは添加しなかっ
た。電子顕微鏡検査によれば正常な形態学的特徴および
細胞−細胞付着を有する皮膚細胞が示された。 11.1．三次元間質の確立 皮膚の繊維芽細胞は、皮膚組織を細断し、２時間トリプ
シン処理を行ない、物理的手段により懸濁物中に細胞を
分離することにより単離した。繊維芽細胞は２５ｃｍ2
のファルコン組織培養皿中で集密になる迄増殖させ、１
０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、フンギゾーン、ゲッタ
マイシンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補添
したＲＰＭＩ１６４０（Sigma, MO）を供給した。繊維
芽細胞を緩和なトリプシン処理により持上げ、そして細
胞を直径約９０μｍで、２１０μｍのメッシュ開口部を
有するスクウェァ織りに組み立てられた繊維から成るナ
イロン濾過メッシュ上に置いた（Tetko, Inc., NY）。
メッシュは緩和な酸洗浄により前処理しそしてポリリジ
ンおよびＦＢＳ中でインキュベートした。繊維芽細胞の
付着は３時間以内にみられ、繊維芽細胞は最初の接種後
５〜７日以内にメッシュの開口部を横断して伸び始め
た。これらの繊維芽細胞は代謝的に活性であり、細胞外
マトリックスを分泌しそして活性な繊維芽細胞とコラー
ゲンから成る皮膚均等物を迅速に形成した。図１は繊維
芽細胞の付着およびメッシュ開口部を横断する細胞過程
の伸展を示す走査電子顕微鏡写真である。 11.2．メラニン細胞と表皮ケラチン細胞の接種 メラニン細胞は（EisingerおよびMarko）（1982, Proc.
Natl. Acad. USA 79:2018-2022）の方法にしたがって
単離した。要約すれば、皮膚試料をトリプシン中４〜６
時間インキュベートし、表皮および皮膚層を分離させ
た。表皮細胞を培地中に懸濁させ２５ｃｍ2 のＦａｌｃ
ｏｎ組織培養フラスコ中に入れた。メラニン細胞は選択
的付着特性により表皮ケラチン細胞から分離された。単
離されたメラニン細胞は繊維芽細胞で被覆されたナイロ
ンメッシュ上に置き、３日間増殖させたのち表皮ケラチ
ン細胞を添加した。メラニン細胞はこの系中では樹状突
起の形成を示し、染色されたままでありそして色素を表
皮ケラチン細胞に移す能力を保持しているという点で正
常に増殖した。図６は三次元培養系において３日後にメ
ラニン細胞が出現することを示している。単離された表
皮ケラチン細胞を３〜４日後にメラニン細胞上に塗布し
た。この「組織」は急速に増殖し、ＲＰＭＩ１６４０、
１０％ ＦＢＳおよび適当な抗生物質中で維持された。
天然の増殖因子が皮膚要素から分泌されるから、外因性
ファクター（例えばＴＰＡ、コレラトキシン等、Senge,
Biochemistry and Physiology of Skin、第１巻、p102
〜131，Oxford Univ. Press, NY,およびEisingerら、19
88, Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:1937-1941）の添加
は必要でない。 11.3．皮膚培養物の組織学的分析 皮膚培養物を次の手順により、光学顕微鏡により組織学
的に評価した：すべての組織を２．５％緩衝グルタルア
ルデヒド中で固定し、エタノール中で脱水しキシレン中
で清浄にしたのちパラフィンで包理した。切片は６〜８
μｍの厚さに切断され、ヘマトキシリン−エオシンで染
色し、正常な形態学的特性であるか、変わっているかに
ついて検査した。
【０１２６】この皮膚モデルの横断面が図７および８の
写真が示されている。正常な細胞の方向性および形態が
明らかである。表皮および皮膚成分は完全にメッシュ繊
維を包囲しそして明白な皮膚−表皮の接合がみられる
（図７）。表皮ケラチン細胞は正常な形態を示し、色素
顆粒を含有し、角質層の形成の証拠を伴った細胞の成熟
がみられる（図８）。 11.4．インビボでの三次元皮膚培養物の移植 ラットでの我々の移植研究では、この三次元系が拒絶反
応を伴うことなく、皮膚および表皮成分の速やかな合体
を可能とすることが示されている。
【０１２７】皮膚移植研究には２４匹のラットを使用し
た。メッシュを６ｍｍの環状片に切断し、オートクレー
ブ処理し、緩和な酸で処理し、コラーゲンIV型とインキ
ュベートし、ウシ胎児血清とインキュベートし、そして
第２の表皮ケラチン細胞の接種を行うか又は行うことな
く間質細胞を接種した。皮膚および／又は表皮細胞成分
で被覆されたメッシュを創傷部位に縫合し、１２〜２４
時間毎に次のようにして綿密に検査した。すなわちラッ
トを軽くエーテル麻酔し、そしてその背部表面をそり、
ベタジン溶液で洗浄した。使い捨てＢａｋｅｒパンチ
バイオプシー針で４個の６ｍｍパンチをあけ、そして移
植したメッシュを適所に保持するためにサブクチクラ縫
合を用いた。
【０１２８】ラットは手術後１２時間迄詳細に検査し、
その後、２４時間毎に監視した。
【０１２９】メッシュの移植領域は何ら紅斑、腫脹、滲
出物又はもろさの徴候を示さなかった。メッシュを移植
７日、１４日および２１日後にとり出した。これらの移
植の結果を図９および１０に示す。すべての皮膚細胞は
移植７日後に示されている（図９）。図１０は、表皮ケ
ラチン細胞（ｋ）、繊維芽細胞（ｆ）、コラーゲン
（ｃ）、含脂肪細胞（ａ）、および平滑筋細胞（ｓ）を
示しており、すべてナイロンメッシュ繊維（ｍ）の周囲
に天然の配置で整列されている。メッシュへの細胞の強
い自然の付着に伴ったリンパ球および他の免疫成分が存
在しないことは、インビボにおいて何ら拒絶反応が生じ
ないことを示している。
【０１３０】皮膚および表皮成分を有するメッシュを１
０ｍｍ×１０ｍｍの皮膚バイオプシー中に移植し、次い
でこれを１４日間培養状態に維持しそして組織学的に検
査するという平行実験を実施した。これらインビトロ移
植においても同様の細胞移動、付着および分化パターン
が観察された。これ迄の移植研究は、我々の三次元マト
リックス系が全ての細胞成分が活性化され、天然の増殖
因子が生産されるという真の生理学的系であるという仮
説の実証を助けるものである。
【０１３１】本発明を特定の態様に言及して詳細に記述
するが、上述の記載および以下の請求の範囲に記載され
る本発明の範囲から逸脱することなく変更が可能である
ことは理解されよう。 12．実施例：三次元肝臓培養系 12.1．材料および方法 12.1.1．麻 酔 約３００ｇの体重の生体Long-Evansラットに、０．３ｍ
ｌの注射用ペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射
した。 12.1.2．切 開 十分な麻酔を確保するために、鋭利なピンセットで動物
をつまんだ。剣状突起と鼠蹊部領域の間で中心線切開を
行ない、次いでさらに切開して腹腔への導入を可能とす
るフラップを作った。腸および他の臓器を動物の右側に
押し込んで肝臓門静脈を露出させた。肝臓の門静脈を切
開によりさらに露出させ、カテーテルの置かれる場所か
ら遠位にある肝臓門静脈の周辺で４．０縫合系を結ん
だ。第２の縫合はカテーテルの置かれる場所に近位の肝
臓門静脈の周辺で行なった。２１ゲージの針で小さな切
目を肝臓門静脈に設けた。蠕動ポンプをオンにし、５０
０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（4.1ｇ ＮａＣｌ，０．２
５ｇ KCl.３ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨおよび１０ｍｌの
０．２４％Ｗ／Ｖ HEPES貯蔵液含有の注入を始めた；そ
の直後に、下大静脈を切断して緩衝液を逃がした。注入
が完了した後、ポンプを閉じ、肝臓を静かにブフナーロ
ートにとり出し、次いでコラゲナーゼ溶液（１００cc中
０．４ｇ ＮａＣｌ，０．０５ｇ KCP,１０ｍｌ HEPES
貯蔵液（上述）、０．０７ｇ ＣａＣｌ2 ２Ｈ2 Ｏ，
６．６ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨ，５０ｍｇ コラゲナー
ゼ、ｐＨを７．６にし、３７℃にした）で灌流した。灌
流を１５〜２０分間続けた。ブフナーロートの内容物を
濾過し、肝臓をとり出し、そして１．５％（Ｗ／Ｖ）Ｂ
ＳＡを含有するコラゲナーゼ溶液中に入れた。 12.1.3．細胞溶液の調製 灌流した肝臓の葉を分離し、その外側実質を切りとっ
た。次に内側実質を生理的Ｃａ++およびＭｇ++を含有す
るハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で細断した。大
きな肝組織片を沈降させ、細胞懸濁物をパーコール勾配
（５ｍｌのＤＭＥＭに０．５１μ/ｍｌのインスリン、
０．００７ｍｇ/ｍｌのグリカゴンおよび２０パーセン
トのウシ胎児血清を加えた）を通して遠心し５０ｍｌの
円錐形の遠沈管中に入れ、ＨＢＳＳプラス生理的Ｃａ++
およびＭｇ++を５０ｍｌマークまで添加し、８００ｇで
１０分間遠心することによりＨＢＳＳの頂部に５ｍｌの
パーコール作業溶液［７０％の貯蔵パーコールプラス３
０％ ＰＢＳ；貯蔵パーコールは９部のパーコールと１部の１
０倍濃縮ダルベッコ培地から成る］を積層させた。肝実
質細胞を勾配の底部から集め、亜集密間質含有三次元メ
ッシュ培養物に添加した。 12.1.4．三次元間質マトリックスの調製 ８ｍｍ×４５ｍｍ片のナイロン濾過スクリーン（＃3-21
0/36, Tetko., Inc.,NY）を０．１モル酢酸かなに３０
分間浸し、１０ｍＭポリリジン懸濁液で１時間処理し
た。メッシュを無菌ペトリ皿に入れ、ラットの肝臓から
ＤＭＥＭ完全培地中に収集した１×１０6 個の繊維芽細
胞を接種した。５％ＣＯ2 で１〜２時間インキュベーシ
ョン後、スクリーンをコーニング２５ｃｍ2 組織培養フ
ラスコ中に入れ、更に５ｍｌの培地を加えて浮遊させ、
３日間隔で供給することにより亜集密化に到達させた。 12.1.5．三次元肝臓組織培養物の維持 肝実質細胞を三次元間質マトリックスに接種した後、培
養物を加湿した雰囲気中３７℃、５％ＣＯ2 でＤＭＥＭ
完全培地中に維持し、三日毎に新鮮な培地を供給した。 12.2．結果および考察 このようにして培養された成体肝細胞は活発な有糸分裂
を示し、３週間にわたってタンパク質を分泌し続けた。
肝細胞は細胞の索に向けてそれ自体配向し（図１１）、
そして、三次元培養の最初の１０〜１２日間は肝芽細胞
または再生肝細胞に似ていた（図１２）。培養物が高度
に集密となると、実質細胞が胆管細胞、Ｋｕｐｆｔｅｒ
細胞および他の肝間質細胞が依然として存在している成
熟した成体肝細胞に似始めた。細胞は培養の最初の１０
〜１２日間、約１２時間毎に分裂し、３週間まで７２時
間毎に分裂を続けた。アルブミンの分泌は３週間の培養
期間に亘って続き、そして肝細胞はその活性化された酵
素を保持し、それによりインビトロで生成物を代謝する
ことができた。培養物が完全な集密に到達した後は、こ
れは１２週間迄生存能ある基質として維持できた。 13．実施例：三次元粘膜上皮組織培養系 13.1．材料および方法 13.1.1．粘膜上皮細胞の調製 口腔粘膜組織試料を歯科矯正外科標本より入手した。組
織は、抗生物質（ＭＥＭ １００ｍｌ当たり抗生抗真菌
溶液、ＧＩＢＣＯから入手、Cat. ＃600-5240AGを２ｍ
ｌ；GIBCO Cat. ＃600-5710ADからのゲンタマイシン溶
液０．０１ｍｌ）を含有する新鮮なＭＥＭで３回洗い、
小片に切断し、次いで、０．０２％ ＥＤＴＡ（Ｗ／
Ｖ）で洗った。Ｃａ++もＭｇ++も含有しないＰＢＳ中の
０．２５％トリプシンを添加した；２〜３秒後、組織片
をとり出し、（Ｃａ++もＭｇ++も含有しないＰＢＳ中
の）新鮮な０．２５％トリプシン中に入れ、４℃に一晩
冷蔵した。組織をとり出して新鮮なトリプシン溶液中に
入れ、細胞が単離細胞浮遊液を形成したようにみえるま
で穏やかに撹拌した。単離細胞浮遊液を１０％熱不活化
ウシ胎児血清を含有するＭＥＭ中に希釈し、１４００ｇ
で７分間遠心した。上清をデカンテーションし、粘膜上
皮細胞を含有するペレットを接種培地中に入れた。培地
は２％のｕｌｔｒｏｓｅｎ Ｇ，１×Ｌ−グルタミン、
１×非必須アミノ酸、ペニシリンおよびストレプトマイ
シンから構成された。細胞を次に三次元間質マトリック
ス（後述）上に接種した。 13.1.2．三次元間質マトリックスの調製 粘膜上皮培養物に使用される三次元間質マトリックスは
口腔の繊維芽細胞および８ｍｍ×４５ｍｍ片のナイロン
濾過スクリーン（＃3-210/36, Tetko Inc., NY）を用い
13.1.4セクションの三次元肝培養物において既述したよ
うにして生成された。 13.1.3．三次元粘膜上皮組織培養物の維持 粘膜上皮細胞を三次元間質マトリックス上に接種した
後、培養物を加湿した雰囲気中、３７℃、５％ＣＯ2 に
て、ＤＭＥＭ完全培地に維持し、３日毎に新鮮な培地を
供給した。 13.2．結果および考察 図１３は、上述の方法により生成された三次元粘膜上皮
組織培養物の横断面の顕微鏡写真である。組織培養物
は、インビボで口腔粘膜の層状になったうろこ状の上皮
を発生反復することが見い出された；細胞が培養物の表
面に接近すると、核は扁平になり、インビボで生じるよ
うな、表面に平行な平面に配向することに注目すべきで
ある。 14．実施例：三次元膵臓組織培養系 14.1．材料および方法 14.1.1．膵臓腺房細胞の調製 膵臓腺房細胞は、ＲｕｏｆｆおよびＨａｙ，（1979, Ce
ll Tissue Res, 204:243-252）およびＨａｙ（1979,“M
ethodo-logical Surveys in Biochemistry”第８巻、Ce
ll Populations”London, Elliss Hornwood, Ltd, 第14
3-160頁）に記載された方法を応用して調製された。組
織は成体雄Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラットから集め、細断
し、カルシウム不含、マグネシウム不含ＨＢＳＳ緩衝液
中で洗った。細断した組織を次に０．２５％リプシン
（ｒｙｐｓｉｎ）およびコラゲナーゼを含有する溶液中
でインキュベートした。解離した細胞は２０μｍのナイ
ロンメッシュを使用して濾過し、ＨＢＳＳ中に再懸濁し
そして３００ｇで１５分間遠心してペレットにした。生
成したペレットを少量のＤＭＥＭ完全培地中に再懸濁し
て三次元間質上に接種した（下記参照）。 14.1.2．三次元間質マトリックスの調製 膵臓組織培養物に使用された三次元間質マトリックスは
成体ラット膵臓繊維芽細胞およびセクション13.1.4にお
いて三次元肝臓培養物に関して上述したとおりの８ｍｍ
×４５ｍｍ片のナイロン濾過スクリーン（＃3-210/36,
Tetko, Inc., NY）を使用して調製した。 14.1.3．三次元膵臓組織培養物の維持 三次元間質マトリックス上に膵臓腺房細胞を接種した
後、培養物は加湿した雰囲気中、３７℃、５％ＣＯ2 に
てＤＭＥＭ完全培地中に維持し、３日毎に新鮮な培地を
供給した。 14.2．結果および考察 図１４は上述の方法により生成された三次元膵臓組織培
養物の横断面の顕微鏡写真である。組織培養腺房細胞
は、間質細胞のより均一な外観（星印）に比較して酵素
前駆体小滴封入体（矢印）に基づき固定できよう。小島
細胞は各メッシュ開口部の中心に濃縮されたままであ
り、そして１〜２×１０5 個のインシュリン−分泌細胞
を含有する構造物を形成する。 15．実施例：血液−脳関門のための三次元モデル系 15.1．材料および方法 15.1.1．小血管内皮細胞の調製 小血管の内皮細胞はＬａｒｓｏｎらの方法（1987, Micr
p-vasc. Res. 34:184）に従って脳から単離されそして
Ｔ−７５組織培養フラスコを使用してインビトロで培養
された。細胞はダルベッコ改良イーグル培地／Ｈａｍｓ
−Ｆ−１２培地組み合わせ物（溶液は１：１混合物とし
て入手しうる）中に維持された。培地は２０％熱不活化
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、グルタミンおよび抗生物質が
補添された。細胞はフラスコ当たり１×１０6 個の濃度
で接種し、１週間以内に集密状態に達した。細胞を１週
間に一度継代し、さらに１週間に一度前記ＦＣＳ、グル
タミンおよび抗生物質を含有するＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ−
Ｆ−１２を供給した。細胞を継代するために、５ｍｌの
ＰＢＳ（Ｃａ++又はＭｇ++なし）で２度すすぎそして３
ｍｌの０．０５％トリプシンおよび０．５３ｍＭ ＥＤ
ＴＡでトリプシン処理した。細胞をペレット化し、再懸
濁し、トリパンブルー排除による生存能力試験を行い、
接種しそして上述のＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ−Ｆ−１２補添
培地２５ｍｌを供給した。第VIII因子関連抗原アッセイ
（Grulnickら、1977，Ann. Int. Med.86:598-616）を積
極的に内皮細胞を同定するために使用しそして銀染色は
小血管内皮にのみ特異的な強固な結合複合体を同定する
のに使用した。 15.1.2．メッシュの調製および接種 ナイロン濾過スクリーンメッシュ（＃3-210/36, Tetko,
Inc., NY）は肝臓、膵臓、骨髄等の組織培養系におい
て実質的に記載したようにして調製した。メッシュを酢
酸溶液（１ｍｌの氷酢酸と９９ｍｌの蒸留水）中に３０
分間浸し、多量の蒸留水ですすぎ次にオートクレーブ処
理した。メッシュを８×８ｃｍメッシュ当たり６ｍｌの
ウシ胎児血清で被覆して１晩インキュベートした。次い
でメッシュを三層に積み重ね、この積み重ねの上に３×
１０7 個の小血管内皮細胞（上述のとおりにして培養）
を接種し、加湿雰囲気中３７℃、５％ＣＯ2 で３時間イ
ンキュベートした。接種したメッシュには、完全な集密
に達する迄３〜４日毎に１０ｍｌのＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ
−Ｆ−１２培地を供給した（約２週間）。 15.1.3．ニューロンおよび星状細胞集団の調製 ラット胎児小脳からニューロンおよび星状細胞を単離し
た。５匹のラットの小脳を切り出してＰＢＳ緩衝液中に
入れた。次いでＰＢＳを除き、それぞれに１ｍｌのトリ
プシン溶液（１０ｍｇトリプシン、１ｍｌのＰＢＳこれ
は０．０１ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ含有、および６μ
ｌの１Ｎ ＮａＯＨ）を添加した。３分後組織を約１ｍ
ｌのＰＢＳ緩衝液および、７．５ｍｇ ＤＮアーゼと、
１５ｍｌのＥａｒｌｅｓ ＢＭＥから成る２ｍｌの貯蔵
溶液を用いてすすいだ。次に個々の細胞を１８から２５
ゲージの範囲の漸進的に小さい注射針を通して溶液が混
濁する迄組織を吸引することにより懸濁液にとり込ん
だ。生成した単離細胞浮遊液を８００ｇで５分間遠心
し、そして細胞ペレットを培地中に再懸濁し、次いで３
３μｍフィルターに通した。細胞を６０％／３５％パー
コール段階的勾配上に積層させ、８００ｇで１０分間遠
心した。０％／３５％界面での細胞は大部分がグリアと
星状細胞であった；３５％／６０％の界面での細胞は大
部分がニューロンであった。両方の集団を集め、５ｍｌ
のＰＢＳ中に別個に希釈し、洗浄しそして、２５００ｇ
で５分間遠心することにより集めた。細胞を次に培地
（１０％熱不活化ウマ血清含有ＢＭＥ）に再懸濁した。
両方の細胞型は、ポリ−Ｄ−リジンを予め被覆した培養
皿上に別個に塗布した。最初に、これらを１００μｇの
ポリ−Ｄ−リジンで予め被覆した皿に塗布し、２０〜４
５分間インキュベートし、次いでＰＢＳで軽くすすい
だ；グリアと星状細胞が培養皿に選択的に付着したが、
ニューロンは洗い去られた。すすぎ緩衝液を次いで５０
０μｇのポリ−Ｄ−リジンを被覆した培養皿に塗布し、
この場合ニューロンが培養皿に付着した。 15.1.4．三次元内皮細胞培養物への星状細胞の接種 メッシュから培地を除去し、このメッシュに星状細胞を
加え、次いで加湿した雰囲気下３７℃、５％ＣＯ2 で１
時間インキュベートすることにより集密内皮細胞で被覆
されたメッシュ上（上記）に５×１０5 個の星状細胞を
接種した。このメッシュに、インターフェロン、トラン
スフェリン、セレンを含有するＤＭＥＭ−Ｋ１２を供給
し、引き続き２〜３日間隔で供給した。 15.1.5．三次元内皮細胞−星状細胞組織培養物へのニュ
ーロンの接種 約５日後に、ニューロンを内皮細胞−星状細胞組織培養
物上に接種した。神経突起の成長を示している（培養約
１週間後に観察された）ニューロン細胞培養物を収集
し、約５×１０5 個の細胞を内皮細胞／星状細胞三次元
培養メッシュ上に接種した。ニューロン細胞を最小量の
培養培地中に接種し、次いで３７℃、加湿した雰囲気中
５％ＣＯ2 にて３時間インキュベートし、その後、メッ
シュには標準量のＤＭＥＭ／Ｆ１２を供給し、再びイン
キュベートし、その後２〜３日間隔で供給した。 15.2．結果および考察 ナイロンメッシュはウシ胎児血清で予め被覆しこれに標
準的な単層培養にて集密となるまで増殖させた小血管内
皮細胞を接種しそして完全な集密となるまで増殖させ
た。
【０１３２】ニューロンと星状細胞は胎児ラットの小脳
から調製し分画付着により分離した。星状細胞は集密内
皮細胞三次元間質マトリックス上で増殖させ、次にニュ
ーロン細胞をこの三次元組織培養物に添加した。
【０１３３】生成する内皮細胞／星状細胞／ニューロン
三次元組織培養物を、それが内皮細胞の層を覆う半集密
の第二段階に達する迄維持した。図１５に示されるよう
に、この多層三次元組織培養系、ここでは１つの層は集
密の小血管内皮細胞から構成され、他層は星状細胞とニ
ューロンから構成されているが、これはインビボで見ら
れる血液−脳関門の構造を再生成し、そこでは血液中の
物質は脳のニューロン組織に到達するためには小血管の
内皮を貫通しなければならない。かかる血液−脳関門モ
デル系は化学的物質又はウイルスの脳への通過又はその
欠除を研究するのに使用できる；中枢神経系の感染を治
療するためには、例えば如何なる抗生物質又は抗ウイル
ス剤が血液−脳関門を通過しうるか判定することが有利
である。さらに、かかるモデル系は種々の神経毒の作用
および強さを研究するための基質として使用できる。 16．実施例：三次元腺癌組織培養系 16.1．材料および方法 16.1.1．腺癌間質細胞および実質細胞の調製 ＨＢＳＳ中に腫瘍細胞を細断することにより腺癌細胞を
間質細胞から分離し、細胞を０．２７％トリプシン中３
７℃で２４時間インキュベートし、さらにプラスチック
ペトリ皿上のＤＭＥＭ完全培地中に懸濁した細胞を３７
℃で１２時間インキュベートした。間質細胞は選択的に
プラスチック皿に付着した。 16.1.2．三次元間質マトリックスの調製 腺癌組織培養物中に使用される三次元間質マトリックス
は腫瘍由来の間質細胞（上記16.1.1参照）およびセクシ
ョン13.1.4で三次元肝臓培養物に関し前記した８ｍｍ×
４５ｍｍ片のナイロン濾過スクリーン（＃3-210/36, Te
tko., Inc., NY）を使用して生成させた。 16.1.3．三次元腺癌組織培養物の維持 三次元腫瘍間質マトリックスに腺癌細胞を接種した後、
培養物を高濃度グルコース、１５％ ＦＢＣおよび０．
０３％グルタミンを含有するＤＭＥＭ完全培地中加湿し
た雰囲気気圧中で３７℃、５％ＣＯ2 で維持し、３日毎
に新しい培地を供給した。 16.2．結果および考察 図１６は、三次元腺癌組織培養物の顕微鏡写真である。
腺癌細胞は特徴的な積み重ねおよび三次元腫瘍様構造物
への配向を示した。細胞はその上皮様外観を保持した。 17．実施例：三次元組織培養細胞毒試験系 17.1．材料および方法 17.1.1．三次元骨髄組織培養物の調製 三次元骨髄組織培養物は、上記セクション10で概説した
方法に従って調製された。 17.1.2．細胞毒剤への三次元骨髄培養物の露出 個々の三次元骨髄培養物を細胞毒性試験用の９６ウェル
組織培養皿の各ウェル内に維持した。
【０１３４】培養物を０．１から１０μｍの範囲の１０
倍連続希釈アドリアマイシンに２４時間露出させた。対
照は１０倍連続希釈のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に
露出させた。
【０１３５】同様に、９６ウェルマルチウェル組織培養
ユニット中の他の三次元骨髄培養物を７１〜７５μｍの
範囲の１０倍連続希釈のシス−プラチナムに２４時間露
出させた。対照はＢＳＡの連続希釈物に露出させた。
【０１３６】すべての場合において、慣用法を用いて培
養されたヒト繊維芽細胞の単層を、間質細胞単独の三次
元培養物又は造血細胞と一緒に培養した三次元培養物と
比較した。 17.1.3．細胞毒性アッセイ 培地を細胞から除去し、０．２ｍｌの中性赤色色素培地
溶液（下記18.1.4参照）を各ウェルに加えた。培養物を
３７℃で３時間インキュベートした。三次元培養物を含
有する培養トレイにおいて、ウェル１Ａを対照として用
い、このものは細胞なしのメッシュのみを含有した。
【０１３７】インキュベーション後、色素／培地を除去
し、とり込まれなかったニュートラルレッドを除去し、
細胞の基層への付着を高めるためにホルマール（ｆｏｒ
ｍａｌ）−カルシウム（下記18.1.4参照）を用いてすみ
やかに各ウェルを洗った。
【０１３８】０．２ｍｌの酢酸／エタノール溶液（18.
1.4参照）を各ウェルに加え、培養物を室温で１５分間
保持し（色素を抽出するため）、次いで振盪プレート上
に２〜３秒振盪した。
【０１３９】培養トレイを次に５４０nmフィルターを備
えたＤｙｎａｔｅｃｈマイクロプレートリーダーに移し
て自動分光測光読みとりおよび記録を行った。対照ウェ
ル中の酢酸／エタノール溶液をブランクとして用いた。 17.1.4．細胞毒性アッセイのための溶液 ニュートラルレッド／培地を以下のようして調製した。
ニュートラルレッドは０．４％の貯蔵水溶液として調製
しそしてホイルにより光から遮断した。色素の新鮮な
１：８０希釈物を調製した。使用直前に、色素培地溶液
を１５００ｇで５分間遠心しそして上清液をニュートラ
ルレッドアッセイに使用した。
【０１４０】ホルマール−カルシウムは以下のようにし
て調製した。５ｇのＣａＣｌ2 （無水）を４９７．５ｍ
ｌの滅菌蒸留水に加えた。次に、２．５ｍｌの４０％ホ
ルムアルデヒドを加えて、１％ ＣａＣｌ2 そして０．
５％ホルマリンであるホルマール−カルシウム溶液を生
成させた。
【０１４１】酢酸エタノール溶液は次のようにして調製
した。１．０９ｍｌの氷酢酸を９９ｍｌの５０％エタノ
ールに加えた。
【０１４２】アドリアマイシンおよびシス−プラチナム
は（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）から入手し
た。 17.2．結果および考察 図１７および図１８は、試験薬剤としてそれぞれアドリ
アマイシンおよびシス−プラチナムを用いる三次元骨髄
培養物細胞毒性アッセイの結果を示す。それぞれの場合
に、三次元培養系は試験薬剤に対して用量関連応答を示
すことに注目されたい。アドリアマイシン又はシス−プ
ラチナムのいずれか一方では、骨髄三次元培養物に対す
るＴＤ50は通常の繊維芽細胞単層培養物を使用して測定
されたＴＤ50とは有意に相違していた。重要なことは、
これらの結果は、単層培養物は細胞毒性に関する正確な
測定とはなりえない可能性があることを示していること
である；恐らく細胞が極めて不自然な環境下で増殖する
ので、単層細胞培養物は有毒薬剤に対してより感受性が
強いのかもしれない。試験物質の正確な毒性を測定しう
ることは非常に重要である；例えば、化学療法におい
て、悪性細胞を効果的に排除するのに許容しうる最大量
を投与することが重要でありうる。許容しうる最大量を
過少に見積もることは、有効量より少ない抗腫瘍剤の投
与を生ずる可能性がある。骨髄および他の正常な組織の
三次元組織培養物のみならず腫瘍組織の三次元組織培養
物も提供することにより、本発明により化学療法剤の最
適量のインビトロにおける測定が可能となる。 18．実施例：ミクロピッグ（ｍｉｃｒｏｐｉｇ）におけ
る新生真皮（ｎｅｏｄｅｒｎｉｓ）を使用する移植のた
めの三次元皮膚培養系 皮膚移植は４匹のCharles Riverミクロピッグで実施し
た。実験は、厚さを分けた創傷および完全な厚さの創傷
の収縮、治癒および上皮形成に及ぼす新生真皮、細胞溶
解物を浸透されたメッシュ基質およびメッシュ単独物の
効果を比較することを目的とした。各領域における治癒
の正確な評価を可能とするために、複数の平行した創傷
を各動物の背中表面に沿って比較した。これらの実験に
おいて、生物分解性メッシュにブタの皮膚繊維芽細胞を
接種し、そして皮膚代替物として移植した。他のメッシ
ュはブタの表皮ケラチン細胞を接種したヒト皮膚繊維芽
細胞およびブタ皮膚繊維芽細胞を含有した。移植された
領域を組織学的切片および外観の著しい変化（滲出物、
紅斑等）を通して監視することにより我々は移植様式と
しての三次元皮膚系の有効性を調べることができた。 18.1．材料および方法 18.1.1．創傷床の調製 表皮移植片を適正に評価するためには、何ら真皮、毛
包、汗腺又は皮脂腺が残らない創傷移植片床を調製する
ことが必須要件であった。これを達成するため、０．０
７５から０．０９０インチに設定されたＢｒｏｗｎｅ皮
膚切除器を使用してブタ上方側面部から全厚さの皮膚を
切り取った。５ｃｍ×５ｃｍの創傷部が生成された。下
方側面領域を設ける際には、セッティングは０．６０か
ら０．０７５インチに調節された。メッシュ単独又は培
養細胞を有するメッシュを筋膜のすぐ上の床上に置い
た。無菌の皮膚切除器で調製された床により雑菌混入の
可能性が低下しそして移植床における完全な止血が可能
となった。
【０１４３】もし、小出血が皮膚除去後に生じる場合は
乾燥ガーゼ包帯を創傷部にあてて１０から１５分間圧力
を加えた。移植片を筋膜の上に置く迄は常に、ＰＢＳで
予め湿らせた滅菌ガーゼで無菌床を覆った。適所に圧迫
ステントを保持するために、調製された移植床の両側か
ら約１．５インチ離れて、絹縫合材（３−０）を置い
た。
【０１４４】無菌ピンセットを用い組織培養フラスコか
ら培養した移植片（細胞を有するメッシュ）を取り出
し、慣用の表皮下縫合を用いて所定の場所に縫合した。
移植片をワセリンガーゼでおおい、絹結紮糸を圧迫ステ
ントを与えるように結んだ。ブタをエラストプラストで
包帯した。傷の包帯は４日で取り変えた。 18.1.2．麻 酔 ブタをケタミン塩酸（ｋｅｔａｌａｒ）を使用して麻酔
しそしてハロタン、亜酸化窒素および酸素の混合物によ
り麻酔状態に保持した。皮膚面をポビドン−ヨウ素（Ｂ
ｅｔａｄｉｎｅ）および７％アルコールで洗い次にブタ
の側面に上述のようにして４個の完全厚さ移植床を調製
した。 18.1.3．動物の維持 ４から５日後、創傷包帯を除去し、移植領域を感染およ
び／又は拒絶反応の徴候に関して検査し、それから、再
度ワセリンガーゼでおおい、エラストプラストで包帯し
た。創傷は引き続き処置部位からバイオプシーをとって
４日間隔で観察した。使い捨てＢａｋｅｒパンチと無菌
手法を用いて４ミリのバイオプシーを無菌で採れるよう
に、動物をケタラールで麻酔した。試料は移植片の付着
と創傷治癒を評価するための組織学的評価に送った。 18.1.4．上皮移植片 選択された動物に真皮均等物を移植して１０日後に、自
己由来の表皮ケラチン細胞の半移植片を与えた。集密以
上まで増殖した単離された細胞から生成した表皮ケラチ
ン細胞シートは皮膚均等物上への移植に先立ち１０から
１４日間培養した。シートを４個の局部的な縫合により
結合しそして細胞を付着できるようにワセリンガーゼと
包帯で覆った。 18.2．結 果 処置された全動物において、皮膚均等物は良好に付着
し、収縮と脱水が防止されそして上皮細胞がその上で移
動可能であるか又は自己由来移植片に載置しうる生きた
組織床を提供した。図１９は、ヒト真皮均等物（新生真
皮）を全厚さの創傷部に移植１０日後の治癒の代表例で
ある。我々はその部位において最小の収縮を観察し、何
らの拒絶反応の徴候も観察しなかったが、これは移植に
おける同種繊維芽細胞の有用性を示している。この部位
の組織学的評価では、繊維芽細胞の活発な増殖と、最小
の白色細胞の浸潤があるコラーゲンの沈着が示される
（図２０）。厚さを分けた創傷は、真皮均等物で処置し
た傷（左側）および生物分解性メッシュのみで処置した
傷（右側）と比較すると、収縮、上皮形成、色素沈着お
よび毛の成長における著明な差違を示した（図２１）。
繊維芽細胞の溶解物に浸漬したメッシュは、メッシュ繊
維の周辺での上記増殖の増強を示した（図２２）が、全
体的には生きた新生真皮で処置した領域よりも治癒進行
が遅いことを示した。
【０１４５】新生真皮は治癒領域への上皮の移動を高め
た。図２３に見られるように、表皮ケラチン細胞が生き
た真皮均等物の方向に移動してそれに付着するに伴い深
い網条杭（rete pegs）が表皮ケラチン細胞により形成
される。このパターンは治癒部位における上皮形成の特
徴である。
【０１４６】自己由来表皮ケラチン細胞は良好に付着
し、そして新生真皮への均一な治癒を有していた。図２
４は創傷の治癒の比較−その傷の半分は自己由来上皮移
植片を受けたものでありそして傷の半分は新生真皮のみ
をうけたもの−を示す。上皮の移植片は均一に治癒し、
それ以上の収縮を防止し、載置されている真皮均等物に
強固に付着した。図２５は新生真皮への表皮細胞の均一
な増殖と付着を示す。新生真皮は活発に増殖中の繊維芽
細胞および自然に分泌された繊維芽細胞から構成されて
いると思われる。メッシュ繊維は横断面にみられるよう
に依然として存在している。 18.3．考 察 これまでの移植実験では、新生真皮（生物分解性メッシ
ュ上の繊維芽細胞および自然に分泌されたコラーゲン）
は全厚さの創傷に対してすぐれた治療を提供することが
示される。異種間の移植片の成功裏の使用は、やけどの
犠牲者および床ずれの潰瘍を有する患者における同種間
の新生真皮の使用可能性を示している。この移植は、自
家移植の上皮シートを支持し、増殖させるのみならず、
上皮細胞の移植表面への移動を可能とする。移植片は、
４ヶ月後にも表面上或いは深部での傷あとがなく、永久
的である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は繊維芽細胞の三次元マトリックスへの
付着、およびメッシュの開口部を横切る細胞突起の伸長
を示す走査電子顕微鏡写真である。繊維芽細胞は活発に
マトリックスタンパク質を分泌中で、組織特異的細胞の
接種前に到達すべき亜集密の適当な段階にある。
【図２】 図２は赤血球性、骨髄性および他のコロニー
の発現のための２１０μｍ領域を示す三次元 LTBMC の
走査電子顕微鏡写真である。支持細胞は三次元マトリッ
クスに沿って線状に増殖し、これを被覆している。
【図３】 図３は数週間以上にわたる培養に於ける三次
元 LTBMC の付着および非付着層の全細胞数を表すグラ
フである。非付着ゾーンの全細胞数およびサイトスピン
の調製は５日毎に培養物に供給する時に除去した使用済
み培地を用いて行った。付着ゾーンの細胞数の計数は L
TBMC の様々な間隔で、三次元細胞培養物をコラゲナー
ゼおよびトリプシンで処理して付着細胞を除去すること
によって行われた。細胞増殖は培養数週間後に定常状態
に達した。
【図４】 図４は培養数週間以上にわたる三次元 LTBMC
の着ゾーンから得られた、105 細胞当たりの CFU-C を
表すグラフである。
【図５】 図５は、三次元皮膚モデルを表す概略図であ
る。真皮／表皮接合部分が存在し、その上に着色したメ
ラニン細胞および数層の色素含有表皮ケラチン細胞が存
在する。間質細胞はマトリックスに付着しそして真皮成
分を構成する。
【図６】 図６は、メラニン細胞接種３日後の三次元間
質の走査電子顕微鏡写真である。メラニン細胞は樹状突
起形成を示し、着色されたままでありそして色素を表皮
ケラチン細胞に移す能力を保持するという点で三次元系
で正常に増殖する。
【図７】 図７は、ヘマトキシリン−エオシン染色を行
った三次元皮膚培養物の横断面の顕微鏡写真である。正
常な表皮（Ｅ）細胞の形態および方向が明白である。表
皮および真皮（Ｄ）成分が完全にメッシュ繊維（Ｍ）を
取り囲み、明確な真皮／表皮接合部が存在する。
【図８】 図８は、トルイジン染色した三次元皮膚培養
物から得られた表皮部分を示す顕微鏡写真である。表皮
ケラチン細胞（Ｋ）は正常な形態を示し、色素（Ｐ）顆
粒を含有する。細胞の成熟が観察され、角質層（ＳＣ）
が明白である。
【図９】 図９は、ラットに移植７日後の三次元皮膚モ
デルの顕微鏡写真である。判然とした区別のある真皮お
よび表皮の接合部が明白である。細胞は拒絶反応の徴候
なくメッシュへの強固な付着を示す。
【図１０】 図１０は、ラットに移植されて７日後の三
次元皮膚モデルの顕微鏡写真である。コラーゲン束
（ｃ）、および表皮ケラチン細胞（ｋ）、繊維芽細胞
（ｆ）、含脂肪細胞（ａ）、および平滑筋細胞（ｓ）を
包含するすべての種類の細胞が示され、ナイロンメッシ
ュ繊維（ｍ）の周りに自然の配置で並んでいる。
【図１１】 図１１は、肝臓間質細胞上に三次元的な多
層組織を形成する三次元培養法によって増殖させた成体
肝臓培養物の顕微鏡写真である。
【図１２】 図１２は、三次元培養物に接種後、最初の
１０から１２日の間の、活発に分裂中の肝細胞の顕微鏡
写真である。これは肝芽細胞または再生肝細胞に類似し
ている。
【図１３】 図１３は、粘膜上皮の三次元組織培養物の
横断面の顕微鏡写真である。
【図１４】 図１４は、膵臓の三次元組織培養物の横断
面の顕微鏡写真である。矢印は、腺房細胞中のチモーゲ
ン顆粒を示す。星印は間質細胞を示す。
【図１５】 図１５は、血液−脳関門の三次元組織培養
モデル系の横断面の顕微鏡写真である。黒矢印は小血管
内皮細胞を示す。白抜き矢印はニューロン細胞を示す。
星印は星状細胞を示す。
【図１６】 図１６は、腺ガンの三次元組織培養物の横
断面の顕微鏡写真である。
【図１７】 図１７は、単層に増殖した繊維芽細胞の応
答を本発明の三次元メッシュ系で増殖した間質および全
厚さ骨髄の応答と比較したクラフである。細胞生存能力
に関するニュートラルレッドアッセイを用いて、これら
基質はアドリアマイシンに対して用量関連応答を示す。
【図１８】 図１８は、ニュートラルレッドアッセイの
結果を示すグラフであり、間質および骨髄の三次元培養
物はシス−ブラチナムに対して用量関連応答を示す。
【図１９】 図１９は、ヒト新生真皮をミクロピッグに
移植した１０日後の全層創傷の表面の状態を示す写真で
ある。わずかな収縮が示されたが、拒絶反応または脱水
の徴候はない。
【図２０】 図２０は、新生真皮の組織学的評価を示す
顕微鏡写真であり、活性な繊維芽細胞および自然に分泌
されたコラーゲンを伴うメッシュ繊維の横断面を示す。
【図２１】 図２１は、新生真皮（左側）および生物分
解性メッシュのみ（右側）で処理した創傷を比較する写
真である。新生真皮を移植した創傷に於ける、収縮の減
少および色素形成および発毛の増加に注目されたい。
【図２２】 図２２は、ヒト真皮繊維芽細胞溶解物に浸
したメッシュで処置した部位から採取したバイオプシー
の組織学的評価を示す顕微鏡写真である。個々のメッシ
ュ繊維の周りの上皮細胞移動の増加に注目されたい。
【図２３】 図２３は、移植後２１日の真皮均当物の組
織学的評価を示す顕微鏡写真である。上皮細胞は真皮表
面上に移動し、均一に付着しておりそして正常な分化お
よび増殖を示す。深部の網状栓の増殖は、移植された皮
膚の特徴である。３，４カ月のうちに網状栓の消退が観
察される。
【図２４】 図２４は、新生真皮で処置後２１日の全創
傷の写真である。新生真皮の半分が、自己由来培養上皮
移植片を受けた。上皮移植片は均等に治癒し、それ以上
の収縮を防ぎ、そして下にある真皮均当物にしっかりと
付着した。
【図２５】 図２５は、図Ｎに示した表皮／真皮部位の
組織学的評価を示す顕微鏡写真である。表皮ケラチン細
胞の均一な増殖と真皮均当物に対する付着に注目された
い。メッシュ繊維は移植後２１日でなお明白であり、繊
維芽細胞は自然に分泌されたコラーゲン繊維の中で活性
なままである。
フロントページの続き (72)発明者 ノートン，ブライアン，エー. アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10598, ヨークタウン ハイツ，グウィーン ド ライヴ， ボックス ビー339，アール. ディー．２

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 インビトロで調製される遺伝子工学的に
    作製された生存間質組織であって、発現エレメントの制
    御下にある外来遺伝子がトランスフェクションされ、そ
    れにより該外来遺伝子を発現する間質細胞を含み、ここ
    でトランスフェクションされた間質細胞及び該トランス
    フェクションされた間質細胞により自然界で分泌された
    結合組織タンパク質の両者が、生物適合性の非生存物質
    から成る枠組みに付着しかつ実質的に該枠組みを覆って
    いて、該トランスフェクションされた間質細胞によって
    橋かけされた隙間を有する三次元構造物へと構成されて
    いる、生存間質組織。
  2. 【請求項２】 トランスフェクションされた間質細胞が
    繊維芽細胞である、請求項１に記載の遺伝子工学的に作
    製された生存間質組織。
  3. 【請求項３】 トランスフェクションされた間質細胞が
    繊維芽細胞と、内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単
    球、白血球、形質細胞、肥胖細胞または含脂肪細胞との
    組合せである、請求項１に記載の遺伝子工学的に作製さ
    れた生存間質組織。
  4. 【請求項４】 枠組みが生物分解性物質から成る、請求
    項１に記載の遺伝子工学的に作製された生存間質組織。
  5. 【請求項５】 生物分解性物質が綿、ポリグリコール
    酸、腸線(cat gut)縫合糸、セルロース、ゼラチン、ま
    たはデキストランである、請求項４に記載の遺伝子工学
    的に作製された生存間質組織。
  6. 【請求項６】 枠組みが非生物分解性物質から成る、請
    求項１に記載の遺伝子工学的に作成された生存間質組
    織。
  7. 【請求項７】 非生物分解性物質がポリアミド、ポリエ
    ステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレ
    ート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフル
    オロエチレン、またはニトロセルロース化合物である、
    請求項６に記載の遺伝子工学的に作製された生存間質組
    織。
  8. 【請求項８】 枠組みがコラーゲンで予め被覆されてい
    る、請求項４〜７のいずれかに記載の遺伝子工学的に作
    製された生存間質組織。
  9. 【請求項９】 枠組みがメッシュである、請求項１〜７
    のいずれかに記載の遺伝子工学的に作製された生存間質
    組織。
  10. 【請求項１０】 枠組みがメッシュである、請求項８に
    記載の遺伝子工学的に作製された生存間質組織。
  11. 【請求項１１】 さらに間質組織上で培養された実質細
    胞を含む、請求項１に記載の遺伝子工学的に作成された
    生存間質組織。
  12. 【請求項１２】 実質細胞が造血細胞である、請求項１
    １に記載の間質組織。
  13. 【請求項１３】 実質細胞がメラニン細胞、表皮ケラチ
    ン細胞又はそれらの組合せである、請求項１１に記載の
    間質組織。
  14. 【請求項１４】 実質細胞が肝臓柔細胞である、請求項
    １１に記載の間質組織。
  15. 【請求項１５】 実質細胞が膵臓腺房細胞である、請求
    項１１に記載の間質組織。
  16. 【請求項１６】 実質細胞が腎臓柔細胞である、請求項
    １１に記載の間質組織。
  17. 【請求項１７】 実質細胞が粘膜上皮細胞である、請求
    項１１に記載の間質組織。
  18. 【請求項１８】 実質細胞がニューロン細胞および星状
    細胞である、請求項１１に記載の間質組織。
  19. 【請求項１９】 実質細胞が発現エレメントの制御下に
    ある外来遺伝子を含むトランスフェクションされた実質
    細胞である、請求項１１〜１８のいずれかに記載の間質
    組織。
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