JP2012000058A - 腫瘍組織モデルの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 固形腫瘍由来の細胞を含む細胞含有液を配置して細胞層を形成すること、第1液と第2液とを交互に配置して前記細胞層上に細胞外マトリックスを形成すること、及び、前記細胞外マトリックス上に、固形腫瘍由来の細胞を含む細胞含有液を配置して細胞層を形成することにより細胞層を2層以上積層することを含む腫瘍組織モデルの製造方法であって、第1液の含有物と第2液の含有物との組み合わせが、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである。
【選択図】なし
Description
[1] 腫瘍組織モデルの製造方法であって、固形腫瘍由来の細胞を含む細胞含有液を配置して細胞層を形成すること、第1液と第2液とを交互に配置して前記細胞層上に細胞外マトリックスを形成すること、及び、前記細胞外マトリックス上に、固形腫瘍由来の細胞を含む細胞含有液を配置して細胞層を形成することにより細胞層を2層以上積層することを含み、前記第1液の含有物と前記第2液の含有物との組み合わせが、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである、腫瘍組織モデルの製造方法;
[2] 前記細胞層の積層をメンブレンフィルタ上において行う、[1]記載の腫瘍組織モデルの製造方法;
[3] 前記固形腫瘍由来の細胞は、固形腫瘍由来の線維芽細胞である、[1]又は[2]に記載の腫瘍組織モデルの製造方法;
[4] [1]から[3]のいずれかに記載の製造方法により製造された腫瘍組織モデル;
[5] 積層された少なくとも2層の固形腫瘍由来の細胞を含む細胞層と細胞外マトリックスとを含み、前記細胞外マトリックスは少なくとも前記細胞層間に形成されている、[4]記載の腫瘍組織モデル;
[6] [4]又は[5]に記載の腫瘍組織モデルを用いて腫瘍組織に対する被検物質の透過性を評価することを含む、被検物質の評価方法;
[7] 被検物質の透過性評価に用いる評価キットであって、[4]又は[5]に記載の腫瘍組織モデルを有する、評価キット;
に関する。
本発明は、腫瘍組織モデルの製造方法であって、固形腫瘍由来の細胞を含む細胞含有液を配置して細胞層を形成すること、第1液と第2液とを交互に配置して前記細胞層上に細胞外マトリックスを形成すること、及び前記細胞外マトリックス上に固形腫瘍由来の細胞を含む細胞含有液を配置して細胞層を形成することにより細胞層を2層以上積層することを含み、前記第1液の含有物と前記第2液の含有物との組み合わせが、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである、腫瘍組織モデルの製造方法に関する。なお、本発明の腫瘍組織モデルの製造方法において、細胞層の形成と細胞外マトリックスの形成の順序は特に制限されず、細胞層を最初に形成してもよいし、細胞外マトリックスを先に形成してもよい。
本明細書において「細胞外マトリックス」とは、生体内で細胞の外の空間を充填し、骨格的役割、足場を提供する役割、及び/又は、生体因子を保持する役割等の機能を果たす生体内物質を含むものをいい、さらに、in vitro細胞培養において骨格的役割、足場を提供する役割及び/又は生体因子を保持する役割等の機能を果たしうる物質を含んでいてもよい。本明細書において特に記載のない限り「細胞外マトリックス」とは、細胞層及び/又は基体上に第1液と第2液とを交互に配置することにより形成されたものをいう。このような細胞外マトリックスの形成は、例えば、特開2007−279015号公報や、US publication No.2007-0207540等を参照して行うことができる。
RGD配列を有する第1物質、すなわち、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子における前記RGD配列とは、一般に知られている「Arg−Gly−Asp」配列をいう。本明細書において「RGD配列を有する」とは、元来、RGD配列を有するものでもよいし、RGD配列が化学的に結合されたものであってもよい。RGD配列を有する第1物質は、生分解性であることが好ましく、また、水溶性であることが好ましい。RGD配列を有するタンパク質としては、例えば、従来公知の接着性タンパク質が挙げられ、具体的には、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、コラーゲン等が挙げられる。また、RGD配列を有するタンパク質は、例えば、RGD配列を結合させたコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、プロテオグリカン、酵素、抗体等であってもよい。RGD配列を有する高分子としては、例えば、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。RGD配列を有する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリリジン等のポリアミノ酸、キチンやキトサン等の糖、ポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、及びこれらの共重合体等が挙げられる。RGD配列を有する合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、星型等のRGD配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−co−ポリアクリル酸)、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、ポリ(メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン)等が挙げられる。
相互作用する第2物質は、生分解性であることが好ましく、また、水溶性であることが好ましい。相互作用する第2物質のうち、RGD配列を有する第1物質と相互作用するタンパク質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、抗体等が挙げられる。また、RGD配列を有する第1物質と相互作用する高分子としては、例えば、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。RGD配列を有する第1物質と相互作用する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、エラスチン、ポリアミノ酸、ポリエステル、ヘパリンやヘパラン硫酸、デキストラン硫酸等の糖、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体等が挙げられる。RGD配列を有する第1物質と相互作用する合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、星型等のRGD配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコール−グラフト−ポリアクリル酸、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−co−ポリアクリル酸)、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、ポリ(メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン)等が挙げられる。
正の電荷を有する第1物質のうち、正の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムc、ペルオキシダーゼ、ミオグロビン等が挙げられる。正の電荷を有する第1物質のうち、正の電荷を有する高分子としては、例えば、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、ポリエステル、キチンやキトサン等の糖、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、ポリ(α−リジン)、ポリ(ε−リジン)等のポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
負の電荷を有する第2物質のうち、負の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、卵白アルブミン等が挙げられる。負の電荷を有する第2の物質のうち、負の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリ(βリジン)等のポリアミノ酸、デキストラン硫酸、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール等が挙げられる。
細胞層の形成は、固形腫瘍由来の細胞を含む細胞含有液を配置することにより行う。細胞含有液の配置は、例えば、基体上の所定の領域及び/又は所定の領域に形成された細胞外マトリックスに細胞含有溶液を配置することにより行うことが好ましい。なお、細胞含有溶液の配置は、第1液及び第2液の配置と同様に行うことができる。また、細胞層の形成は、後述するメンブレンフィルタ上に直接行ってもよいし、メンブレンフィルタ上に形成された細胞外マトリックス上に行ってもよい。
本発明は、その他の態様として、本発明の製造方法により製造された腫瘍組織モデルに関する。本発明の腫瘍組織モデルによれば、例えば、従来の方法と比較して実際の腫瘍組織に近い環境で薬剤評価を行うことができるという効果を奏しうる。また、本発明の腫瘍組織モデルは、例えば、新薬の創出(スクリーニング)等における各種分子量の薬物の動態評価、とりわけ分子量の大きな薬剤の動態評価において極めて有用なツールとなりうる。
本発明は、さらにその他の態様として、本発明の腫瘍組織モデルを用いて腫瘍組織に対する被検物質の透過性を評価することを含む被検物質の評価方法に関する。本発明の評価方法によれば、例えば、従来の方法と比較して実際の腫瘍組織に近い環境で薬剤評価を行うことができるという効果を奏しうる。また、本発明の評価方法は、例えば、新薬の創出(スクリーニング)等における各種分子量の薬物の動態評価、とりわけ分子量の大きな薬剤の動態評価において極めて有用なツールとなりうる。
本発明は、さらにその他の態様として、被検物質の透過性評価に用いる評価キットであって、本発明の腫瘍組織モデルを有する評価キットに関する。本発明の評価キットによれば、本発明の被検物質の評価方法をより簡便に行うことができる。
FN:フィブロネクチン
FITC:Fluoresceinisothiocyanato
FBS:ウシ胎児血清
DMEM培地:ダルベッコ改変イーグル培地
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
[膵上皮内癌由来線維芽細胞の積層培養体(腫瘍組織モデル)の作製]
12ウェル培養プレートに配置したセルカルチャーインサート(商品名、BD製;ポアサイズ:0.4μm(HD))に、細胞外マトリックス形成用第1液(0.2mg/mLフィブロネクチン(シグマ製)、10mMリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4))と細胞外マトリックス形成用第2液(0.2mg/mLゼラチン、10mMリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4))とを交互に添加した。ついで、FN/ゼラチンでコートされたセルカルチャーインサートに、少量の培地に分散させたマウス膵上皮内癌由来線維芽細胞(K643f細胞)を添加した(1.44×105cells/well)。細胞添加から30分後、インサートの上段及びインサートの下段(培養プレート)に培地をそれぞれ添加し、細胞培養インキュベーター(37℃、5%CO2)で12〜24時間インキュベーションすることにより、第1の細胞層を形成した。ついで、セルカルチャーインサートにPBSを添加し、細胞層を洗浄した。洗浄後のセルカルチャーインサートに、上記細胞外マトリックス形成用第1液と上記細胞外マトリックス形成用第2液とを交互に添加することにより、K643f細胞層表面にFN/ゼラチンの薄膜(細胞外マトリックス)を形成した。さらに、細胞層の形成、洗浄、及びFN/ゼラチン薄膜の形成を2回繰り返し行った。なお、培地は、20%FBS及び1%P/Sを含むRPMI1640培地(Gibco製)を使用した。
実施例1で作製したK643f細胞層が3層積層された腫瘍組織モデルを用いて下記の条件でデキストラン透過性試験を行った。
K643f細胞層が3層積層された実施例1の腫瘍組織モデルが形成されたセルカルチャーインサートを上記培地で洗浄した。セルカルチャーインサートの上段(図1における11)に0.1mg/mL FITC−デキストラン(デキストラン分子量:250kDa、流体力学直径:12nm、シグマ製)を添加して静置した。1時間後、4時間後、8時間後及び24時間後に、セルカルチャーインサートの上段(図1における11)及びセルカルチャーインサートの下段(培養プレート、図1における13)からそれぞれ溶液をサンプリングし、NanoDrop 3300蛍光スペクトロメータ(商品名、Thermo製)を用いてそれぞれにおけるFITC−デキストランの蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度(上段から採取した溶液における蛍光強度及び下段から採取した溶液における蛍光強度)をFITC−デキストラン濃度に換算し、下記式より、腫瘍組織モデルを透過したデキストランの割合を測定した。その結果を図2に示す。図2において、縦軸が腫瘍組織モデルを透過したデキストランの割合であり、横軸がデキストラン添加後の経過時間を示す。
透過デキストランの割合(%)=[(下段濃度)×(下段容量)/(初期上段濃度)×(上段容量)]×100
参考例として、K643f細胞(1.44×105cells/well)に替えて、マウス胎仔皮膚由来線維芽細胞(NIH3T3細胞、0.72×105cells/well)を使用し、培地として10%FBS(ウシ胎児血清)及び1%P/Sを含むDMEM培地(Gibco製)を使用した以外は、実施例1と同様にNIH3T3細胞が3層積層された培養体を作製し、デキストラン透過性試験を行った。その結果を図2に示す。
細胞層の積層を2層とした以外は、実施例1と同様に細胞外マトリックスの形成及び細胞層の積層を行うことにより、K643f細胞層が2層積層された腫瘍組織モデルを作製した。
細胞層の積層を5層とした以外は、実施例1と同様に細胞外マトリックスの形成及び細胞層の積層を行うことにより、K643f細胞層が5層積層された腫瘍組織モデルを作製した。
実施例3で作製した腫瘍組織モデル(K643f細胞層が2層積層)及び実施例4で作製した腫瘍組織モデル(K643f細胞層が5層積層)を用いて、実施例2と同様にデキストラン透過性試験を行った。その結果、K643f細胞層が5層積層された実施例4の腫瘍組織モデルは、K643f細胞層が2層積層された実施例3の腫瘍組織モデルと比較して、デキストランの透過性が低いことが確認できた(date not shown)。
FITC−デキストラン(250kDa、シグマ製)に替えて、FITC−デキストラン(デキストランの分子量:2000kDa、流体力学直径:31nm、シグマ製)を使用した以外は、実施例5と同様にデキストラン透過性試験を行った。その結果、K643f細胞層が5層積層された実施例4の腫瘍組織モデルは、K643f細胞層が2層積層された実施例3の腫瘍組織モデルと比較して、デキストランの透過性が低いことが確認できた(date not shown)。また、2000kDaのデキストランを用いた実施例6では、250kDaのデキストランを用いた実施例5と比べて、細胞層が2層の腫瘍組織モデル及び5層の腫瘍組織モデルの双方においてデキストランの透過性が低いことが確認できた(date not shown)。
K643f細胞に替えて、癌細胞(K399細胞)とK643f細胞とを1:2の比率で混合した細胞を用いた以外は、実施例1と同様に細胞外マトリックスの形成及び細胞層の積層を行うことにより、K643f細胞及びK399細胞とを含む細胞層が3層積層された腫瘍組織モデルを作製した。
K643f細胞に替えて、K399細胞を用いた以外は、実施例1と同様に細胞外マトリックスの形成及び細胞層の積層を行うことにより、K643f細胞及びK399細胞とを含む細胞層が3層積層された腫瘍組織モデルを作製した。
実施例7で作製した腫瘍組織モデル(K643f細胞及びK399細胞とを含む細胞層が3層積層)及び実施例8で作製した腫瘍組織モデル(K399細胞層が3層積層)を用いて、実施例2と同様にデキストラン透過性試験を行った。その結果を、実施例2の結果(実施例1で作製した腫瘍組織モデル(K643f細胞層を3層積層)の結果)とあわせて図3に示す。図3において、縦軸が腫瘍組織モデルを透過したデキストランの割合であり、横軸がデキストラン添加後の経過時間を示す。
12 腫瘍組織モデル
13 培養皿
Claims (7)
- 腫瘍組織モデルの製造方法であって、
固形腫瘍由来の細胞を含む細胞含有液を配置して細胞層を形成すること、
第1液と第2液とを交互に配置して前記細胞層上に細胞外マトリックスを形成すること、及び、
前記細胞外マトリックス上に、固形腫瘍由来の細胞を含む細胞含有液を配置して細胞層を形成することにより細胞層を2層以上積層することを含み、
前記第1液の含有物と前記第2液の含有物との組み合わせが、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである、腫瘍組織モデルの製造方法。 - 前記細胞層の積層をメンブレンフィルタ上において行う、請求項1記載の腫瘍組織モデルの製造方法。
- 前記固形腫瘍由来の細胞は、固形腫瘍由来の線維芽細胞及び腫瘍細胞の少なくとも一方を含む、請求項1又は2に記載の腫瘍組織モデルの製造方法。
- 請求項1から3のいずれかに記載の製造方法により製造された腫瘍組織モデル。
- 積層された少なくとも2層の固形腫瘍由来の細胞を含む細胞層と細胞外マトリックスとを含み、前記細胞外マトリックスは少なくとも前記細胞層間に形成されている、請求項4記載の腫瘍組織モデル。
- 請求項4又は5に記載の腫瘍組織モデルを用いて腫瘍組織に対する被検物質の透過性を評価することを含む、被検物質の評価方法。
- 被検物質の透過性評価に用いる評価キットであって、請求項4又は5に記載の腫瘍組織モデルを有する、評価キット。
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