JP6519050B2 - 人工皮膚組織、人工皮膚モデル及びそれらの製造方法 - Google Patents
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Description
前記真皮組織層上に形成されたIV型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織に関する。
前記真皮組織層上にIV型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にIV型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織の製造方法に関する。
本開示の人工皮膚モデルの製造方法は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、前記真皮組織層上にIV型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にIV型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成することを含む。
真皮組織層は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養することにより形成される。細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された被覆細胞を培養することにより、被覆細胞が集積され、さらには細胞外マトリックス成分を含む被膜を介して隣接する被覆細胞同士が接着することにより、被覆細胞が三次元に積層された真皮組織層を形成することができる。
基底層は、真皮組織層にコラーゲンIVを接触させることにより作製することができる。コラーゲンIVとの接触は、一又は複数の実施形態において、コラーゲンIV含有液を基底層に塗布、浸漬、滴下、又は噴霧すること等により行うことができる。
表皮層は、基底層上で表皮細胞を培養した後、気液培養して表皮細胞を分化誘導させることによって形成することができる。表皮細胞としては、例えば、表皮角化細胞が使用できる。
本開示の人工皮膚モデルの製造方法において、真皮組織層及び/又は表皮層は樹状細胞を含む。樹状細胞は、一又は複数の実施形態において、真皮組織層の形成において、真皮組織層を構成するための被覆細胞(例えば、線維芽細胞等)と混合させて培養したり、あるいは、真皮組織層を構成するための被覆細胞が積層された細胞層間に配置して培養してもよい。また、表皮層の形成において、表皮細胞と混合されて培養してもよいし、表皮細胞が積層された細胞層間に配置して培養してもよい。樹状細胞は、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆されていてもよい。
RGD配列を有する物質とは、細胞接着活性を担うアミノ酸配列である「Arg−Gly−Asp」(RGD)配列をするタンパク質又は高分子をいう。本明細書において「RGD配列を有する」とは、元来RGD配列を有するものでもよいし、RGD配列が化学的に結合されたものでもよい。RGD配列を有する物質は、生分解性であることが好ましい。
相互作用する物質とは、RGD配列を有する物質と相互作用するタンパク質若しくは高分子をいう。本明細書において「相互作用する」とは、例えば、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、及び又はファンデルワールス力等により、化学的及び又は物理的にRGD配列を有する物質と相互作用する物質とが結合、接着、吸着又は電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。相互作用する物質は、生分解性であることが好ましい。
正の電荷を有する物質とは、正の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。正の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムc、ペルオキシダーゼ、又はミオグロビン等が挙げられる。正の電荷を有する高分子としては、例えば、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、ポリ(α−リジン)、ポリ(ε−リジン)等のポリリジン、ポリアルギニン、又はポリヒスチジン等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド(PDDA)、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
負の電荷を有する物質とは、負の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。負の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、又は卵白アルブミン等が挙げられる。負の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリ(βリジン)等のポリアミノ酸、又はデキストラン硫酸等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアリルアミン塩、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の製造方法により製造される人工皮膚モデルに関する。本開示の人工皮膚モデルは、細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、前記真皮組織層上に形成されたIV型コラーゲンを含む基底層と、前記基底層上に形成された表皮層とを有し、前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む。本開示の人工皮膚モデルによれば、例えば、実際の皮膚に近い環境で、被検物質の薬効試験、免疫応答、薬理試験及び安全性試験等の評価を行うことができる。また、本開示の人工皮膚モデルは、例えば、火傷や創傷の治療のための被覆材として用いることもできる。
本発明は、さらにその他の態様として、本開示の人工皮膚モデルを用いた被検物質の皮膚に対する刺激性を評価する方法に関する。本開示の評価方法によれば、例えば、従来の方法と比較して実際の皮膚に近い環境で被検物質の評価を行うことができるという効果を奏しうる。また、本開示の評価方法は、例えば、新薬の創出(スクリーニング)等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用なツールとなりうる。
本発明は、さらにその他の態様として、被検物質の刺激性の評価キットに関する。本開示の評価キットは、本開示の人工皮膚モデルを含む。本開示の評価キットによれば、例えば、本開示の評価方法をより簡便に行うことができる。
本発明は、さらにその他の態様として、人工皮膚モデル製造用キットに関する。本開示の人工皮膚モデル製造用キットは、例えば、細胞外マトリックス成分を含む被膜の形成に用いる試薬、及び本開示の人工皮膚モデルの製造方法が記載された説明書を含むことが好ましい。本開示の人工皮膚モデル製造用キットによれば、より簡便に本開示の人工皮膚モデルを製造することができる。
〔A1〕細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたIV型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織。
〔A2〕細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、
前記真皮組織層上にIV型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にIV型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織の製造方法。
〔A3〕前記真皮組織層の形成は、前記被覆細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された樹状細胞とを培養することを含む、〔A2〕記載の製造方法。
〔A4〕前記表皮層の形成は、前記基底層上に、表皮細胞と樹状細胞とを配置することを含む、〔A2〕又は〔A3〕に記載の製造方法。
〔A5〕前記基底層の形成は、前記真皮組織層上にIV型コラーゲン層とラミニン層とが交互に形成されるように、前記真皮組織層にIV型コラーゲン又はラミニンを接触させることを含む、〔A2〕から〔A4〕のいずれかに記載の製造方法。
〔A6〕前記被覆細胞は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された線維芽細胞を含む、〔A2〕から〔A5〕のいずれかに記載の製造方法。
〔A7〕〔A2〕から〔A6〕のいずれかに記載の製造方法により製造される人工皮膚組織。
〔A8〕細胞外マトリックス成分と前記細胞外マトリックス成分を介して積層された細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたIV型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層が、樹状細胞とリンパ管とを含む、人工皮膚組織。
〔A9〕前記真皮組織層における樹状細胞と真皮組織層を形成する樹状細胞以外の細胞との比が1:99〜50:50である、〔A8〕記載の人工皮膚組織。
〔B1〕細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、
前記真皮組織層上にIV型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にIV型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚モデルの製造方法。
〔B2〕前記真皮組織層の形成は、前記被覆細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された樹状細胞とを培養することを含む、〔B1〕記載の製造方法。
〔B3〕前記表皮層の形成は、前記基底層上に、表皮細胞と樹状細胞とを配置することを含む、〔B1〕又は〔B2〕に記載の製造方法。
〔B4〕前記基底層の形成は、前記真皮組織層上にIV型コラーゲン層とラミニン層とが交互に形成されるように、前記真皮組織層にIV型コラーゲン又はラミニンを接触させることを含む、〔B1〕から〔B3〕のいずれかに記載の製造方法。
〔B5〕前記被覆細胞は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された線維芽細胞である、〔B1〕から〔B4〕のいずれかに記載の製造方法。
細胞表面に形成された被膜の厚みは、別途、基材上に被膜の形成を行い、水晶発振子マイクロバランス(QCM)測定法を用い、行った処理(ステップ)数と形成される厚みとを測定し、その結果から細胞表面への被膜形成時に行ったステップの回数に応じて算出した。QCM測定法を用いた測定は以下のように行った。QCM水晶センサをピランハ溶液で1分間洗浄してから、0.2 mg/mlフィブロネクチン(以下、「FN」ともいう)のTris-HCl(pH=7.4)溶液に37℃で1分間浸漬し、Tris-HCl(pH=7.4)溶液で洗浄して風乾した後、振動数シフトを測定した(ステップ1)。ついで0.2 mg/mlゼラチン(以下、「G」ともいう)のTris-HCl(pH=7.4)溶液に37℃で1分間浸漬し、Tris-HCl(pH=7.4)溶液で洗浄して風乾した後、振動数シフトを測定した(ステップ2)。このステップ1及び2を交互に繰り返すことによりQCM水晶センサに被膜を形成すると共に、振動数シフトの測定を行った。得られた振動数シフトに基づき、ステップの回数とそれにより形成される被膜の厚みとを得た。
[被覆細胞の作製]
ヒト線維芽細胞(正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)、Cambrex社製)を1×106cell/mlの濃度で0.2mg/mlのフィブロネクチンを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った(FN浸漬操作)。ついで、上澄みを除き、50 mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を加え、細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った(洗浄操作)。上澄みを除き、0.2mg/mlのゼラチンを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら、1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行い(G浸漬操作)、ついで洗浄操作を行った。そして、FN浸漬操作、洗浄操作、G浸漬操作、及び洗浄操作をこの順番で行った。FN浸漬操作及びG浸漬操作は洗浄操作とそれぞれセットで1ステップとし、最終的に、FN浸漬操作を5回、G浸漬操作を4回、計9ステップ行うことによってNHDF被覆細胞を作製した(コーティング層の厚み:6nm)。
まず、24ウェル培養プレートに配置したトランスウェル(コーニング社製;ポアサイズ:0.4μm、表面積:0.33cm2)のメンブレンフィルタ上に、5×105個のNHDF被覆細胞と5×104個のMoDC被覆細胞を混合して播種し、10重量%ウシ胎仔血清を含むEagle's MEM培地を添加して37℃で1日培養した。これにより樹状細胞を含み、NHDFが6層積層された真皮組織層(厚み:30μm)が得られた。
第1の三次元培養層上に、MoDC被覆細胞5×104個とHUVEC被覆細胞5×104個とをそれぞれ播種した以外は、実施例1と同様にして人工皮膚モデルを作製した。すなわち、まず2.5×105個のNHDF被覆細胞を播種し、20%FBS含有DMEMを添加して1日培養して第1の三次元培養層(NHDF:3層)を形成後、その上にMoDC被覆細胞5×104個とHUVEC被覆細胞5×104個と播種し、20%FBS含有DMEMを添加して1日培養後、2.5×105個のNHDF被覆細胞を播種することによって真皮組織層を作製し、上記と同様の手順で基底層及び表皮層を形成した。なお、HUVEC被覆細胞は、NHDFに変えてヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いた以外は、実施例1の被覆細胞の作製と同様の手順で作製した。
[免疫応答評価]
実施例1と同様に樹状細胞を含む真皮組織層を作製した。作製した真皮組織層の培地を10%FBS含有DMEMに変更した(インサート内:30μl、インサート外:1ml)。インサート内にはリポ多糖(LPS、sigma製)を添加し、24時間インキュベート後、インサート外の培地を全て回収し、Enzyme-Linked ImmunoAorbent Assay(ELISA (R&D,D6056))によってインターロイキン(IL)-6を定量した。リポ多糖の濃度は、0、1、10、100又は1000ng/mとした。その結果を図3に示す。
[皮膚モデルの作製]
まず、実施例1と同様にして作製した真皮組織層を、コラーゲンIV/50mM Tris HCl溶液(pH7.4)に20分間浸漬し、真皮組織層にコラーゲンIVをコートした。KCを1.8×105個播種し接着培地で2日間培養後、角化培地(重層化培地)で7日間気液界面にさらすことにより分化誘導を行い、人工皮膚モデルを作製した。
NHDF被覆細胞を播種し培養してNHDFを4層積層した後、その上にヒト皮膚微小血管内皮細胞(NHDMEC)被覆細胞を播種し培養してNHDMECを1層積層した。ついでその上にNHDF被覆細胞を播種し培養してNHDFを4層積層し、2.3mlの10%FBS含有DMEMで3日間培養した後、MoDCを5.0×104個播種し、2.3mlの10%FBS含有DMEMで1日間培養した。これにより、真皮組織層を形成した。得られた真皮組織層が配置されたインサート内にLPSを1μg/ml添加し、共焦点レーザー顕微鏡で30時間観察を行った。
Claims (7)
- 細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された線維芽細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された樹状細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆されたリンパ管内皮細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された血管内皮細胞とを混合して播種した後、前記被覆された線維芽細胞と、前記被覆された樹状細胞と、前記被覆されたリンパ管内皮細胞と、前記被覆された血管内皮細胞とを共培養することによって真皮組織層を形成すること、
前記真皮組織層上にIV型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にIV型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含む、
人工皮膚組織の製造方法。 - 前記被覆された樹状細胞と前記被覆された線維芽細胞との比率は、1:99〜50:50である、請求項1記載の製造方法。
- 細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された線維芽細胞を培養し、前記線維芽細胞が積層された細胞層を形成すること、
前記細胞層上に、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された血管内皮細胞及び細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆されたリンパ管内皮細胞を配置すること、
前記細胞層上に配置した前記細胞の上に、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された線維芽細胞を三次元に積層して配置すること、
前記線維芽細胞の細胞層で、前記血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞を挟んだ状態で培養して、真皮組織層を形成すること、
前記真皮組織層上にIV型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にIV型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、
さらに、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された樹状細胞を、前記血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞とともに前記細胞層上に配置するか、又は、前記真皮組織層上に配置することを含む、
人工皮膚組織の製造方法。 - 前記基底層の形成は、前記真皮組織層上にIV型コラーゲン層とラミニン層とが交互に形成されるように、前記真皮組織層にIV型コラーゲン又はラミニンを接触させることを含む、請求項1から3のいずれかに記載の製造方法。
- 請求項1から4のいずれかに記載の製造方法により製造される人工皮膚組織であって、
細胞外マトリックス成分と前記細胞外マトリックス成分を介して積層された細胞と、樹状細胞と、リンパ管内皮細胞と、血管内皮細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたIV型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層が、前記リンパ管内皮細胞で形成されたリンパ管網と前記血管内皮細胞で形成された血管網とを含む、人工皮膚組織。 - 前記基底層は、さらに、ラミニンを含む、請求項5に記載の人工皮膚組織。
- 前記表皮層において、隣接する表皮細胞間にタイトジャンクションが形成されている、請求項5又は6に記載の人工皮膚組織。
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