JP2017112998A - 細胞積層体、生体移植材料、表皮の分化状態の評価方法及び細胞積層体の製造方法、並びにインスリン様成長因子−1産生促進剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】第一の細胞層、及び第二の細胞層がこの順番で積層されている細胞積層体であって、第一の細胞層が、少なくとも非不死化間葉系幹細胞とコラーゲンゲルとを含み、第二の細胞層が少なくとも表皮角化細胞を含む、細胞積層体。
【選択図】なし
Description
非特許文献1においては、不死化していない骨髄由来ストローマ細胞と角化細胞とを共培養した皮膚再構成モデルが記載されている。
特許文献2には、前駆脂肪細胞として、間葉系幹細胞を導入した3次元積層体が記載されている。特許文献2では、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)遺伝子、ヒトパピローマウイルス(HPV)E6、E7遺伝子を導入することで不死化した間葉系幹細胞UE6E7T-3株が用いられているが、不死化することで実際の生体から取り出した間葉系幹細胞と分泌するサイトカインが異なり、表皮細胞の分化が不十分である。また、脂肪に分化させている時点で幹細胞としての能力は失われている。さらに、表皮細胞も不死化しているHaCaT株又はPam212株であり、表皮細胞の4層構造、特に顆粒層分化は見られないという問題がある。
(1) 第一の細胞層、及び第二の細胞層がこの順番で積層されている細胞積層体であって、第一の細胞層が、少なくとも非不死化間葉系幹細胞とコラーゲンゲルとを含み、第二の細胞層が少なくとも表皮角化細胞を含む、細胞積層体。
(2) 第二の細胞層が、分化後に4層構造を有している、(1)に記載の細胞積層体。(3) 第一の細胞層の全細胞中の非不死化間葉系幹細胞の割合が10%以上であり、収縮後の表面積1cm2あたりの、第一の細胞層の全細胞の細胞数が1×105細胞以上であり、コラーゲンゲルを形成する際に使用するコラーゲン溶液のコラーゲン濃度が0.1mg/ml以上である、(1)又は(2)に記載の細胞積層体。
(4) 非不死化間葉系幹細胞が、非不死化骨髄由来間葉系幹細胞である、(1)から(3)の何れか一に記載の細胞積層体。
(6) (1)から(4)の何れか一に記載の細胞積層体の表皮角化細胞の分化状態を評価することを含む、表皮の分化状態の評価方法。
(7) 表皮角化細胞におけるロリクリン、フィラグリン、及びカスパーゼ14から選ばれる少なくとも一種の発現状態を評価することを含む、(6)に記載の評価方法。
(8) (1)から(4)の何れか一に記載の細胞積層体に被験物質を接触させ、細胞分化に対する被験物質の影響を評価する、(6)又は(7)に記載の評価方法。
(10) 非不死化間葉系幹細胞が、ヒト由来の10継代以下の細胞である、(9)に記載の方法。
(11) 非不死化間葉系幹細胞とコラーゲンゲルとを浮遊培養することにより、第一の細胞層を形成する、(9)又は(10)に記載の方法。
(12) 第一の細胞層の上に播種される表皮角化細胞が、5継代以下の非不死化細胞である、(9)から(11)の何れか一に記載の方法。
(13) 上記気液界面培養による培養日数が、10日以上である、(9)から(12)の何れか一に記載の方法。
(14) 非不死化間葉系幹細胞が、非不死化骨髄由来間葉系幹細胞である、(9)から(13)の何れか一に記載の方法。
(15) ボスウェリアセラタエキスのエタノール抽出物を含有する、間葉系幹細胞用インスリン様成長因子−1産生促進剤。
(16) さらにアスタキサンチンを含有する、(15)に記載の間葉系幹細胞用インスリン様成長因子−1産生促進剤。
[細胞積層体]
本発明の細胞積層体は、第一の細胞層、及び第二の細胞層がこの順番で積層されている細胞積層体であって、第一の細胞層が、少なくとも非不死化間葉系幹細胞とコラーゲンゲルとを含み、第二の細胞層が少なくとも表皮角化細胞を含む、細胞積層体である。
第一の細胞層は、少なくとも非不死化間葉系幹細胞とコラーゲンゲルとを含む。第一の細胞層は、非不死化間葉系幹細胞を含むコラーゲンゲルにより構成されていてもよいし、コラーゲンゲルを含む領域と非不死化間葉系幹細胞を含む領域とが別々に形成されていてもよいが、好ましくは第一の細胞層は、非不死化間葉系幹細胞を含むコラーゲンゲルにより構成されている。なお、コラーゲンゲルを含む領域と非不死化間葉系幹細胞を含む領域とが別々に形成される場合、コラーゲンゲルを固めた後、ゲル上に細胞を播種させることができる。
要件1:通常の培養条件でプラスチックの培養皿に付着する。
要件2:細胞表面マーカのうちCD105,CD73,及びCD90が陽性であり、CD45,CD34,CD14,CD11b,CD19,及びHLA-DRが陰性である。CDはcluster of differentiationの略称である。HLAはヒト白血球型抗原を意味する。
要件3:in vitroにおいて骨、軟骨、分化に分化すること。
本発明で用いる間葉系幹細胞が、非不死化細胞であるか否かは、間葉系幹細胞を所定の回数だけ分裂した後も増殖できるか否かを判別するか、又は上記したような不死化遺伝子が導入されているか否かを判別することにより判断することができる。
コラーゲンの由来は、特に限定されないが、好ましくは、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、及びラットなどを挙げることができる。
第二の細胞層は、少なくとも表皮角化細胞を含む。
表皮角化細胞は、皮膚の最外層を構成する細胞で、ケラチンを合成する様に分化した細胞である。本発明で用いる表皮角化細胞としては、哺乳動物由来の細胞が好ましい。乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類又はウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができる。哺乳動物は、好ましくは霊長類であり、より好ましくはヒトである。
第二の細胞層が、表皮角化細胞以外の細胞を含む場合、表皮角化細胞と、表皮角化細胞以外の細胞との細胞数の比率は特に限定されないが、第二の細胞層の細胞数全体に対して、表皮角化細胞以外の細胞の割合が、好ましくは20%以下であり、より好ましくは15%以下であり、さらに好ましくは10%以下である。
有棘層:通常数層からなる層で、この層は下層側では多角形であるが、上層に向かうに従い扁平な形状を取る。核は円形で、光学顕微鏡下では棘のように見える細胞間橋が見られる。
顆粒層:2−3層からなる。顆粒層では細胞は核も含めて更に扁平になる。HE染色では顆粒層特異的なプロフィラグリンに富むケアトヒアリン顆粒が染色され、顆粒状に観察できる角層:約10層程度からなる、死んで膜状になった角化細胞である。構造は扁平で、細胞自体の形態又は核などは消失し、HE染色では単色の層状構造として観察される。
本発明によればさらに、上記した本発明の細胞積層体からなる、生体移植材料が提供される。
本発明の細胞積層体は、生体移植材料として使用することができる。即ち、医療目的として、本発明の細胞積層体は疾患部位へ移植することができる。本発明の細胞積層体を疾患部位に移植し、上記疾患部位に生着した後、血管への進入、細胞増殖、真皮再構築などが起こり、自己組織化していくことができる。この場合、移植される本発明の細胞積層体は、構造又は機能が不完全であっても、いったん生着すれば生体内の因子の作用により自己組織化され、治療の目的を達成することができる。
本発明の細胞積層体においては、第二の細胞層が十分に分化していることから、細胞積層体の表皮角化細胞の分化状態を評価することによって、生体に近い皮膚モデルとして使用することができる。
本発明によればさらに、少なくとも非不死化間葉系幹細胞とコラーゲンゲルとを含む第一の細胞層を形成する工程、上記第一の細胞層の上に表皮角化細胞を播種する工程、並びに上記第一の細胞層及び表皮角化細胞を気液界面培養により培養する工程を含む、本発明の細胞積層体の製造方法が提供される。
上記製造方法における、「非不死化間葉系幹細胞」、「コラーゲンゲル」、「第一の細胞層」、及び「表皮角化細胞」の説明は、本明細書中上記した通りである。
培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF)を添加していないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、汎用の培地(E−MEM(Minimum Essential Media)、RPMI−1640、MEMα、HamF12など)、並びに上記培地を混合した培地などを使用することができる。
血清としては、ウシ胎児血清(FBS)、などを使用することができ、血清の添加量は培地全量に対して一般的には5容量%〜20容量%で使用することができる。
防腐剤としては、細胞の増殖分化に影響を与えない防腐剤を用いることができる。例えば、防腐剤として抗生物質が好ましく、アンホテリシンB、カナマイシン、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン等が挙げられる。
培地のpHは、培養する細胞により異なるが、好ましくはpH6.8〜7.6であり、より好ましくはpH7.0〜7.4である。
その後、表皮角化細胞の層にかかる培地を除去し、気相に晒すことによって、表皮角化細胞を含む層を分化形成させることによって、本発明の細胞積層体を製造することができる。
本発明の間葉系幹細胞用IGF-1産生促進剤は、ボスウェリアセラタエキスのエタノール抽出物を含む。ボスウェリアセラタはカンラン科ボスウェリア属の植物で古くから生薬等で利用されており、例えば、特開2011−236156号公報0012〜0016段落記載のものが挙げられる。詳細な理由は定かではないが、本発明者らは、ボスウェリアセラタエキスのエタノール抽出物に含まれる、疎水物質のβ-ボスウェリン酸が有効成分として作用していると考えている。本発明者らの検討によると、一般的に利用されるボスウェリアセラタエキスの水蒸気蒸留物には上述のようなIGF-1の産生を促進する効果は見いだせなかった。一方、本開示の間葉系幹細胞用IGF-1産生促進剤に適用されるボスウェリアセラタエキスはエタノール抽出物であるため、疎水性物質であるβ―ボスウェリン酸が水蒸気蒸留物よりも多く含有されていると考えられる。間葉系幹細胞用IGF-1産生促進剤は、粉末換算で3-O-アセチル−11-ケト−β-ボスウェリン酸を粉末として10%以上の原料を利用することが好ましい。
本発明の間葉系幹細胞用IGFBP-7産生抑制剤は、アスタキサンチンを含む。アスタキサンチンとしては、例えば、特開2016−084321号公報0018〜0022段落記載のものが挙げられる。詳細な理由は定かではないが、本発明者らは、既述の間葉系幹細胞用IGF-1産出促進剤と相俟って、第ニの細胞の分化をさらに高めることができると考えている。
(1−1) 材料
CaCl2溶液:
CaCl2・2H2O 294.04mg/milliQ(登録商標)水1mlの溶液を調製し、上記溶液をボルテックスにかけて攪拌し、フィルター滅菌した。得られた溶液をマイクロチューブに分注し、−30℃で保存した。
正常ヒト新生児包皮線維芽細胞(以下、hFと略記)用培地である10%ウシ胎児血清(FBS)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と、正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞(以下、hEKと略記)用培地とを1:1(容量比)で混合した。上記で得られた培地500mlに対してCaCl2溶液225μl(培地中最終カルシウム濃度1.8
mmol/L)を添加した。上記で得られた培地を50mlファルコン(登録商標)チューブに分注し、アスコルビン酸2−グルコシドを培地量の1/1000量添加して得られた培地を、細胞積層体用培地として使用した。
(A)間葉系幹細胞を含むコラーゲンゲルの作製
コラーゲンとしては、酸可溶化I型コラーゲン(ウシ由来)を使用した。
下記表に記載の量の骨髄由来間葉系幹(MSC)細胞(継代数は4)と1型コラーゲン溶液、アスコルビン酸、防腐剤等の添加物を含む合計5mlの溶液を6ウエルシャーレに分注し、37℃のCO2インキュベーター中で培養した。細胞は、静置もしくは5〜60rpm(1s-1=60rpmである)の速度で撹拌しながら培養した。2〜3日間の培養後に、表皮を播種するための面が直径1.0cm程度まで収縮した、間葉系幹細胞を含むコラーゲンゲルが得られた。ゲル化を以下の基準で評価した結果を下記表に示す。
A:静置することで収縮が直径1.0cm程度まで進む
B:振盪培養することで収縮が直径1.0cm程度まで進む。
コラーゲン濃度を1mg/mLとし、線維芽細胞0.5×106cellsを用いて、上記(A)
と同様にして、線維芽細胞のみを含むコラーゲンゲルを作製した。
コラーゲン濃度を1mg/mLとし、骨髄由来MSC0.5×106cells(継代数は4)を用いて、上記(A)と同様にして、間葉系幹細胞のみを含むコラーゲンゲルを作製した。
コラーゲン濃度を1mg/mLとし、線維芽細胞と間葉系幹細胞(継代数は4)との細胞数の比率を、後記の表3の通りにして、上記(A)と同様にして、線維芽細胞及び/又は間葉系幹細胞を含むコラーゲンゲルを作製した。なお、線維芽細胞と間葉系幹細胞の細胞数の合計は、0.5×106cellsである。
ヒト由来の表皮ケラチノサイトを低カルシウム(カルシウム濃度200μM以下)培地で継代培養することにより、hEK(継代数は4)を回収し、hEK20×104cells/細胞積層体用培地0.2mlとなるように細胞分散液を調製した。上記(B)又は(C)で作製した間葉系幹細胞を含むコラーゲンゲルにリング(内径7mm)を置いた。リング外側の培地とリング内の液とを吸引し、hEK40×104cells/細胞積層体用培地0.4ml/コラーゲンゲル1枚となるように、細胞分散液をリング内に添加し、リングから外に細胞分散液が漏れていないかどうかを確認した。各ウエルのリング外側にアスコルビン酸2−グルコシドを添加した細胞積層体用培地を3mlずつ添加し、hEKがリングの外に流れ出ないように静かに移動させ、37℃のCO2インキュベーター中で培養を行った。
上記した三次元培養した細胞積層体の作製の概要を図1に示す。
上記(1)で作製した積層体を、中性緩衝の4%パラホルムアルデヒド・りん緩衝液(パラホルムアルデヒド20g、0.1mol/lりん酸緩衝液(pH7.4)500mL)(和光純薬)を用いて固定した。
(3−1)パラフィン切片の作製
4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で固定した細胞積層体を、0.1mol/Lリン酸緩衝液に浸し、固定成分を含まない0.1mol/Lリン酸緩衝液を用いて数回洗浄し、固定液を置換した。細胞積層体を剃刀を用いて短冊状に切断し、切断した細胞積層体をパラフィン包埋し、ミクロトームを用いて4μmに薄切し、スライドグラスに貼って45℃で乾燥させた。上記で得られた細胞積層体のパラフィン切片は室温で保存した。
上記のパラフィン切片をキシレンによって脱パラフィン処理した後、100%から70%(V/V)のエタノールに順に浸した。得られたサンプルは蒸留水で洗浄した後、ヘマトキシリン染色液(Mayer's Hematoxylin Solution、和光純薬工業)に5分間浸し、流水で洗浄した。その後、サンプルを0.2%HClエタノールに1秒浸し、流水で10分間洗浄した。その後、サンプルをエオシン染色液(1% EosinY Solution、和光純薬工業)に10分浸して、95%〜100%のエタノールで脱水し、キシレンに2〜3分浸漬した。得られたサンプルを、封入剤をのせたプレパラートをのせ、乾燥させて封入した。
上記(B)において作製した線維芽細胞のみを含むコラーゲンゲル又は骨髄由来間葉系幹細胞のみを含むコラーゲンゲルに対して、表皮(hEK)を重層させた細胞積層体のヘマトキシリン・エオシン(HE)染色象を図2に示す。線維芽細胞のみ(線維芽細胞100%)の場合には、表皮層の核(濃紫色)の様子が均一で層状の分化が不十分であった。一方、骨髄由来間葉系幹細胞のみ(骨髄由来MSC100%)の場合には、下から基底層に核があり、上に連れて分化が進み消失していき、角層手前に顆粒層と呼ばれる特徴的な構造が見られる。
上記(B)において作製した骨髄由来間葉系幹細胞のみを含むコラーゲンゲルに対して、表皮(hEK)を重層させた細胞積層体(比較例)の気液培養から9日、11日、14日目のHE染色象を図5に示す。11日目以降では層構造の形成が認められ、十分に分化しており、アッセイ系として利用可能であった。
上記(B)において作製した線維芽細胞のみを含むコラーゲンゲル又は間葉系幹細胞のみを含むコラーゲンゲルに対して、表皮(hEK)を重層させた細胞積層体を用いて、フィラグリンの発現状態を調べた。
非不死化間葉系幹細胞を含む第一の細胞層が第二の細胞層の分化促進する成分探索を実施した。市販のサイトカインエライザにて試験し、比較例及び例13の積層体作製時の培地を11日目、14日目に回収し上清中に分泌された、インスリン様成長因子(IGF-1)の量を比較した。
測定方法としては、回収した上清を1000g×5分、室温で遠心し不純物を取り除いた後に、IGF-1)の量をELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)で測定した。測定の結果を表4及び図7に示す。表4及び図7において、HDFは線維芽細胞を示し、MSCは間葉系幹細胞を示す。
非不死化ケラチノサイトを低カルシウム培地にて96Wellプレート(コーニング社)品に8000cels/wellで播種し、組み換えIGF-1(R&D社)をPBSにて希釈し、終濃度1ng/ml,10ng/mlになるように添加した。比較はPBSのみを添加した。さらに、IGF-1の機能を抑制することが知られているインスリン様成長因子結合タンパク質7型(IGFBP7)を終濃度10000ng/ml を添加した状態で72時間後にWST−8試薬(Dojindo社)のプロトコルに従い細胞数を吸光度で比較した。吸光度は、細胞数と比例する。WST−8試薬(Dojindo社)のプロトコルに従い細胞数を吸光度で比較した。吸光度は、細胞数と比例する。測定結果を表5に示す。
非不死化ケラチノサイトを低カルシウム培地にて6Wellプレート(コーニング社)品に300,000cels/wellで播種し、組み換えIGF-1(R&D社)をPBSにて希釈し、終濃度10ng/mlになるように添加した。陰性対照はPBSのみを添加した。陽性対照は分化を促進することが知られている塩化カルシウムを終濃度1.8mM になるように添加した。72時間後にLysis Bufferで回収し、各レーンにつき20μgのタンパク質をSDS(Sodium dodecyl sulfate)−ポリアクリルアミドゲルに展開した後、タンパク質をPVDF膜に転写した。転写後のPVDF(ポリフッ化ビニリデン)膜は、ブロッキング剤(Blocking One、ナカライテスク株式会社)で1時間処理することによりブロッキングを行った後、Tween20を0.1%含むPBS(以下T-PBS)で洗浄した。次いで、抗ロリクリンウサギモノクローナル抗体(Abcam社)を1000倍希釈した溶液を添加して、4℃で終夜反応させた。また、内部標準として、抗β−アクチンマウスモノクローナル抗体(Sigma-Aldrich社)を20000倍希釈した溶液を添加して、室温で1時間反応させた。T−PBSで3回洗浄した後、それぞれ2次抗体に反応させた。ロリクリンのバンドの濃さを画像解析し、β−アクチンのバンドの濃さにて補正した。結果を表6及び図8に示す。
mRNAレベルでのスクリーニング
骨髄由来間葉系幹細胞(LONZA社)を96Wellプレート(コーニング社)品に10000cels/wellで播種し、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した植物抽出エキスを終濃度10ppm(DMSO 終濃度1%)になるように添加した。16時間後に、RNAを抽出しPrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2(タカラ社)でRT-qPCR(Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)を実施した。方法は製品の標準方法にしたがって実施した。
用いたプライマーセットは下記市販セットをそれぞれ購入した。GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)は内部標準として解析し、発現量費はIGF-1/GAPDHの発現量比とした。
ヒト間葉系幹細胞を2500個/cm2の細胞密度で48ウェルプレートに播種し、間葉系幹細胞用培地中で培養した。細胞を播種した翌日に、1mmol/L 過酸化水素を添加した間葉系幹細胞用培地に培地交換し、30分間培養した。次いで、間葉系幹細胞用培地にて1回洗浄した後、各被験物質を添加した間葉系幹細胞用培地に培地交換し、培養を継続した。その間、2日〜3日毎に培地交換を行った。培養5日目に間葉系幹細胞用培地に培地交換して24時間培養した後、培地を回収した。
IGFBP−7の抑制率を算出する手順の詳細は、下記(i)〜(iv)のとおりである。
(i)各被験物質について同条件のサンプルを5つ以上(すなわち、n≧5)調製した後、回収した培地中のIGFBP−7の濃度を測定する。
(ii)上記(i)の測定結果のうち、最高値及び最低値をそれぞれ1点ずつ除き、残りのサンプル(3サンプル以上)の値を採用する。
(iii)上記(ii)で採用された各サンプルのIGFBP−7の濃度を細胞増殖率の測定値で補正し、コントロールに対するIGFBP−7の抑制率を下記式に従って算出する。なお、抑制率が0%未満の場合は、IGFBP−7の分泌が促進されたこと、すなわち細胞老化が促進されたことを意味する。
IGFBP−7の抑制率(%)={(細胞増殖率による補正後のコントロールの値)−(細胞増殖率による補正後のサンプルの値)}/(細胞増殖率による補正後のコントロールの値)×100
(iv)上記(i)及び(ii)を各被験物質について3回繰り返し、上記(iii)によって算出されたIGFBP−7の抑制率(3サンプル×3回以上)を算術平均する。
上記で見出した、最も効果が高いボスウェリアセラタエキスはエタノール抽出物であり活性成分であるβボスウェリン酸が配合されていることが特徴である。
しかし、ボスウェリアセラタのエタノール抽出エキスは疎水性物質であるため水溶媒に溶解せず、添加剤として配合しづらい。そこで、乳化物を作製した。下記に処方の具体例を示す。
ボスウェリアセラタエキス(ボスウェリンCG:商品名、サビンサジャパンコーポレーション株式会社) 1.0g
POE(20)フィトステロールエーテル (NIKKOL BPS-20)3.75g
1,3−ブチレングリコール(アルコール) 15.25g
レシチン(SLPホワイト:辻製油) 5.0g
グリセリン(アルコール) 45.0g
精製水 Upto100g
得られた懸濁液を、20℃以上80℃以下の温度で、100MPa以上の圧力下で分散処理することで、ボスウェリアセラタエキス分散組成物B−1を得た。動的光散乱を用いた市販の測定装置として、ナノトラックUPA(日機装株式会社)を用いて、以下のよう計測した。
分散組成物を純水で10倍に希釈し、室温(25℃)にて、測定を行う。分散媒屈折率として1.333(純水)、分散媒の粘度として純水の粘度を使用した場合の体積平均粒径として求めたところ、12.6nmであった。
下記の成分を、70℃で加熱しながら1時間溶解して、水相組成物Aを得た。
・ショ糖ステアリン酸エステル(HLB=16) 33.0g
・モノオレイン酸デカグリセリル(HLB=12) 67.0g
・グリセリン 450.0g
・純水 300.0g
・オキアミ抽出物 15.0g
・ミックストコフェロール(理研ビタミン製、理研Eオイル800) 32.0g
・中鎖脂肪酸グリセライド(花王製、ココナードMT) 93.0g
・レシチン(理研ビタミン製、レシオンP、大豆由来) 10.0g
続いて、得られた予備乳化物を約40℃まで冷却し、アルティマイザーHJP−25005(株式会社スギノマシン社)を用いて、200MPaの圧力で高圧乳化を行った。その後、平均孔径1μmのミクロフィルターでろ過して、アスタキサンチン含有乳化組成物A(アスタキサンチン含有率:0.3質量%)を調製した。
下記の成分を、70℃で加熱しながら1時間溶解して、水相組成物Bを得た。
ショ糖ステアリン酸エステル(第一工業製薬、DKエステルSS) 3.3g
モノオレイン酸デカグリセリル(理研ビタミン、ポエムJ−0381V)6.7g
グリセリン(アルコール) 45.0g
純水 30.0g
ヘマトコッカス藻抽出物(富士フイルム、ASTOTS−S、アスタキサンチン含有率:20%)3.76g
ミックストコフェロール(理研ビタミン、理研Eオイル800) 0.96g
ココナッツ油(日清オイリオグループ、O.D.O.) 8.53g
レシチン(辻製油、SLPホワイト) 1.0g
ニコチン酸トコフェロール(エーザイフード・ケミカル、日本薬局方トコフェロールニコチン酸エステル)0.75g
続いて、得られた予備乳化物を約40℃まで冷却し、スターバーストミニHJP−25001(株式会社スギノマシン)を用いて、245MPaの圧力で高圧乳化を行った。高圧乳化後、平均孔径1μmのミクロフィルターでろ過して、アスタキサンチン含有乳化組成物Bを調製した。
下記組成を有する化粧水を、常法により調製した(全量100質量%)。
〔組成〕 〔含有量(質量%)〕
ボスウェリアセラタエキス分散組成物B−1 1.0
アルブチン 2.0
グリチルリチン酸ジカリウム 1.0
ジプロピレングリコール 4.0
ポリオキシエチレンメチルグルコシド 1.0
1,3−ブチレングリコール 4.0
ポリエチレングリコール 1.0
エタノール 2.0
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(60E.O.) 0.2
フェノキシエタノール 0.3
グリセリンモノ−2−エチルヘキシルエーテル 0.2
オリザノール 0.01
ポリオキシエチレンフィトステロール
(NIKKOL BPS−20:日光ケミカルズ社製) 0.03
N−アセチル−L−ヒドロキシプロリン 1.0
水溶性コラーゲン 1.0
加水分解コラーゲン 1.0
海藻エキス(1) 1.0
アスタキサンチン含有乳化組成物B 0.2
リン酸−L−アスコルビルマグネシウム 1.0
ヒアルロン酸ナトリウム 0.2
クエン酸 1.0
クエン酸ナトリウム 適量
水 残量
下記組成を有する美容液を、常法により調製した(全量100質量%)。
〔組成〕 〔含有量(質量%)〕
ボスウェリアセラタエキス分散組成物B−1 1.0
リン酸−L−アスコルビルマグネシウム 2.0
グリチルリチン酸ジカリウム 1.0
ジプロピレングリコール 4.0
グリセリン 5.0
ジグリセリン 2.0
1,2−ペンタンジオール 2.0
フェノキシエタノール 0.5
パラオキシ安息香酸メチル 0.1
アルカリネゲス レータスB−16ポリマー 0.05
オリザノール 0.01
ポリオキシエチレンフィトステロール
(NIKKOL BPS−20:日光ケミカルズ社製) 0.03
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(60E.O.) 0.2
レシチン 0.05
クエン酸 0.7
クエン酸ナトリウム 適量
N−アセチル−L−ヒドロキシプロリン 1.0
水溶性コラーゲン 1.0
加水分解コラーゲン 1.0
酵母エキス(1) 1.0
アスタキサンチン含有乳化組成物B 0.2
水 残量
また、アスタキサンチン含有乳化組成物Bについて、アスタキサンチン分散組成物Aと同一の製法に、アスタキサンチン原料をオキアミ抽出物からヘマトコッカス藻抽出物にそれぞれ変更し、アスタキサンチン含有乳化組成物Bと同じ濃度を示すアスタキサンチン含有乳化組成物を作製した。得られたアスタキサンチン含有乳化組成物、およびこれを用いた製剤は、いずれも成分の分離・析出がなかった。
下記組成を有するクリームを、常法により調製した(全量100質量%)。
〔組成〕 〔含有量(質量%)〕
ボスウェリアセラタエキス分散組成物B−1 0.01
アルブチン 2.0
グリチルリチン酸ジカリウム 1.0
リン酸−L−アスコルビルマグネシウム 0.1
1,2−ペンタンジオール 3.0
ジプロピレングリコール 7.0
濃グリセリン 5.0
ポリエチレングリコール6000[分子量:6000] 1.0
ヒアルロン酸ナトリウム 0.5
トリメチルグリシン 0.5
1,3−ブチレングリコール 3.0
キサンタンガム 0.5
アクリル酸/メタアクリル酸アルキル共重合体 0.7
スクワラン 0.5
シア脂 1.0
サラシミツロウ 1.0
ベヘニルアルコール 1.0
モノステアリン酸グリセリル 2.0
イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル 1.0
トコフェロール 0.5
アスタキサンチン 0.1
アスタキサンチン含有乳化組成物A 0.2
水溶性コラーゲン 1.0
加水分解コラーゲン溶液(魚由来) 1.0
N−アセチル−L−ヒドロキシプロリン 1.0
オリザノール 0.01
ポリオキシエチレンフィトステロール
(NIKKOL BPS−20:日光ケミカルズ社製) 0.03
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(60E.O.) 0.2
レシチン 0.1
ショ糖脂肪酸エステル 0.1
モノオレイン酸ポリグリセリル 0.1
クエン酸 0.7
クエン酸ナトリウム 適量
フェノキシエタノール 0.3
精製水 残量
下記組成を有するサンスクリーン剤を常法により調製した(全量100質量%)。
〔組成〕 〔含有量(質量%)〕
ボスウェリアセラタエキス分散組成物B−1 0.01
シクロペンタシロキサン 20.0
ジメチコン 10.0
酸化チタン 5.0
t−ブチルメトキシベンゾイルメタン 1.0
HXMT−100ZA(テイカ社、平均一次粒径15nm) 6.0
水酸化アルミニウム 1.0
イソステアリン酸 0.5
セスキオレイン酸ソルビタン 1.0
グリチルリチン酸ジカリウム 0.5
リン酸−L−アスコルビルマグネシウム 0.1
ヘマトコッカス藻抽出物 0.1
水溶性コラーゲン 1.0
クエン酸 0.7
クエン酸ナトリウム 適量
トコフェロール 0.5
オリザノール 0.01
ポリオキシエチレンフィトステロール
(NIKKOL BPS−20:日光ケミカルズ社製) 0.03
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(60E.O.) 0.2
レシチン 0.1
香料 微量
パラオキシ安息香酸メチル 0.15
精製水 残量
下記組成を有する乳液を、油相・水相それぞれを70℃に加熱し、乳化しながら攪拌することにより調製した(全量100質量%)。
〔組成〕 〔含有量(質量%)〕
≪油相成分≫
ボスウェリアセラタエキス分散組成物B−1 0.05
ヘマトコッカス藻抽出物 0.2
スクワラン 8.0
ホホバ油 7.0
セチルアルコール 1.5
≪水相成分≫
グリセリンモノステアレート 2.0
ポリオキシエチレンセチルエーテル 3.0
ポリオキシエチレンソオルビタンモノオレート 2.0
1,3−ブチレングリコール 1.0
グリセリン 2.0
ステアリン酸スクロース 0.1
オレイン酸ポリグリセリル−10 0.1
ステアリン酸ポリグリセリル−2 0.1
フェノキシエタノール 0.2
コラーゲン 1.0
オリザノール 0.01
ポリオキシエチレンフィトステロール
(NIKKOL BPS−20:日光ケミカルズ社製) 0.03
アスタキサンチン含有乳化組成物B 0.1
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(60E.O.) 0.2
レシチン 0.05
アルブチン 0.5
グリチルリチン酸ジカリウム 0.5
クエン酸 1.0
クエン酸ナトリウム 適量
香料 微量
精製水 残量
下記組成を有するジェリー様美容液を常法により調製した(全量100質量%)。
〔組成〕 〔含有量(質量%)〕
ボスウェリアセラタエキス分散組成物B−1 0.01
ヘマトコッカス藻抽出物 0.1
アスタキサンチン含有乳化組成物B 0.2
セラミドIII、VI混合物 1.0
加水分解コラーゲン 1.0
アセチルヒドロキシプロリン 1.0
エチルヘキシルグリセリン 0.1
オレイン酸 0.5
1,3−ブチレングリコール 1.0
グリセリン 2.0
スクロース 0.1
オレイン酸ポリグリセリル−10 0.1
ステアリン酸ポリグリセリル−2 0.1
フェノキシエタノール 0.2
コラーゲン 1.0
オリザノール 0.01
ポリオキシエチレンフィトステロール
(NIKKOL BPS−20:日光ケミカルズ社製) 0.03
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(60E.O.) 0.2
レシチン 0.1
クエン酸 1.0
クエン酸ナトリウム 適量
(PEG−240/デシルテトラデセス−20/HDI)コポリマー 0.3
ダマスクバラ花油 微量
香料 微量
精製水 残量
下記組成のスラリーを作製し、所定の容器に充填し、乾燥することで、固形粉末化粧料(湿式ファンデーション)を作製した(全量100質量%)。
〔組成〕 〔含有量(質量%)〕
ボスウェリアセラタエキス分散組成物B−1 0.1
タルク(OTS−2 TALK JA−46R:大東化成社製) 18
酸化チタン(OTS−2 TiO2 CR−5:大東化成社製) 9.0
酸化鉄黄色(OTS−2 YELLOW LLXLO:大東化成社製) 2.3
酸化鉄赤(OTS−2 RED R−516L:大東化成社製) 0.15
酸化鉄黒(OTS−2 BLACK BL−100:大東化成社製 0.3
パール顔料(金)(ロナフレアバランス ゴールド:メルク社製) 13
パール顔料(赤)(トランスプリズマーレッド:メルク社製) 7.0
複合粉体顔料(HNB RED7:大東化成工業社製) 1.0
ジメチコン・トリメチルシロキシシリケート(DC593:東レ・ダウコーニング社製)
3.0
ジメチコン(SH200C−20cs:東レ・ダウコーニング社製) 7.0
フェノキシエタノール 0.5
セリサイト(OTS−2 SERICITE FSE:大東化成社製) 残量
下記組成を有するリキッドファンデーション(W/O乳化物)を、常法により調製した(全量100質量%)。
〔組成〕 〔含有量(質量%)〕
グリチルリチン酸ジカリウム 0.2
特定赤色複合顔料*1 0.5
体質顔料*2 15.0
色材顔料*3 2.0
パール顔料*4 3.0
シクロメチコン 25.0
ジメチコンポリオール 5.0
ラウリルPEG−9ポリジメチルシロキシエチルジメチコン 3.0
PEG−9ポリジメチルシロキシエチルジメチコン 1.2
スクワラン 0.1
セスキイソステアリン酸ソルビタン 1.0
ジステアルジモニウムヘクトライト 0.8
メトキシケイヒ酸エチルヘキシル 2.5
ヘマトコッカスプルビアリス油 0.1
トコフェロール 0.1
ダマスクバラ花油 微量
香料 適量
フェノキシエタノール 0.3
グリセリン 10.0
ジプロピレングリコール 4.0
1,3−ブチレングリコール 3.0
水溶性コラーゲン 0.1
ローヤルゼリーエキス 0.1
オリザノール 0.01
ポリオキシエチレンフィトステロール
(NIKKOL BPS−20:日光ケミカルズ社製) 0.03
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(60E.O.) 0.2
ボスウェリアセラタエキス分散組成物B−1 0.01
レシチン 0.1
塩化Ca 1.0
クエン酸 1.0
クエン酸ナトリウム 適量
イオン交換水 残量
上記顔料*1〜*4は下記ものを使用した。
*1 HNB RED7(大東化成株式会社製)
*2 OTS−2 SERICITE PSEと OTS−2 TALK JA−46R(いずれも大東化成株式会社製)を7:3の割合で混合したもの
*3 OTS−2 TiO2 CR−50とOTS−2 YELLOW LLXLOとOTS−2 RED R−516L とOTS−2 BLACK BL−100 (いずれも大東化成株式会社製)を78:19:1:2の割合で混合したもの
*4 ロナフレアバランスゴールドとトランスプリズマ−レッド(いずれもMERCK社製)を7:3の割合で混合したもの
下記組成を有する洗顔料を、常法により調製した(全量100質量%)。
〔組成〕 〔含有量(質量%)〕
ミリスチン酸K 2.0
パルミチン酸K 0.5
ステアリン酸K 0.5
(ラウラミド/ミリスタミド)DEA 1.0
ココイルグリシンNa 10.0
ラウロアンホNa 13.0
PEG−32 3.0
ブチレングリコール 15.0
グリセリン 10.0
ソルビトール 5.0
水酸化カリウム 適量
ステアリン酸グリセリル 1.5
ヘマトコッカスプルビアリス油 0.05
アスタキサンチン含有乳化組成物A 0.05
水溶性コラーゲン 1.0
トコフェロール 0.5
クエン酸 1.0
クエン酸ナトリウム 適量
シア脂 1.0
ポリクオタニウム−7 0.5
ポリクオタニウム−39 0.5
ラウロイルグルタミン酸ナトリウム 1.0
オリザノール 0.01
ポリオキシエチレンフィトステロール
(NIKKOL BPS−20:日光ケミカルズ社製) 0.03
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(60E.O.) 0.2
ボスウェリアセラタエキス分散組成物B−1 0.01
フェノキシエタノール 0.5
ダマスクバラ花油 適量
香料 適量
下記組成を有する清涼飲料を、常法により調製し、pH3.0となるようにクエン酸ナトリウムで調整した(全量100質量%)。
[組成] 〔含有量(質量%)〕
サラシノール 1.0
果糖ブドウ糖液糖 30.0
オレンジ果汁 20.0
アスコルビン酸 0.2
クエン酸[クエン酸化合物] 1.5
乳化剤 0.5
香料 適量
クエン酸ナトリウム[クエン酸化合物] 適量
精製水 残量
ボスウェリアセラタエキス分散物B−1 0.01
Claims (16)
- 第一の細胞層、及び第二の細胞層がこの順番で積層されている細胞積層体であって、第一の細胞層が、少なくとも非不死化間葉系幹細胞とコラーゲンゲルとを含み、第二の細胞層が少なくとも表皮角化細胞を含む、細胞積層体。
- 第二の細胞層が、分化後に4層構造を有している、請求項1に記載の細胞積層体。
- 第一の細胞層の全細胞中の非不死化間葉系幹細胞の割合が10%以上であり、収縮後の表面積1cm2あたりの、第一の細胞層の全細胞の細胞数が1×105細胞以上であり、コラーゲンゲルを形成する際に使用するコラーゲン溶液のコラーゲン濃度が0.1mg/ml以上である、請求項1又は2に記載の細胞積層体。
- 非不死化間葉系幹細胞が、非不死化骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項1から3の何れか一項に記載の細胞積層体。
- 請求項1から4の何れか一項に記載の細胞積層体を含む、生体移植材料。
- 請求項1から4の何れか一項に記載の細胞積層体の表皮角化細胞の分化状態を評価することを含む、表皮の分化状態の評価方法。
- 表皮角化細胞におけるロリクリン、フィラグリン、及びカスパーゼ14から選ばれる少なくとも一種の発現状態を評価することを含む、請求項6に記載の評価方法。
- 請求項1から4の何れか一項に記載の細胞積層体に被験物質を接触させ、細胞分化に対する被験物質の影響を評価する、請求項6又は7に記載の評価方法。
- 少なくとも非不死化間葉系幹細胞とコラーゲンゲルとを含む第一の細胞層を形成する工程、前記第一の細胞層の上に表皮角化細胞を播種する工程、並びに前記第一の細胞層及び表皮角化細胞を気液界面培養により培養する工程を含む、請求項1から4の何れか一項に記載の細胞積層体の製造方法。
- 非不死化間葉系幹細胞が、ヒト由来の10継代以下の細胞である、請求項9に記載の方法。
- 非不死化間葉系幹細胞とコラーゲンゲルとを浮遊培養することにより、第一の細胞層を形成する、請求項9又は10に記載の方法。
- 第一の細胞層の上に播種される表皮角化細胞が、5継代以下の非不死化細胞である、請求項9から11の何れか一項に記載の方法。
- 前記気液界面培養による培養日数が、10日以上である、請求項9から12の何れか一項に記載の方法。
- 非不死化間葉系幹細胞が、非不死化骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項9から13の何れか一項に記載の方法。
- ボスウェリアセラタエキスのエタノール抽出物を含有する、間葉系幹細胞用インスリン様成長因子−1産生促進剤。
- さらにアスタキサンチンを含有する、請求項15に記載の間葉系幹細胞用インスリン様成長因子−1産生促進剤。
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