JP6341553B2 - 三次元組織体及びその製造方法 - Google Patents
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Description
本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記細胞が三次元に配置された三次元組織体であって、前記三次元組織体は、少なくとも1つの開口構造を表面に有し、かつ、管状構造を内部に有し、前記開口構造と前記管状構造とは連結している三次元組織体(以下、「本開示の三次元組織体」ともいう)に関する。本開示の三次元組織体は、一又は複数の実施形態において、薬剤及び薬剤キャリア等の透過性や周辺組織への浸透性、並びに薬効発現の評価を行うことができうるという効果を奏し、また、創薬スクリーニングのためのモデルとして使用できうる。また、本開示の三次元組織体は、一又は複数の実施形態において、癌細胞の浸潤や転移、又は抗癌剤の評価等を行うことができうるという効果を奏する。
本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記細胞が三次元に配置された三次元組織体の製造方法(以下、「本開示の三次元組織体の製造方法」ともいう)に関する。本開示の三次元組織体の製造方法は、一又は複数の実施形態において、基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞とを配置して細胞が三次元に配置された細胞集積体を形成すること、前記細胞集積体上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞が配置された細胞集積体を培養して前記細胞集積体表面に開口構造を形成し、かつ前記細胞集積体内に前記開口構造と連結する管状構造を形成することを含む。また、本開示の三次元組織体の製造方法は、一又は複数の実施形態において、基材上に血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞とを配置して細胞が三次元に配置された細胞集積体を形成すること、前記細胞集積体上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び前記細胞集積体上に配置された血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を、最表層として培養することを含む。本開示の三次元組織体の製造方法によれば、本開示の三次元組織体を簡単に製造することができる。
細胞集積体の形成は、一又は複数の実施形態において、基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞上に、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を三次元に配置することを含む。細胞集積体の形成は、一又は複数の実施形態において、さらに、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞の配置、及び被覆細胞の配置を繰返し行ってもよい。
細胞集積体の形成は、一又は複数の実施形態において、基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞との混合物を三次元に配置することを含む。
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の三次元組織体を用いた被検物質を評価する方法(以下、「本開示の評価方法」ともいう)に関する。本開示の評価方法は、前記被検物質を、三次元組織体の開口構造を有する表面に接触させること、及び、被検物質の接触による被検物質による三次元組織体への影響を観察することを含む。本開示の評価方法によれば、一又は複数の実施形態において、従来の方法と比較して生体に近い環境で被検物質の評価を行うことができるという効果を奏しうる。本開示の評価方法は、一又は複数の実施形態において、新薬の創出(スクリーニング)等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用なツールとなりうる。
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の三次元組織体と、三次元組織体が配置された培養基材と、記基材を配置可能な培養容器とを含むキット(以下、「本開示のキット」ともいう)に関する。本開示のキットによれば、一又は複数の実施形態において、本開示の評価方法をより簡便に行うことができる。本開示のキットは、一又は複数の実施形態において、所定の検査に用いる試薬、材料、用具、及び装置、並びに、その評価についての説明書(取扱説明書)の少なくとも1つを含む製品をさらに含んでいてもよい。
RGD配列を有する物質とは、細胞接着活性を担うアミノ酸配列である「Arg−Gly−Asp」(RGD)配列をするタンパク質又は高分子をいう。本明細書において「RGD配列を有する」とは、元来RGD配列を有するものでもよいし、RGD配列が化学的に結合されたものでもよい。RGD配列を有する物質は、一又は複数の実施形態において、生分解性である。
相互作用する物質とは、RGD配列を有する物質と相互作用するタンパク質若しくは高分子をいう。本明細書において「相互作用する」とは、一又は複数の実施形態において、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、及び又はファンデルワールス力等によって化学的及び又は物理的にRGD配列を有する物質と相互作用する物質とが結合、接着、吸着又は電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。相互作用する物質は、生分解性であることが好ましい。
正の電荷を有する物質とは、正の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。正の電荷を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムc、ペルオキシダーゼ、又はミオグロビン等が挙げられる。正の電荷を有する高分子としては、一又は複数の実施形態において、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、ポリ(α−リジン)、ポリ(ε−リジン)等のポリリジン、ポリアルギニン、又はポリヒスチジン等が挙げられる。合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド(PDDA)、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
負の電荷を有する物質とは、負の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。負の電荷を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、又は卵白アルブミン等が挙げられる。負の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリ(βリジン)等のポリアミノ酸、又はデキストラン硫酸等が挙げられる。合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアリルアミン塩、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
〔1〕 細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記細胞が三次元に配置された三次元組織体であって、
前記三次元組織体は、表面に少なくとも1つの開口構造を有し、かつ、内部に前記開口構造と連結する分岐した管状構造を有する、三次元組織体。
〔2〕 前記開口構造は、前記三次元組織体の上部表面に形成されている、〔1〕記載の三次元組織体。
〔3〕 前記開口構造は、前記三次元組織体の厚み方向の面にそれぞれ形成されている、〔1〕又は〔2〕に記載の三次元組織体。
〔4〕 前記三次元組織体の厚み方向の面にそれぞれ形成された少なくとも1対の開口構造が、前記管状構造によって連通している、〔3〕記載の三次元組織体。
〔5〕 前記管状構造は、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群から選択される少なくとも一つを含む、〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の三次元組織体。
〔6〕 細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記細胞が三次元に配置された三次元組織体の製造方法であって、
基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞とを配置して細胞が三次元に配置された細胞集積体を形成すること、
前記細胞集積体上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び
前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞が配置された細胞集積体を培養して前記細胞集積体表面に開口構造を形成し、かつ前記細胞集積体内に前記開口構造と連通した管状構造を形成すること、を含む、三次元組織体の製造方法。
〔7〕 細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記細胞が三次元に配置された三次元組織体の製造方法であって、
基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞とを配置して細胞が三次元に配置された細胞集積体を形成すること、
前記細胞集積体上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び
前記細胞集積体上に配置された血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を、最表層として培養すること、を含む、三次元組織体の製造方法。
〔8〕 前記三次元組織体は、表面に少なくとも1つの開口構造を有し、かつ、内部に前記開口構造と連結する分岐した管状構造を有する、〔7〕記載の製造方法。
〔9〕 細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記細胞が三次元に配置された三次元組織体の製造方法であって、
基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び
前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞とを配置して細胞が三次元に配置された細胞集積体を形成すること、を含む、三次元組織体の製造方法。
〔10〕 前記細胞集積体の形成は、
前記基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び
前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞上に、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を三次元に配置すること、を含む、〔6〕から〔9〕のいずれかに記載の製造方法。
〔11〕 前記細胞集積体の形成は、
前記基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、
前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞上に、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を三次元に配置すること、
前記三次元に配置された被覆細胞上に血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び
被覆細胞上に配置された血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞上に細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を三次元に配置することを含む、〔6〕から〔9〕のいずれかに記載の製造方法。
〔12〕 前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞が配置された細胞集積体の培養は、前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を最表層として行う、〔6〕から〔11〕のいずれかに記載の製造方法。
〔13〕 細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記細胞が三次元に配置された三次元組織体の製造方法であって、
基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、
前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞上に、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を三次元に配置すること、
前記被覆細胞上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、
前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞上に、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を三次元に配置すること、
前記被覆細胞上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び
前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞が最表層に配置された状態で、培養を行うことを含む、三次元組織体の製造方法。
〔14〕 細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記細胞が三次元に配置された三次元組織体の製造方法であって、
基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること(工程a)、
前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞上に、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を三次元に配置すること(工程b)、
前記被覆細胞上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること(工程c)、及び
前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞が最表層に配置された状態で、培養を行うこと(工程d)を含む、三次元組織体の製造方法。
〔15〕 工程bと工程cとの間において、被覆細胞の配置と、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞の配置を交互に1回又は2回以上行うこと、〔14〕記載の製造方法。
〔16〕 前記基材は、多孔質膜を含む、〔6〕から〔12〕のいずれかに記載の製造方法。
〔17〕 〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の三次元組織体を製造することを含む、〔6〕から〔16〕のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
〔18〕 〔6〕から〔17〕のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法により製造されうる、三次元組織体。
〔19〕 〔1〕から〔5〕及び〔18〕のいずれかに記載の三次元組織体と、
前記三次元組織体が配置された培養基材と、
前記基材を配置可能な培養容器と、を含むキット。
〔20〕 三次元組織体を用いた被検物質を評価する方法であって、
前記三次元組織体は、〔1〕から〔5〕及び〔18〕のいずれかに記載の三次元組織体であり、
前記被検物質を、前記三次元組織体の開口構造を有する表面に接触させること、及び
前記被検物質の接触による被検物質による三次元組織体への影響を観察することを含む、評価方法。
50mM Tris-HCl(pH7.4):HCl(Nacalai Tesque社製)でpH7.4に調整した50mM Trisを、0.2μm γ-ray sterile filter(倉敷紡績株式会社製)で滅菌濾過したもの
BFN:Fibronectin from bovine plasma(SIGMA製)
BFN溶液:0.04mg BFN/1ml 50mM Tris-HCl(pH7.4)
Gelatin溶液:0.04mg Gelatin/1ml 50mM Tris-HCl(pH7.4)を、0.2μm γ-ray sterile filter(倉敷紡績株式会社製)で滅菌濾過したもの
DMEM培地:10wt% FBS(GIBCO社製)を含むDulbecco's eagle's medium(SIGMA社製)
[被覆細胞の作製]
NHDF被覆細胞の作製
NHDF(正常ヒト皮膚線維芽細胞、CAMBREX社製)を培地(DMEM、Invitrogen社製)で培養し、トリプシン処理(0.25%トリプシン、0.02%EDTA)(37℃、20分間)して細胞を回収した。回収したNHDFを1×106cell/mlの濃度でBFN溶液に分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った(FN浸漬操作)。ついで、上澄みを除き、50 mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を加え、細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った(洗浄操作)。上澄みを除き、Gelatin溶液に細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら、1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行い(G浸漬操作)、ついで洗浄操作を行った。そして、FN浸漬操作、洗浄操作、G浸漬操作、及び洗浄操作をこの順番で行った。FN浸漬操作及びG浸漬操作は洗浄操作とそれぞれセットで1ステップとし、最終的に、FN浸漬操作を5回、G浸漬操作を4回、計9ステップ行うことによってNHDF被覆細胞を作製した(ECM被膜の厚み:6nm)。
24ウェル培養プレートに配置したインサート(コーニング社製、ポアサイズ:0.4μm)にBFN溶液を添加し15分インキュベートすることでインサート表面にFNをーティングした。7×104個のHUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞、Lonza社製)を播種し、DMEM培地を添加して37℃で12〜24時間培養した。ついで、その上に4×105個のNHDF被覆細胞を播種し、37℃で12〜24時間培養した。その上にBFN溶液とGelatin溶液とを交互に1回ずつ加えてNHDF層上にFN-G膜を形成した後、7×104個のHUVECの播種及び培養(37℃12〜24時間)、4×105個のNHDF被覆細胞の播種及び培養(37℃12〜24時間)、並びにFN-G膜の形成を行った。ついで、その上に7×104個のHUVECを播種した後、37℃で2日間培養して三次元組織体を得た(厚み:60μm)。得られた三次元組織体をパラホルムアルデヒドで固定した後、HUVECを抗CD31抗体、核を4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)で染色し、共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)にて観察した。その結果を図1に示す。
ポアサイズが8μmのインサート(コーニング社製)を用いた以外は、実施例1と同様にして三次元組織体(厚み:60μm)を作製し、CLSMにて観察した。その結果を図2に示す。図2は、得られた三次元組織体のCLSM画像であって、図2Aは最表層のCLSM画像、図2Bは中間層のCLSM画像、及び図2Cは最下層のCLSM画像である。
実施例1と同様のインサートを使用し、その上に4×105個のNHDF被覆細胞を播種し、DMEM培地を添加して37℃で12〜24時間培養した。その上にBFN溶液とGelatin溶液とを交互に1回ずつ加えてNHDF層上にFN-G膜を形成した後、7×104個のHUVECの播種及び培養(37℃12〜24時間)、及び4×105個のNHDF被覆細胞の播種及び培養(37℃2日間)を行い、三次元組織体を得た。得られた三次元組織体を実施例1と同様にしてCLSMにて観察した。その結果を図3に示す。図3AはZY平面のCLSM画像、図3Bは中間層のCLSM画像を示す。
実施例2と同様のインサートを使用し、その上に7×104個のHUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞、Lonza社製)を播種し、DMEM培地を添加して37℃で12〜24時間培養した。ついで、その上に4×105個のNHDF被覆細胞を播種し、37℃で12〜24時間培養した。その上にBFN溶液とGelatin溶液とを交互に1回ずつ加えてNHDF層上にFN-G膜を形成した後、7×104個のHUVECを播種し、37℃で2日間培養して三次元組織体を得た。得られた三次元組織体を、実施例1と同様にしてCLSMによる観察を行ったところ、得られた三次元組織体は、実施例2の三次元組織体と同様に、内部にCD31陽性の毛細血管様構造が明確に確認された。さらに、三次元組織体の最表層及び最下層にはそれぞれ開口構造が形成されていることが確認できたと共に、最表層と最下層とに形成された開口構造が、内部に形成された毛細血管様構造によって連通していることが確認できた。
実施例2の三次元組織体について、最表層、中間層(最表層から深さ20μmの位置)及び最下層(最表層から深さ60μmの位置)のそれぞれにおける毛細血管様構造の孔径の測定を行った。測定は、共焦点レーザー顕微鏡観察により行った。その結果を図4Aに示す。また、比較例1の三次元組織体について、同様の方法で、中間層(最表層から深さ20μmの位置)における毛細血管様構造の孔径の測定を行った。その結果を図4Aに示す。
実施例2の三次元組織体を用いて、三次元組織体に形成された毛細血管様構造における物質透過性の評価を行った。評価は、三次元組織体の最表層に1mg/mL FITC dextran 250k(FD250k)(粒径:11nm)のPBS液を添加し、CLSMで観察することにより行った。その画像の一例を図5に示す。図5AはFD250k添加前の中間層のCLSM画像であり、図5Bは添加から約10分経過後の中間層のCLSM画像である。図5A及びBに示すように、FD250kは、三次元組織体における毛細血管様構造の内部に選択的に拡散し、局在化していることが確認できた。これにより、最表層に開口構造を有する実施例2の三次元組織体においてFD250kは、三次元組織体の表面からランダムに発生する単純拡散ではなく、最表層の開口構造を通じて毛細血管様構造内に透過したことが確認できた。また、添加から10分経過した時点で、FD250kは三次元組織体の最下層に到達し、最下層の開口構造から外部に排出されていることが確認できた。これらにより、最表層を覆うHUVEC及び毛細血管様構造を構成するHUVECが、緻密な細胞間結合であるタイトジャンクションを形成することが示唆された。
実施例2及び3並びに比較例1の三次元組織体を用いて、三次元組織体に形成された毛細血管様構造における物質透過性の評価を透過率の測定により行った。評価は、三次元組織体の最表層に1mg/mL FITC dextran 70k(FD70k)(粒径:4nm)のPBS液を添加し、添加から1、2、6(又は18)、及び12時間経過後にインサートを配置したウェル内の蛍光強度を測定し、得られた蛍光強度から透過率を算出することにより行った。その結果を図6に示す。また、FD70kの透過の様子をCLSMにより観察した。
実施例2の三次元組織体を用いて、三次元組織体に形成された毛細血管様構造におけるマイクロ粒子の透過性の評価をした。評価は、三次元組織体の最表層にマイクロ粒子(粒径:4μm)含有液(1.8×105個/mL)0.1mLを添加し、37℃で1日間静置した後、三次元組織体の最表層にPBS0.2mLを添加して洗浄し、洗浄後の毛細血管様構造内をCLSMで観察することにより行った。その画像の一例を図7に示す。図7Aはマイクロ粒子添加前の中間層のCLSM画像であり、図7Bは洗浄後の中間層のCLSM画像である。図7Bに示すように、マイクロ粒子は、三次元組織体における毛細血管様構造の内部に選択的に拡散し、局在化していることが確認できた。これにより、最表層に開口構造を有する実施例2の三次元組織体においてマイクロ粒子は、FD250kと同様に、三次元組織体の表面からランダムに発生する単純拡散ではなく、最表層の開口構造を通じて毛細血管様構造内に透過したことが確認できた。
実施例2の三次元組織体を用いて、三次元組織体に形成された毛細血管様構造における物質透過性の評価をした。評価は、共焦点レーザー顕微鏡観察にて行った。その画像の一例を図8に示す。図8は赤血球添加後のCLSM画像である。図8に示すように、赤血球は、三次元組織体における毛細血管様構造の内部に選択的に拡散し、局在化していることが確認できた。これにより、最表層に開口構造を有する実施例2の三次元組織体においてヒト赤血球は、三次元組織体の表面からランダムに発生する単純拡散ではなく、最表層の開口構造を通じて毛細血管様構造内に透過したことが確認できた。
実施例2と同様にして作製した三次元組織体を、37℃でさらに1、2、3又は4日間培養したものを用い、三次元組織体におけるFD70kの透過率を評価した。なお、NHDFはCelltracker Greenを用いて染色した。その結果を図9に示す。図9Aは培養1日目の中間層のCLSM画像、図9Bは培養2日目の中間層のCLSM画像、図9Cは培養3日目の中間層のCLSM画像、図9Dは培養日数と透過率との関係を示すグラフである。図9Dに示すように、いずれの培養日数においても同程度の透過率を示し、培養日数による透過率の変化はほとんど見られなかった。
Claims (14)
- 細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記細胞が三次元に配置された三次元組織体の製造方法であって、
基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞とを配置して細胞が三次元に配置された細胞集積体を形成すること、
前記細胞集積体上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び
前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞が配置された細胞集積体を培養して前記細胞集積体表面に開口構造を形成し、かつ前記細胞集積体内に前記開口構造と連結する管状構造を形成すること、を含む、三次元組織体の製造方法。 - 細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記細胞が三次元に配置された三次元組織体の製造方法であって、
基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞とを配置して細胞が三次元に配置された細胞集積体を形成すること、
前記細胞集積体上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び
前記細胞集積体上に配置された血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を、最表層として培養すること、を含む、三次元組織体の製造方法。 - 前記三次元組織体は、表面に少なくとも1つの開口構造を有し、かつ、内部に前記開口構造と連結する分岐した管状構造を有する、請求項2記載の製造方法。
- 細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記細胞が三次元に配置された三次元組織体の製造方法であって、
基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び
前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞とを配置して細胞が三次元に配置された細胞集積体を形成すること、を含む、三次元組織体の製造方法。 - 前記細胞集積体の形成は、
前記基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び
前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞上に、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を三次元に配置すること、を含む、請求項1から4のいずれかに記載の製造方法。 - 前記細胞集積体の形成は、
前記基材上に、血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、
前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞上に、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を三次元に配置すること、
前記三次元に配置された被覆細胞上に血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を配置すること、及び
被覆細胞上に配置された血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞上に細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を三次元に配置することを含む、請求項1から4のいずれかに記載の製造方法。 - 前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞が配置された細胞集積体の培養は、前記血管内皮細胞及び/又はリンパ管内皮細胞を最表層として行う、請求項1から6のいずれかに記載の製造方法。
- 前記基材は、多孔質膜を含む、請求項1から7のいずれかに記載の製造方法。
- 請求項1から8のいずれかに記載の製造方法により製造される三次元組織体であって、
細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記細胞が三次元に配置され、
前記三次元組織体は、上部表面に少なくとも1つの開口構造を有し、かつ、内部に前記開口構造と連結する分岐した管状構造を有する、三次元組織体。 - 前記開口構造は、前記三次元組織体の厚み方向の面にそれぞれ形成されている、請求項9に記載の三次元組織体。
- 前記三次元組織体の厚み方向の面にそれぞれ形成された少なくとも1対の開口構造が、前記管状構造によって連通している、請求項10に記載の三次元組織体。
- 前記管状構造は、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求項9から11のいずれかに記載の三次元組織体。
- 請求項9から12のいずれかに記載の三次元組織体と、
前記三次元組織体が配置された培養基材と、
前記基材を配置可能な培養容器と、を含むキット。 - 三次元組織体を用いた被検物質を評価する方法であって、
前記三次元組織体は、請求項9から12のいずれかに記載の三次元組織体であり、
前記被検物質を、前記三次元組織体の開口構造を有する表面に配置すること、及び
前記被検物質を配置したことによって被検物質による三次元組織体への影響を観察することを含む、評価方法。
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