JP5458259B2 - 細胞積層体 - Google Patents
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Description
好ましくは、第一の細胞層が線維芽細胞を含む。
好ましくは、第一の細胞層が、線維芽細胞を含有する生体親和性高分子からなる。
好ましくは、第一の細胞層が、線維芽細胞を含有するコラーゲンゲルである。
好ましくは、第二の細胞層が表皮角化細胞を含む。
好ましくは、酵素処理されていないIV型コラーゲンが、レンズカプセルから酵素を使用することなく抽出され、かつ還元条件下においてSDS-PAGEで測定した最低分子量が160〜180kDaであることを特徴とするレンズカプセル由来IV型コラーゲンである。
本発明によればさらに、上記した本発明の細胞積層体に被験物質を接触させることを含む、被験物質の試験方法が提供される。
本発明の細胞積層体においては、第一の細胞層、酵素処理されていないIV型コラーゲンからなる層、及び第二の細胞層がこの順番で積層されている。
本発明における第一の細胞層は、第二の細胞層に含まれる細胞(例えば、表皮角化細胞など)の培養や分化に好適な皮膚の真皮層に相当する細胞層であり、例えば、線維芽細胞を含む細胞層を使用することができる。第一の細胞層としては、線維芽細胞などの細胞を生体親和性高分子(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、コンドロイチン硫酸など)に播種又は内封したものを使用することができる。例えば、線維芽細胞とコラーゲン溶液の混合物を平板状にゲル化させたものを、第一の細胞層として用いることができる。このようなコラーゲンゲルの好ましい例としては、コラーゲン溶液に1×104〜106細胞/mlの線維芽細胞を混合し、適当な容器内にてゲル化し、細胞の作用によりコラーゲンゲルが平板状に収縮し、コラーゲン密度が20〜100mg/ml程度になるまで培養することにより得られるものを使用することができる。
本発明における第二の細胞層に含まれる細胞の種類は特に限定されないが、好ましくは表皮角化細胞である。第二の細胞層に表皮角化細胞が含まれる場合、第二の細胞層には、表皮角化細胞以外の細胞を含めてもよいし、含めなくてもよい。第二の細胞(好ましくは、表皮角化細胞)は、好ましくは、0.5〜20×105 細胞/cm2 の密度で播種することができる。
本発明では、酵素処理されていないIV型コラーゲンを用いる。本発明で用いる酵素処理されていないIV型コラーゲンの由来は特には限定されないが、好ましくはレンズカプセル由来である。好ましくは、酵素処理されていないIV型コラーゲンが、レンズカプセルから酵素を使用することなく抽出され、かつ還元条件下においてSDS-PAGEで測定した最低分子量が160〜180kDaであることを特徴とするレンズカプセル由来IV型コラーゲンである。
本発明の細胞積層体は、第一の細胞層に、酵素処理されていないIV型コラーゲンを積層してIV型コラーゲン層を形成し、次いで、上記のIV型コラーゲン層に、第二の細胞層を積層することによって製造することができる。より詳細には、本発明の細胞積層体は、例えば、以下の手順で製造することができる。先ず、線維芽細胞を含むコラーゲン溶液をゲル化して、線維芽細胞を含有するコラーゲンゲルを作成する。次に、上記コラーゲンゲルの上に、酵素処理されていないIV型コラーゲンを含む液をのせてインキュベートすることにより、線維芽細胞を含有するコラーゲンゲルの上に酵素処理されていないIV型コラーゲンを沈着させる。さらに、その上に、表皮角化細胞をのせて、適当な培地中で適当な培養条件下(例えば、37℃でCO2存在下)で培養することによって、表皮角化細胞を含む層を形成させることによって、本発明の細胞積層体を製造することができる。
本発明の細胞積層体は、生体移植材料として使用することができる。即ち、医療目的として、本発明の細胞積層体は疾患部位へ移植することができる。本発明の細胞積層体を疾患部位に移植し、該部位に生着した後、血管への進入、細胞増殖、真皮再構築などが起こり、自己組織化していくことができる。この場合、移植される本発明の細胞積層体は、構造や機能が不完全であっても、いったん生着すれば生体内の因子の作用により自己組織化され、治療の目的を達成することができる。
(1)三次元培養皮膚モデル作製
アプロチニン溶液:
アプロチニン約10 mgにmilliQ水 1 mlを加え、フィルター滅菌した。エッペンチューブに分注し−30℃で保存した。使用時にはアプロチニン溶液を皮膚モデル用培地に培地量の1/1000量添加して使用した。
CaCl2・2H2O 294.04 mg/milliQ水 1 mlとし、ボルテクスにかけ攪拌し、フィルター滅菌した。エッペンチューブに分注し−30℃で保存した。
正常ヒト新生児包皮線維芽細胞(以下、hFと略記)用培地10% FBS-DMEMとhEGFのみ添加していない正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞(以下、hEKと略記)用培地を1:1で混合した。この培地500 mlに対してCaCl2溶液を225 μl(培地中最終カルシウム濃度1.8 mM)を添加した。この培地を50 mlファルコンチューブに分注し、AA2G(アスコルビン酸2-グルコシド)を培地量の1/1000量添加して使用した。
(A)真皮モデルコラーゲンゲル作製
以下の材料でhF 100×104cells、コラーゲン10 mgを含む10 mlのコラーゲンゲル溶液を60 mmのdishに分注し37℃・CO2インキュベーター中で培養した。培養2〜3日で直径1.5 cm程度まで収縮した真皮モデルとなった。
コラーゲンゲル作製の3日後、収縮コラーゲンゲル(真皮モデル)をステンレスメッシュにのせ、それを 6 wellシャーレに移した。ゲルにガラスリング(内径12mm)をのせ、以下の溶液(400μl)をリング中に分注し、リングの外側にゲルが浸るようにhF用培地を加えた。37℃・CO2インキュベーター中で24時間培養し、真皮モデル表面にIV型コラーゲンを沈着させた。
(ii)酵素処理されていない豚IV型コラーゲン:100 μg/ml 豚IV型コラーゲン(in DMEM)(特開2007−261966号公報の実施例1に記載の方法で製造したもの;還元条件下においてSDS-PAGEで測定した最低分子量は160〜180kDaである
(iii)ペプシンで処理したIV型コラーゲン:100 μg/mlのペプシンで処理したウシIV型コラーゲン(DMEM中)(新田ゼラチン株式会社)
(2)レンズに付着する硝子体などの不溶部位をハサミなどで出来る限り取り除く。
(3)冷PBS(phosphate buffered saline)50mlにコンプリート プロテアーゼインヒビターカクテル1錠(ロシュ社)を加え溶解後、レンズカプセルを入れ、2時間攪拌する。
(4)遠心分離(2000g、10分、4℃)し、上清に存在する不要部位を除去する。
(5)沈殿をコンプリート プロテアーゼインヒビターカクテル半錠(ロシュ社)を溶解した0.5M酢酸25mlに懸濁する。
(6)ホモジナイザー(IKA)を用いて細かく破砕する。
(7)細かく破砕したレンズカプセルを3日間攪拌し、IV型コラーゲンの抽出をおこなう。
(8)遠心分離(2000g、10分、4℃)し、上清(酢酸可溶性コラーゲン)と沈殿を分離する。
(9)この攪拌による抽出と遠心分離をもう一度繰り返す。
(10)遠心分離により得られた上清に終濃度1.7M になるように乳鉢で可能な限り結晶をすり潰した NaCl を添加する。
(11)一晩攪拌しコラーゲンを沈殿させる。
(12)遠心分離(5000g、30分、4℃)し、沈殿物を回収する。
(13)沈殿物に0.5M酢酸を加え、十分に溶解する。
(14)コラーゲン酸性水溶液を透析チューブ(三光純薬)に入れ、0.5M酢酸を用いて透析をおこなう。
(15)さらに、2mM塩酸で透析をおこなう。
(16)透析後のコラーゲン溶液を回収し、精製IV型コラーゲン溶液を得る。
hEKを回収し、hEK 40×104cells/皮膚モデル用培地0.4 mlとなるように細胞分散液を調製した。コラーゲンゲルのリング外側の培地とリング内の液を吸引し、hEK40×104cells/皮膚モデル用培地0.4 ml/コラーゲンゲル1枚となるように、細胞分散液を添加し、リングから外に細胞分散液が漏れていないかどうか確認した。各wellのリング外側にAA2Gを添加した皮膚モデル用培地を3 mlずつ添加し、hEKがリングの外に流れ出ないように静かに移動させ、37℃のCO2インキュベーター中で培養した。
材料
Zambobni固定液:
200 ml三角フラスコに蒸留水 70 ml、パラホルムアルデヒド 4 gを入れ、60〜70℃まで加熱し。1N NaOHを2,3滴入れ、振り混ぜて溶かした。溶解後、すぐに冷却し、0.5 M リン酸緩衝液(pH7.2)20 mlを加え、蒸留水で全量を100 mlとし、4% パラホルム/0.1 M リン酸緩衝液(pH7.2)を作製した。ここに0.2%ピクリン酸を溶解した。
皮膚モデルの固定・回収はZamboni固定液を用い、固定液やシャーレは氷上に置いて作製した。well中の培地を吸引除去し、PBSに2分程度浸して洗浄する。2回洗浄を繰り返し、Zamboni固定液に2分程度浸して洗浄する。Zamboni固定液で2回洗浄した後、Zamboni固定液を分注したサンプルビンにサンプルを入れ、4℃で保存した。
(3−1)パラフィン切片作製
Zamboni固定皮膚モデルを0.1Mリン酸緩衝液に浸し、数回液を交換して固定液を置換した。剃刀で皮膚モデルを短冊状に切断し、パラフィン包埋し、ミクロトームで4 μmに薄切し、スライドグラスに貼って45℃で乾燥させた。室温で保存した。
材料
・OCT
・ガムシュークロース液
300 ml三角フラスコにmilliQ 140 mlを入れ、アラビアゴム 2.5 mgを入れ、ホットスターラ―で攪拌して完全に溶解した。常温でスクロース 75 gを加えて溶解した。0.5 Mリン酸緩衝液を加えて攪拌し、全量を250 mlとして攪拌した。これを濾紙と漏斗を用いて濾過し、4℃で保存した。
短冊状に切断したサンプルを0.1 Mリン酸緩衝液で一晩洗浄した。4℃でガムシュークロースに一晩浸し、さらにガムシュークロース:OCT=1:1の混合液に一晩浸した。OCTで包埋し、Cryostatで10μmに薄切し、スライドグラスに貼って−25℃で保存した。
パラフィン切片をキシレンによって脱パラフィン処理した後、100%から70%のエタノールに順に浸して置換した。蒸留水で洗浄した後ヘマトキシリン染色液に5分間浸し、流水で洗浄した。その後、0.2% HClアルコールに1秒浸し、流水で10分間洗浄した。さらにエオジン染色液に10分浸して、95%〜100%のアルコールで脱水し、キシレンに2〜3分浸漬する。封入剤をのせたプレパラートをのせ、乾燥させて封入した。
上記のHE染色の結果を図2から図4に示す。今回の実験では、コントロールで、皮膚モデルの周縁部分は表皮層が厚く重層化していたが、のせたリング内にあたる中央部分では表皮層が周辺部に比べ薄かった。それに対し、ブタIV型コラーゲンを沈着させた皮膚モデルでは、表皮層の厚さが一様であり、中央部分でも周縁部分でもコントロールより厚く重層していた。基底層の細胞はコントロールと比べ、縦に長い形状のものが多いように観察された。また、扁平な細胞層に核が染色されている細胞がまばらに存在しており、不完全角化が見られた。ペプシン抽出したIV型コラーゲンを沈着させた皮膚モデルでは、コントロールと同様に中央部分の表皮層が薄く、周縁部分の表皮層が厚かった。角層の染色が確認されなかった。
Claims (5)
- 第一の細胞層、酵素処理されていないIV型コラーゲンからなる層、及び第二の細胞層がこの順番で積層されている細胞積層体であって、
第一の細胞層が、繊維芽細胞を含有するコラーゲンゲルであり、第二の細胞層が表皮角化細胞である、バイオアッセイ系として使用するための細胞積層体。 - 酵素処理されていないIV型コラーゲンがレンズカプセル由来である、請求項1に記載の細胞積層体。
- 酵素処理されていないIV型コラーゲンが、レンズカプセルから酵素を使用することなく抽出され、かつ還元条件下においてSDS-PAGEで測定した最低分子量が160〜180kDaであるレンズカプセル由来IV型コラーゲンである、請求項1又は2に記載の細胞積層体。
- 第一の細胞層に、酵素処理されていないIV型コラーゲンを積層してIV型コラーゲン層を形成し、次いで、上記のIV型コラーゲン層に、第二の細胞層を積層することを含み、第一の細胞層が繊維芽細胞を含有するコラーゲンゲルであり、第二の細胞層が表皮角化細胞である、請求項1から3の何れか1項に記載の細胞積層体の製造方法。
- 請求項1から3の何れか1項に記載の細胞積層体に被験物質を接触させることを含む、被験物質の試験方法。
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