KR20150141812A

KR20150141812A - 작은 크기의 줄기세포의 미백능 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20150141812A
Application number: KR1020140070332A
Authority: KR
Inventors: 양윤선; 오원일; 김주연; 임훈; 진혜진; 전홍배
Original assignee: 메디포스트(주)
Priority date: 2014-06-10
Filing date: 2014-06-10
Publication date: 2015-12-21
Also published as: WO2015190808A2; WO2015190808A3; CN106456529A

Abstract

본 발명은 크기가 작은 줄기세포, 특히, 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미백용 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 직경 8㎛이하의 크기가 작은 줄기세포가 보유하고 있는, 유난히 현저하게 멜라닌 양을 감소시키는 미백 기능을 이용하는 용도에 관한 것이다.

Description

작은 크기의 줄기세포의 미백능 및 이의 용도{An Whitening Ability of Small-Sized Stem Cells and the Use thereof}

본 발명은 크기가 작은 줄기세포, 특히, 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미백용 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 직경 8㎛이하의 크기가 작은 줄기세포가 보유하고 있는, 유난히 현저하게 멜라닌을 감소시키는 미백 기능을 이용하는 용도에 관한 것이다.

사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되는데, 유전적인 요인 외에도, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다.

상기 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미, 주근깨, 점 등과 같이 과색소침착(hyperpigmentation)을 유발하여 미용상 또는 건강상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다. 또한, 레저 인구의 증가로 외부에서 활동하는 것을 즐기는 사람들이 많아지면서 자외선에 의한 멜라닌 색소 침착을 막고자 하는 요구가 증가하게 되었다. 따라서, 피부 내의 멜라닌 색소의 합성을 저해시키면, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 자외선, 호르몬 및 유전적인 원인에 기인하여 발생하는 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선시킬 수 있다.

현재까지의 미백제 개발은 주로 멜라닌 생합성에서 없어서는 안 될 기본적이면서도 가장 중요한 역할을 하는 효소인 티로시나아제(Tyrosinase)의 활성을 저해하는 것을 통해 멜라닌양을 줄이는 물질을 찾는 것으로 이루어져 왔다. 이렇게 개발된 미백제 물질은 하이드로-퀴논, 티올(thiol), 코지산, 알부틴, 비타민 C등이 있지만 만족할만한 미백효과를 갖지 못하고 있고 오랜 기간 사용시 알레르기, 피부 흡수, 빠른 산화에 따른 색깔 변화와 같은 부작용을 유발하거나 하여 이를 대체하는 소재를 찾고, 개발하려는 시도는 소재연구의 핵심적인 부분을 차지하고 있다.

그러한 노력의 일환으로, 줄기세포를 이용한 화장료 조성물에 관한 연구도 활발히 이루어지고 있는데, 대한민국 특허공보 제10-0848056호(2009.07.23)에는 간엽줄기세포인 지방유래 줄기세포 배양액을 이용한 멜라닌 합성저해 방법이 기재되어 있고, 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0116659호(2009.11.11)에는 제대혈유래 간엽줄기세포 배양액을 포함하는 미백 화장료 조성물에 대해 기재되어 있으나, 만족할만한 미백효과를 수득하지 못했었다.

이에, 본 발명자들은 간엽줄기세포를 배양하면 통상적으로 다양한 크기의 세포들이 함께 모여 있음을 확인하고, 세포 크기에 따른 영향 여부의 가능성에 착안하여 다양한 조직 유래의 간엽줄기세포의 크기에 따른 멜라닌 양 감소에 미치는 효능을 비교하여, 특정 크기 이하의 직경을 가지는 줄기세포가 유난히 뛰어난 미백효과를 나타내는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 특허공보 제10-0848056호(2009.07.23) 2. 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0116659호(2009.11.11)

1. Kobayashi T, Urabe K, Winder A, Jimenez-Cervantes C, Imokawa G, Brewington T, Solano F, Garcia-Borron JC, and Hearing VJ.,Tyrosinase related protein 1 (TRP1) functions as a DHICA oxidase in melanin biosynthesis. EMBO J. (1994) 13, 5818-5825 2. Levy Carmit, Khaled Mehdi, David E Fisher., MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene., Trends Mol Med. (2006) 12(9), 406-414 3. Barbara Bellei, Enrica Flori, Enzo Izzo, Vittoria Maresca, Mauro Picardo., GSK3βinhibiton Promotes melanogenesis in B16 melanoma cells and normal human melanocytes. Cell. Signal.(2008) 20, 1750-1761 4. Barbara Bellei, Angela Pitisci, Caterina Catricala, Lionel Larue and Mauro Picardo., Wnt/β-catenin signaling is stimulated by α-melanocyte-stimulating hormone in melanoma and melanocyte cells: implication in cell differentiation., Pigment Cell Melanoma Res. (2010) 24; 309-325 5. Eun-Jung Lee, Yun Sang Lee, Soonho Hwang, Sanghee Kim, Jae Sung Hwang and Tae-Yoon Kim., N-(3,5-Dimethylphenyl)-3-Methoxybenzamide (A3B5) Targets TRP-2 and Inhibits Melanogenesis and Melanoma Growth., Journal of Investigative Dermatology (2011) 131, 1701-1709 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허가 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명은 멜라닌 양을 감소시키는, 미백 기능이 현저히 우수한 줄기세포의 크기를 이용한 것으로,

본 발명의 주요한 목적은 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 과다색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 작은 크기의 직경을 가지는 줄기세포의 특정 미백 기능 및 이의 다양한 용도를 제공한다.

본 발명은 일 구체예로서, 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

이 때, 상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액은 멜라닌 양을 감소시키는 효능을 가지는데, 이는 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포가 멜라닌 생성세포인 멜라노사이트(melanocyte) 세포에서 멜라닌 합성을 저해하여 멜라닌 발현량을 감소시킬 뿐만 아니라 합성된 멜라닌의 분해를 촉진시키는 기능을 가지고 있기 때문이다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 멜라닌 생성세포는 멜란-에이(Melan-a) 세포 또는 B16F1 세포를 사용하였다.

상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 지방 유래, 혈액 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래, 신경 유래, 부신 유래, 상피 유래 및 자궁 유래의 인간조직 성체 줄기세포, 및 배아 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 줄기세포일 수 있고, 바람직하게는 골수 유래, 제대혈 유래, 또는 지방 유래; 더욱 바람직하게는 제대혈 유래의 성체 줄기세포, 예를 들어, 제대혈 유래의 간엽줄기세포가 가장 바람직하다.

상기 배양액은 기본 배지로 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지를 사용할 수 있으며, 비제한적인 예로서, MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)를 들 수 있다. 가장 바람직하게는 α-MEM (Minimal Essential Medium) 배지를 사용한다.

또한, 본 발명은 다른 구체예로서, 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 과다색소침착 질환(hyperpigmentation disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 이의 구체적인 구성은 상기 설명한 바와 같다.

"과다색소침착(hyperpigmentation)"은 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검게 또는 어둡게 되는 것을 의미하는 것으로, 예를 들어, 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solarlentigines) 등을 포함한다.

이처럼, 본 발명은 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액이 종래 다양한 크기의 줄기세포가 섞여있었던 경우(heterogeneous)와 비교하여 멜라닌 양 감소 효과에 가장 탁월한 능력이 있다는 사실의 발견에 기초한 것으로, 직경 8㎛이하 작은 줄기세포의 우수한 멜라닌 색소 합성 억제능 및 멜라닌 색소 분해 촉진능에 의한 현저한 미백 기능 및 이의 다양한 용도를 제공한다.

본 발명에 의한 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액은 멜라닌 합성세포에서의 멜라닌 발현을 저해하고 합성된 멜라닌의 분해를 촉진함으로써 멜라닌 양을 현저히 감소시켜 매우 우수한 미백 효과를 나타내는 바, 미백 목적의 기능성 화장품과 의약외품 등의 원료 등으로 사용할 수 있으므로 미백 용도를 활용하는 분야에서 매우 유용할 것이다.

도 1은 α-MSH를 처리하여 멜라닌 합성 능력을 증가시킨 Melan-a세포에 다양한 조직 유래 간엽줄기세포 배양액을 처리한 후 멜라닌 양을 측정한 것이다.
도 2는 α-MSH를 처리하여 멜라닌 합성 능력을 증가시킨 B16F1세포에 다양한 조직 유래 간엽줄기세포 배양액을 처리한 후 멜라닌 양을 측정한 것이다.
도 3은 다양한 조직 유래 간엽줄기세포의 배양액이 다양한 크기의 세포들로 구성되어 있음을 보여주는 결과이다.
도 4는 다양한 조직 유래 간엽줄기세포의 크기에 따른 세포 모양 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 크기에 따른 분리 배양 후 배양액에 포함된 줄기세포의 크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 6은 다양한 조직 유래 및 세포 크기별 간엽줄기세포의 배양액에서의 멜라닌 양 감소효과를 관찰한 결과이다.
도 7은 Melan-a세포에 다양한 조직 유래 간엽줄기세포 크기별 배양액 처리에 따른 멜라닌 양 변화량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 Melan-a세포에 지방 조직 유래 간엽줄기세포 크기별 배양액 처리에 따른 멜라닌 양 변화량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 Melan-a세포에 골수 유래 간엽줄기세포 크기별 배양액 처리에 따른 멜라닌 양 변화량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 Melan-a세포에 제대혈 유래 간엽줄기세포 크기별 배양액 처리에 따른 멜라닌 양 변화량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 제대혈 유래 간엽줄기세포 크기별 배양액 처리에 따른 멜라닌 합성 저해 및 분해 촉진에 관한 결과이다.
도 12는 Melan-a세포를 이용하여 확인한, 멜라닌 양 감소에 관련된 분비 단백질이다.
도 13은 인공피부를 이용하여 제대혈 유래 간엽줄기세포 배양액에 따른 멜라닌 감소 결과를 확인한 사진이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"줄기세포(stem cell)"는 어떤 조직으로든 발달할 수 있는 세포를 의미한다. 기본적인 특징으로는 두 가지가 있는데, 우선 반복 분열하여 자신을 만들어 내는 자기 재생산(self-renewal), 그리고 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는다.

"(중)간엽줄기세포"는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 성체 줄기세포의 한 종류로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있다. 성체 줄기세포 중 조혈모세포는 주로 부유상태(non-adherent)로 존재하지만 간엽줄기세포는 주로 부착성 세포들이다. 특히, 제대 유래 간엽줄기세포, 제대혈 유래 간엽줄기세포, 골수 유래 간엽줄기세포, 지방 유래 간엽줄기세포, 근육 유래 간엽줄기세포, 신경 유래 간엽줄기세포, 피부 유래 간엽줄기세포, 양막 유래 간엽줄기세포 및 태반 유래 간엽줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 제대혈 유래 간엽줄기세포이다. 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.

"줄기세포 배양액"이란 줄기세포를 배양하여 얻은 배지에 포함된 구성 성분을 포함하는 물질로서, 상기 배양액을 제조하기 위한 줄기세포는 그 종류에 제한을 받지 않는다. 예를 들면, 배양액을 제조하는 줄기세포는 배아 줄기세포일 수 있고 또한 성체 줄기세포일 수 있다. 나아가 성체 줄기세포는 모든 조직의 성체 줄기세포에서 유래할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 제대혈 유래 성체 줄기세포를 사용하여 배양액을 제조하였다.

"분화(differentiation)"라는 용어는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다.

"배지"는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 줄기세포의 성장 및 증식을 위한 배지이다.

"기본배지"는 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함된 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 성장인자를 제외한 혼합물이다. 본 발명의 기본배지는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에서는 α-MEM(α-Minimal Essential Medium)을 사용하였다.

세포의 "증식(proliferation)" 또는 "성장(growth)'이라는 용어는 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다. 세포수가 증식(증폭)되어 어느 시기에 이르면, 형질이 변화(분화)되어 가는 것과 동시에 제어되고 있는 것이 보통이다.

"대조군" 세포, 조직, 샘플, 또는 대상은 테스트 세포, 조직, 샘플 또는 대상과 동일한 유형의 세포, 조직, 샘플, 또는 대상이다.

"미백"은 피부의 색을 결정하는 세포인 멜라노사이트(melanocyte)에서 멜라닌 색소를 합성하는 능력을 억제시키거나 합성된 멜라닌을 분해시킴으로써 피부의 색이 어두워지는 것을 방지하는 것과 관련된 요소이다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 작은 크기의 직경을 가지는 줄기세포의 특정 미백 기능을 이용하는 것에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로서, 소스 유래에 따라 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 이용할 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게는 다양한 기원 조직으로부터 유래된 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 자궁, 골수, 근육, 태반, 제대혈 또는 피부(상피) 등의 조직 유래 줄기세포를 사용할 수 있다. 특히, 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)인 것이 바람직하다. 상기 간엽줄기세포는 일반적으로 조혈작용을 돕는 지지세포(stroma)로서, 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포로 분화하는 능력을 지녔으며, 미분화상태를 유지하면서 쉽게 증식시킬 수 있는 특징이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 지방, 골수 및 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSCs)를 사용하였다.

가장 바람직하게는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용한다.

제대혈이란 출산 때 탯줄에서 나오는 탯줄혈액을 말하는 것으로, 백혈구와 적혈구,혈소판 등을 만드는 조혈모세포 및 혈관내피전구세포를 다량 함유하고, 연골과 뼈, 근육, 신경 등을 만드는 간엽줄기세포도 갖고 있어 의료가치가 매우 높다. 제대혈의 특성은 조혈모세포 수가 골수나 말초혈에 비하여 높은 농도로 존재할 뿐 아니라, 그 성숙도가 더욱 미숙하며 골수에서 발견되는 조혈모세포보다도 증식, 자기 복제 및 분화능력이 훨씬 뛰어나다는 것이다. 또한, 버려지는 제대(Umbilical cord)에서 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 수많은 조혈모세포 및 줄기세포를 포함하고 있으므로, 본 발명의 바람직한 일 태양은 인간 제대혈 유래 혈액에서 분리한 간엽줄기세포를 이용하는 것이다.

한편, 본 발명에 따른 줄기세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다.

적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용 가능한 배지를 사용할 수 있다.

상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 일반적으로 배양에 이용되는 기본 배지로는 MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)이 있으며, 이 외에도 당해 업계에서 이용되는 배지라면 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게는, α-MEM 배지(GIBCO), K-SFM 배지, DMEM배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), DMEM/F12 배지, PCM 배지, M199/F12(mixture)(GIBCO), 및 MSC 확장배지(Chemicon)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 이러한 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다. 그러나 당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 다양한 조직 기원 유래 줄기세포에 가장 적합한 배지를 선택 또는 조합하여 공지의 방법으로 적절히 배양할 수 있음은 자명할 것이다. 본 발명의 일 실시예에서는 α-MEM 배지, K-SFM 배지 등을 사용하였다.

또한, 이 분야의 통상의 지식에 기초하여 적합한 배양 환경, 시간, 온도 등의 조건을 조절하면서 배양할 수 있음은 자명하다.

본 발명의 일 구체예로서, 간엽줄기세포를 α-MEM 배지에서 세포 컨플루언스가 약 80~90%, 바람직하게는 약 컨플루언스 90% 정도로 증식될 때까지 배양하고, 예를 들어, PBS 등을 사용하여 세척한 다음, 이어서 K-SFM 배지에서 약 20~25 시간, 바람직하게는 24시간 동안 추가 배양할 수 있다. "컨플루언스(%)"라는 용어는 '면적당 세포농도(포화도)'를 표현하는, 당업계에서 통상적으로 사용되는 용어로, 세포 배양에 있어서 단위 면적당 세포수(세포농도)를 상대적으로 나타내는, 당업자들이 실험에 있어서 자주 사용하는 단위이다. 본 발명은 이러한 8㎛이하의 작은 크기의 줄기세포 및 이의 배양액을 제조하는 방법도 포함한다.

한편, 본 발명에 따른 배지에서 배양된 줄기세포를 트립신으로 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 배양된 줄기세포에 트립신을 처리하면 단세포 형태의 줄기세포를 얻을 수 있는데, 이때 트립신은 세포 간의 응집을 억제하여 세포가 단세포(single cell)의 형태를 갖도록 처리되는 것으로, 세포 간의 응집 형성을 억제할 수 있는 물질이면 대체하여 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 설명한 줄기세포 중 직경이 10㎛이하, 가장 바람직하게는 8㎛이하의 작은 크기의 줄기세포가 가지는 유난히 뛰어한 미백 기능의 이용에 관한 것이다.

특히, 상기 직경이 8㎛이하의 작은 크기의 줄기세포의 미백 기능은 이들이 멜라닌 생성 세포인 멜라노사이트(melanocyte)에서의 멜라닌 발현량을 감소시킬 뿐만 아니라, 합성된 멜라닌의 분해를 촉진시킴으로써 전체적으로 멜라닌 양을 감소시키는 효능에서 기인하는 것이다.

사람의 피부색을 결정하는 멜라닌(melanin)은 인체 내 호르몬 밸런스(hormone balance)의 불균형 상태, 스트레스 혹은 자외선(UV: Ultraviolet) 노출 등에 의해서 유발된다.

이와 같은 멜라닌의 생성은 주로 각질층(epidermis)중 가장 아래에 있는 기저층(stratum basale layer)에 존재하는 멜라닌 생성세포인 멜라노사이트(melanocyte)라 불리는 피부 세포에서 만들어져 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동한다. 멜라노사이트는 피부 표피의 기저층(the stratum basale) 및 눈의 가운데층의 포도막(the uvea)에 위치하는 세포로서, 멜라노제네시스(melanogenesis)라 불리는 과정을 통하여, 피부, 눈, 머리카락에서 볼 수 있는 색소와 관련된 멜라닌(melanin)를 생산하는 세포이다. 일반적으로 피부의 1mm2당 1000 내지 2000개의 멜라노사이트가 존재하며 표피의 바닥 면의 5 내지 10%를 차지한다. 여기서 멜라닌은 핵주변에 모자와 같은 구조를 형성하여 자외선으로부터 유전자를 보호하고 자유 래디컬(free radical)을 제거하여 세포 내 단백질을 보호하는 등 중요한 역할을 하게 된다. 이러한 멜라닌을 분해하는 효소가 생체 내에는 없고 다만 케라티노사이트가 표피에서 떨어져나갈 때 같이 피부에서 떨어져나가는 것으로 제거된다.

하지만, 때로는, 유전적 혹은 후천적 원인으로 멜라닌 생성세포가 진피층(dermis)에 비정상적으로 존재하게 되고 멜라닌 과발현 현상이 유발되게 되어 오타반점(ota's nevus)과 같은 증상이 일어나기도 한다. 멜라닌이 필요이상으로 많이 생기게 되면 기미나 주근깨, 점 등과 같이 과색소침착증을 유발하여 미용상으로 좋지않은 결과를 가져오게 된다. 이와 같이 멜라닌 합성 및 발현을 정상화하거나 조절하는 것은 매우 중요하며 유익하게 활용될 수 있다.

본 발명의 직경이 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이들의 배양액은 종래 다양한 크기의 줄기세포가 섞여있었던 경우(heterogeneous)와 비교하여 현저한 미백 효과를 발휘하는 것을 주요한 특징으로 하고 있고, 이는 본 발명의 줄기세포 또는 이들의 배양액이 우수한 멜라닌 색소 합성 억제능 및 멜라닌 색소 분해 촉진능을 가지고 있기 때문이다.

본 발명의 직경이 8㎛이하의 작은 줄기세포는 멜라닌 합성의 핵심 효소인 티로시나아제(tyrosinase)의 발현과 활성을 억제함으로써, 즉, 멜라닌 생성 저해 기전에 관여하여 멜라닌 합성을 저해하는 능력이 뛰어나다. 줄기세포가 티로시나제 활성 억제능을 가짐은 이미 알려진 사실이지만, 특히 크기가 작은 줄기세포가 그 능력이 탁월하다는 것은 알려진 바가 없다.

뿐만 아니라, 본 발명의 직경이 8㎛이하의 작은 줄기세포는 이미 합성된 멜라닌의 분해촉진에도 관여하는 것을 특징으로 한다.

멜라닌 양의 감소와 관련하여, 종래부터 알려진 줄기세포 분비 단백질로는 TGF-β2, TNF-α, IFN-γ, ERK-1, ERK-2, 티로시나아제(Tyrosinase), IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 17, EGF-R, G-CSF, GM-CSF 및 TRP-1 등이 있지만, 본 발명자들은 직경이 8㎛이하의 작은 줄기세포로부터 CD32/Fcg Receptor II, 프로게스테론 수용체(Progesterone Receptor), 페리틴(Ferritin), 프로히비틴(Prohibitin), 라미닌B1(LamininB1), 트롬보스폰딘(Thrombospondin), C-ERB-4/HER-4 등의 단백질이 더 분비됨을 확인하였다. 이러한 작은 크기의 줄기세포로부터 분비되는 단백질이 보다 우수한 멜라닌 합성 저해능 및 멜라닌 분해능에 영향을 끼치는 것으로 여겨진다.

본 발명의 일 실시예에서는 멜라닌 생성세포로서 멜란-에이(Melan-a) 세포 및 B16F1 세포를 이용하여 α-MSH(melanozyten stimulierende hormone)를 처리하여 멜라닌 발현을 유도하고 다양한 조직 기원 간엽줄기세포를 크기별로 구별하여 그 멜라닌 양 감소 기능을 관찰하였다. 그리고 비교 대조군의 하나로, 멜라닌 양을 감소시키는 가장 대표적인 물질로 알려져 있는 RSV(antimelanogenesis activity of resveratrol, antimelanogenic agent)와 그 효과를 비교하였다.

종래 알려진 바와 같이, 간엽줄기세포를 배양하면 다양한 크기 분포를 가지는 줄기세포들이 섞여 있는데, 이들에 대하여 8㎛이하의 작은 세포만을 추출하여 배양한 경우에, 티로시나아제 활성 억제 및 자가소화(autophagy) 촉진에 의해 가장 현저하게 멜라닌 양 감소효과가 나타나는 것을 확인하였으며, 이에 반해, 20㎛ 이상의 크기가 큰 간엽줄기세포들은 멜라닌 양 감소 효과에 영향을 그다지 미치지 못하였음을 확인하였다.

즉, 본 발명의 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이들의 배양액은 종래 다양한 크기의 줄기세포가 섞여 있던 종래의 줄기세포 배양액(heterogeneous)의 경우나 우수한 멜라닌 감소 효과를 가진 것으로 알려진 RSV와 비교하여도, 멜라닌의 양이 감소되는 정도가 현저하게 차이를 나타낸다.

이러한 멜라닌 감소 효능에 대해서는, 줄기세포의 "크기"가 가장 중요한 요소로서, 지방 조직, 골수 또는 제대혈 등 줄기세포 유래 조직의 종류 등과 관계없이 직경 8㎛이하의 작은 크기를 가지는 줄기세포들이 우수한 멜라닌 감소 효능을 보유하지만, 특히, 제대혈 유래 줄기세포를 이용하는 것이 가장 바람직하다. 즉, 멜라닌 색소 합성 억제능 및 분해 촉진능이 가장 우수한 경우는 지름이 8㎛이하의 작은 제대혈 유래 간엽줄기세포 또는 이들의 배양액을 포함하는 경우이다.

그러므로, 본 발명은 일 관점에서 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

'화장료 조성물'은 상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물로서 그 제형은 어떠한 형태라도 가능하다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제조는 통상적으로 사용되는 어떠한 방법으로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 함유하는 화장료 조성물을 인간의 피부에 도포하는 것을 특징으로 하는 화장방법을 제공한다.

본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 인간의 피부에 도포하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 피부에 도포하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다. 본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 피부 보호 효과가 우수한 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형 비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클린징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 다른 관점에서 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 과다색소 침착 질환(hyperpigmentation disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

"과다색소침착(hyperpigmentation)"은 피부 또는 손발톱의 특정 부위에서 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검게 또는 어둡게 되는 것을 의미한다. 바람직하게는 상기 과다색소침착에 의한 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solarlentigines) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여경로가 결정되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 멜라닌 색소의 과침착에 의한 피부 질환의 치료에 사용되기 때문에 피부에 국소적으로 적용되는 방식으로 투여되는 것이 가장 바람직하다.

또 하나의 구체예로서, 본 발명은 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 화장료 조성물 및 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다. 상기 조성물의 제조는 통상적으로 사용되는 어떠한 방법으로도 제조될 수 있으며, 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포를 단리하고 배양하고 분리하는 과정은 본 발명의 방법에 한정되지 않고 당업계에서 통상적으로 수행되는 방법으로 실시가능하다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이들의 배양액은 피부의 색소 침착을 예방 및 치료할 수 있는 기능성 화장품 및 의약(외)품 개발의 원료로 유용하게 사용될 수 있다.

본 명세서에서는 미백용 기능성 화장품 조성물 및 과다색소침착(hyperpigmentation) 질환 치료용 약학적 조성물을 중심으로 설명하였으나, 본 발명은 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미백 효과에 대한 다양한 형태의 조성물 및 이들의 이용방법으로서 다양하게 활용할 수 있다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명하다 할 것이다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

재료 및 방법

본 발명에서는 메디포스트(주)(한국)에서 제공받은 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포를 사용하였다. 상기 세포는 제대혈 채취 단계 및 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리 및 배양하는 단계로부터 얻어질 수 있으며, 각 단계에 대한 자세한 내용은 다음과 같다

제대혈 채취 단계에서는, 정상질식분만의 경우, 아기출산 후 자궁 내에 아직 태반이 남아있는 상태에서 밖으로 만출된 제대정맥으로부터 채취하거나, 또는 제왕절개의 경우에는 아기 출산 후 태반 역시 자궁 밖으로 만출된 상태에서 제대정맥으로부터 채취한다.

본 발명에서 출산 후 자궁 밖으로 만출된 제대 정맥으로부터 제대혈을 채취할 때는, 신생아가 태어난 후 태반과 태아를 연결하고 있던 제대정맥으로부터 무균적 조작법에 의해 채취한다. 제대정맥을 확보한 후, 채취침을 이용하여 항응고제가 함유된 제대혈 채취백(주머니)에 제대혈을 채취한다.

상기와 같이 채취된 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리ㆍ배양하는 방법은 대한민국 등록특허 제10-0494265호의 방법을 비롯하여 기존에 사용되어 온 방법은 모두 사용할 수 있으며(Pittinger MF, Mackay AM, et al.,Science, 284: 143-7, 1999; Lazarus HM, Haynesworth SE, et al., Bone Marrow Transplant, 16: 557-64,1995), 그 중 한 예를 들면 다음과 같다.

채취된 제대혈을 원심분리하여 단핵세포들을 분리한 후, 여러 번 세척하여 이물질들을 제거한다. 세척 후 적절한 밀도로 단핵세포들을 배양용기에 심어 배양하면, 단일층을 이루면서 세포들이 증식하는데 이 중 위상차 현미경으로 관찰되는 모양이 동질성(homogeneous)이면서, 방추형 모양(spindle shape)의 긴 형태의 세포들의 콜로니 형태로 증식하는 세포가 간엽줄기세포이다. 이후 세포가 컨플루언트(confluent)한 정도로 자라게 되면 계대배양을 실시하여, 필요한 만큼의 세포수가 될 때까지 증식시킨다.

1. 멜라닌 생성세포 및 줄기세포 배양 ( Melanocyte and mesenchymal stem cell culture )

B16F1 마우스 멜라노마 세포주(mouse melanoma cell line)은 ATCC(american type of culture collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, 멜란-에이(Melan-a) 멜라노사이트 세포는 Dr. Dorothy C.Bennett(St.George's Hospital Medical School, Lodon, UK)로부터 분양 받았다.

B16F1 세포는 37℃, 5% CO₂ 인큐베이트에서 배양하였고, 배지로 10% FBS(fetal bovine serum: Invitrogen, Calsbd, CA)와 P/S(penicillin/streptomycin)를 함유하는 DMEM(dulbecco's modified eagle's medium: Hyclone, Thermoscientific, Logan, UT)를 사용하였다. 멜란-에이(Melan-a) 세포는 10% FBS와 1% P/S 그리고 200mM PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate: Sigma, St. Louis, MO)을 함유하는 RPMI 1640 배지(Hyclone)에서 배양하였다.

또한, 메디포스트(주)(한국)에서 배양하여 보관 중인 제대혈 유래 간엽줄기세포[hUCB-MSC(umbilical cord blood mesenchymal stem cell)], 및 골수 유래 간엽줄기세포[BM(bone maroow)-MSC], 및 지방 유래 간엽줄기세포[Adipo(Adipose derived)-MSC]를 10% FBS와 1% P/S을 함유하는 α-MEM(GIBCO)에서 배양하였다.

2. 샘플군 배양액( Conditioned Media ) 준비

hUCB-MSC, BM-MSC, Adipo-MSC로부터 샘플군 배양액(conditioned media)을 제조하였다.

37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서, 저장상태(LN2 tank에 보관함)의 세포를 해동하여 배양하고, 이 때 2% FBS를 함유하는 α-MEM(GIBCO) 배지에서 세포 컨플루언스가 90% 정도로 증식될 때까지 배양하였다.

그 후, PBS(phosphate buffered saline)로 3회 세척하고 페놀 레드(phenol red)가 첨가되지 않은 케라티노사이트 배지(K-SFM, Keratinocyte Serum Free Medium)에서 24시간 배양한 다음 배양액을 수거하였고, 이를 3일동안 반복하여 수행하였다. 그리고, 수거한 배양액은 각각 필터링(Top Filer System, Nunc)한 후 냉장 및 냉동 보관하여 사용하였다.

3. 세포 크기별 줄기세포의 배양액 제조

세포 크기별 간엽줄기세포의 배양액 제조는 다음과 같이 수행하였다.

37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서, 저장상태(LN2 tank에 보관함)의 세포를 해동하여 배양하고,

37℃, 5% CO₂ 인큐베이터 조건에서 배양하고, 저장상태(LN2 tank에 보관함)의 세포를 해동하여 배양 한 후, 8㎛ 및 20㎛ 멤브레인 필터를 이용하여 작은 크기의 줄기세포들을 분리하여 수집하였다. 이 때, 직경 8~20㎛ 크기의 세포는 20㎛ 멤브레인 필터를 사용한 후, 이어서 8㎛ 멤브레인 필터를 두 번 연속하여 사용함으로써 수득하였다.

10% FBS를 함유하는 α-MEM(GIBCO) 배지에서 세포 컨플루언스(confluence)가 70% 정도로 증식될 때까지 배양하고, 3회 PBS로 세척하였다. 그리고, 페놀 레드가 첨가되지 않은 케라티노사이트(Keratinocyte) 배지(K-SFM)에서 24시간 동안 배양한 후 배양액을 수거하고 이를 3일 동안 반복하였다. 수거한 배양액은 필터링(Top Filer System, Nunc)한 후 냉장 및 냉동 보관하여 사용하였다.

4. 멜라닌 발현을 위한 처리시약 ( Reagents )

멜라닌 발현 활성화를 위하여 B16F1 마우스 멜라노마 세포주(mouse melanoma cell line) 및 멜란-에이(Melan-a) 멜라노사이트에 α-MSH (melanozyten stimulierende hormone)(St. Louis, MO, USA)를 1 μM 농도로 처리하였다.

또한, 멜라닌 합성 감소 정도를 비교하기 위한 비교 대조군의 제조를 위해, 멜라닌 양을 감소시키는 가장 대표적인 물질로 알려져 있는 RSV (antimelanogenesis activity of resveratrol, antimelanogenic agent, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 50μM 농도로 처리하였다.

5. 멜라닌 분석 ( Melanin assay )

B16F1 멜라노마 세포, 멜란-에이(Melan-a) 세포 모두 저장 상태에서 해동하여 배양을 시작하였다. 24시간 후에 α-MSH을 24시간 동안 처리하고, 멜라닌 합성 감소 효과에 대한 기준 실험으로 RSV을 사용하고 비교를 위해 각각의 배양액을 24시간 동안 처리하였다.

그 후, 세포를 트립신 처리하여 세포 배양 플레이트로부터 분리·수집하고, 1 N NaOH를 10% DMSO에 용해시킨 완충 용액을 이용하여 100℃에서 30분동안 세포 내에 있는 멜라닌을 분리시켰다.

멜라닌 분리가 끝난 후 ELISA 플레이트 리더기(Victor X3, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여, 415nm 에서 멜라닌 양을 측정하였다.

6. 줄기세포 유래별, 세포 크기별 멜라닌 합성 억제 및 분해 촉진능 확인

본 발명자들은 골수, 지방, 제대혈유래 등 각 간엽줄기세포를 8, 8~20, 20μm로 크기별로 분리한 후, 이 세포들로부터 배양된 배양액이 어떠한 기작을 통하여 합성된 멜라닌의 양을 감소시키는지 알아보고자 하였다.

6-1. 멜라닌 합성 저해 실험

제대혈 유래 간엽줄기세포 배양액을, α-MSH 처리한 멜라닌 세포에 세포 크기별로 처리한 후 멜라닌 세포에서 단백질을 추출하였다.

각 조건별 모든 단백질 추출액은 단백질 샘플 완충액(protein sample buffer)[62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 25% 글리세롤, 2% SDS, 5% β-머캅토에탄올, 0.01% 브로모페놀 블루](BioRad, Hercules, CA)으로 준비하였다. 그 후 각 샘플을 SDS-PAGE로 전기영동 하고, PVDF 멤브레인(BioRad)에 옮긴 후, 항-티로시나아제 항체(anti-tyrosinase antibody, V.J. Hearing (NIH, Bethesda, MD으로부터 제공 받음))를 4℃에서 밤새 반응시켰다.

단백질 검출을 위해 PVDF 멤브레인은 HRP-컨쥬게이트된 2차 항체 (Pierce, Rockford, IL)로 반응시킨 후, AE-9300 Ez-Capture MG Hours Image Saver HR image capture tool (ATTO, Tokyo, Japan)을 이용하여 티로시나아제의 활성을 확인하였다.

6-2. 멜라닌 분해 촉진 실험

제대혈 유래 간엽줄기세포 배양액이, α-MSH처리에 의해 합성된 멜라닌 분해를 촉진하는지 확인하기 위해, 세포 크기별 배양액 처리에 따른 멜라닌 세포의 자가소화(autophagy) 현상을 확인하였다.

본 실험을 위해 B16F1 세포에 pEGFP-LC3 벡터를 리포펙타민 2000으로 트랜스펙션하고 G418 (1 mg/ml)을 7일 동안 처리하였다. 96웰에 단일 세포를 옮긴(single cell dropping) 후, 생존하고 형광이 보이는 클론을 키워 세포주(cell line)를 준비하고, 형광 현미경(IX71, Olympus, Japan)을 이용하여 세포들을 확인하였다.

자가소화(autophagy) 현상에서는 GFP-LC3 I 에서 GFP-LC3 II로의 전환이 일어나게 되는데, 이와 같은 GFP-LC3 II로의 전환이 일어나면 GFP-LC II가 자가포식체(autophagosome)로 타겟팅되어지는 GFP-LC3의 점상부(punctate)를 통해 확인이 가능하다. 자가소화(autophagy) 현상을 확인하기 위하여, 현미경 상으로 확인되는 세포 100개 중에서 GFP-LC3 점상부(Punctate)가 보이는 세포를 계수하여 측정하였다. 이 때, 양성 대조군으로, 자가소화 유도체(autophagy inducer), 항-멜라노생성 유도물질(anti-melanogenic agent)인 RSV(Resveratrol)(Sigma, St. Louis, MO)을 50μM처리하여 사용하였다.

7. 성장인자 분석 ( Growth Factors assay )

각 간엽줄기세포에서 1% 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail, Sigma, St. Louis, Mo), 1% 포스포타아제 억제제 칵테일(phosphotase inhibitor cocktail, Sigma, St. Louis, Mo), 라이시스 비즈(lysis beads)(Fullmoon biosystems, Sunnyvale, CA)를 이용하여 단백질을 추출하고, 항체 어레이 분석 키트(Fullmoon biosystems, Sunnyvale, CA)를 이용하여 순수 단백질을 정제하였다. 단백질 분석은 항체 마이크로어레이 슬라이드(Fullmoon biosystems, Sunnyvale, CA)을 이용하여 발현 여부를 측정하고, GenePix 4000B scanner (Axon Instrument, USA), Genowiz 4.0TM (Ocimum Biosolutions, India)와 UniProt DB를 이용하여 분석하였다.

8. 3D 인공 피부 실험 방법

본 발명자들은 줄기세포 배양액의 멜라닌 양 감소능을 세포 수준에서 확인한 다음, 나아가 인공피부를 이용하여 멜라닌 양 감소를 확인하였다.

3D 인공 피부는 MEL-300-B-MelanoDerm tissues(MatTek Co. Kr)를 사용하고, 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터 조건에서 EPI-100-LLMM-NMM-NMM-133을 사용하여 배양하였다. 음성 대조군으로 DW를, 양성 대조군으로 코직산 2%를 처리한 다음, 세포 사이즈별 분리 후 배양된 배양액(conditioned media, CM)을 각각 처리하여 비교 실험을 하였다. 현미경을 통해 멜라닌 세포의 멜라닌 발현 정도를 관찰하였다.

실시예 1 : 멜란 -에이( Melan -a) 멜라노사이트에서의 멜라닌 양 감소 효과

Melan-a 세포는 배양하는 동안 멜라닌 합성이 이뤄지는 세포로서, 멜라닌 합성이 활성화 되면 검은색을 띤다. Melan-a 세포는 세포 저장 횟수, 즉 세포 계대수(cell passage)가 많은 경우, α-MSH을 처리하면 Melan-a 세포에서의 멜라닌 합성이 증가된다.

본 발명자들은 상기 Melan-a 세포를 배양하면서 α-MSH 1μM를 24시간 동안 처리하여, 멜라닌 합성 능력을 2배로 증가시킨 후, 멜라닌 합성 저해물 및 멜라닌 양 감소 물질로 알려진 RSV 50μM를 처리함으로써, 멜라노사이트 내의 멜라닌 양을 1/2로 감소시키는 시스템을 구축하였다. RSV는 지금까지 알려진 멜라닌 합성 저해 및 멜라닌 양 감소 물질 중 가장 효과가 좋은 것으로 알려져 있다.

한편, 본 발명자들은 hUCB-MSC, BM-MSC, Adipo-MSC 배양액이 함유된 배양액을 상기 Melan-a 세포에 24시간 동안 처리하고 멜라닌 양의 변화를 측정하였다.

그 결과를 도 1에 도시하였다. 이는 상기 실험을 3번 반복하여 얻은 결과이다.

도 1을 통해 알 수 있는 바와 같이, α-MSH를 처리하여 멜라닌 합성을 유도시킨 대조군(Control) 상태에서 멜라닌 발현 양을 200% 기준으로 했을 때, BM-MSC, Adipo-MSC 유래 배양액을 처리한 경우는 멜라닌 합성 양이 약 180%로 측정됨으로써 멜라닌 양이 거의 감소되지 않았다.

그러나, hUCB-MSC 유래 배양액은 α-MSH을 처리한 대조군에서의 멜라닌 합성 양을 기준으로 하였을 때, RSV보다 약 2배, 대조군보다는 약 4배 정도 멜라닌 양을 감소시키는 것으로 확인되었다.

즉, 세포 크기에 따른 분류 없이, 다양한 크기의 세포들이 섞여 있는 통상적인 세포 배양의 경우, 다양한 조직 기원 유래의 줄기 세포들 중에서 제대혈 유래 간엽줄기세포가 멜라닌 양을 감소시키는 능력이 가장 우수함을 알 수 있었다.

실시예 2 : B16F1 세포에서의 멜라닌 양 감소 효과

본 발명자들은 추가로 B16F1 세포에서도 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 수행하고 그 결과를 도 2에 도시하였다.

그 결과, B16F1세포에 α-MSH를 처리하여 멜라닌합성을 유도시킨 후 측정한 멜라닌 양을 200% 기준으로 했을 때, RSV를 처리하게 되면 120%로 나타났고, BM-MSC-배양액 및 Adipo-MSC-배양액은 멜라닌 양이 각각 180%, 200%로 측정되었다. 즉, 골수와 지방(Adipocyte) 유래 간엽줄기세포로부터 만들어진 배양액의 경우는 멜라닌 양 감소 효과가 없었다.

그러나, 실시예 1과 마찬가지로 UCB-MSC-배양액을 처리한 경우는 멜라닌 양이 110%로 관찰되었고, 이와 같은 관찰결과 또한 UCB-MSC-배양액이 우수한 멜라닌 합성 저해 물질로 알려진 RSV보다 멜라닌 양을 더 감소시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 3 : 세포 크기의 분포 상태 및 성장 형태 확인

본 발명자들은 다양한 조직 유래, 즉 지방, 골수 및 제대혈 유래 간엽줄기세포 배양에 대하여, 성장된 간엽줄기세포들이 어떠한 크기를 가지고 있는지 그 분포 상태를 확인하고자 하였다.

그 결과, 도 3을 통해 알 수 있는 바와 같이, 다양한 조직 유래 간엽줄기세포의 배양액들은 본질적으로 다양한 크기의 간엽줄기세포들이 모여 있음을 확인하였다. 특히, 제대혈 유래 간엽줄기세포는 스톡(stock) 상태에서 바로 해동해서 분석했을 때보다 세포 배양을 하여 세포들을 성장시킨 후 세포들의 크기가 더욱 다양하게 나타났다. 이러한 현상은 제대혈 유래 간엽줄기세포뿐만 아니라, 골수 및 지방 유래 간엽줄기세포에서도 유사한 결과로 나타났다.

한편, 본 발명자들은 추가로 다양한 조직 유래 간엽줄기세포의 크기에 따른 세포 모양 변화를 관찰하여 도 4에 나타내었다.

그 결과, 작은 크기의 줄기 세포는 조직 유래와 상관없이 혼합(hetetogeous) 세포와 비교하여 세포 형태면에서 큰 변화가 나타나지 않음을 확인하였다.

실시예 4 : 세포 크기별 분리·배양에 따른 세포 분포 관찰

직경별로 분리한 줄기세포가 배양 후 다시 다양한 크기의 세포군집(heterogenous population)으로 변화하는지 관찰하기 위해, 세포 분리 후 6-7일간 배양된 간엽줄기세포의 크기 분포를 재확인하였다. 그 결과를 도 5에 도시하였다.

혼합되어 있는 경우(Heterogeneous)의 세포 배양 후 배양액에 포함되어 있는 줄기세포의 크기 분포는 도 5. A에, 직경 8㎛ 이하 세포의 분리 배양 후 세포 크기 분포를 도 5. B에, 직경 8㎛~20㎛ 세포의 분리 배양후 세포 크기 분포는 도 5. C에, 직경 20㎛ 이상 세포의 분리 배양 후 세포크기 분포는 도 5. D에 나타내었다.

직경별로 간엽줄기세포를 분리하여 배양한 후 세포 크기를 분석한 결과, 다시 다양한 크기의 세포군집(heterogenous population)으로 배양되지 않고, 여전히 유사한 크기의 세포들만이 존재함을 알 수 있었다.

실시예 5 : 줄기세포 크기에 따른 멜라닌 양의 감소 효능

앞서 기재한 바대로 세포를 크기별로 분리한 후, 배양액(conditioned media)을 준비하고, 이 배양액을, α-MSH로 멜라닌 합성을 자극시킨 멜란-에이(melan-a) 세포에 처리하여 멜라닌 양 감소에 미치는 영향을 관찰하였다.

그 결과를, 다양한 조직 유래별로 도 6 및 도 7에 도시하였다.

우선, 지방, 골수 및 제대혈 유래 간엽줄기세포에서 8㎛ 이하, 8~20㎛, 20㎛ 이상 세포 사이즈별로 만든 배양액으로 멜라닌 감소 효과에 미치는 영향을 육안으로 관찰한 결과, 8㎛ 이하 작은 세포 배양액의 경우 멜라닌 감소 효과가 증가하여 색이 옅어짐을 확인하였다(도 6).

보다 구체적으로는, 줄기세포의 크기별 분리 없이 그대로 배양한 경우(heterogenous), 즉, 다양한 세포 사이즈를 모두 포함한 줄기세포에서 만든 배양액을 멜란-에이(melan-a) 세포에 처리한 경우보다 8㎛ 이하의 작은 직경 크기를 가지는 세포의 배양액을 처리한 경우가 멜라닌 양의 감소 효과가 약 12% 증가됨을 확인하였다(도 7).

그러나, 이와 달리, 20㎛ 이상의 큰 직경 크기를 가지는 세포 배양액을 멜란-에이(melan-a) 세포에 처리한 경우에는 대조군의 경우와 별다른 차이를 나타내지 않았다. 이는 20㎛ 이상의 큰 크기의 간엽줄기세포는 멜라닌 양 감소에 큰 영향을 미치지 못함을 의미한다.

또한, 8~20㎛ 직경을 가지는 간엽줄기세포 배양액의 경우도 혼합상태 (heterogenous population)의 대조군과 비교하여 유의한 멜라닌 감소효과를 보이지 않았다(도 8 내지 도 10의 p값 참조).

실시예 6 : 다양한 조직 유래의 간엽줄기세포에 따른 멜라닌 양의 감소 효능

본 발명자들은 간엽줄기세포의 크기 뿐만 아니라 유래 조직의 종류에 의해 멜라닌 양 감소 기능이 크게 좌우되는지 확인하기 위해 지방, 골수 및 제대혈 유래 간엽줄기세포를 크기별로 분리하여 이들의 멜라닌 양 감소 효과를 측정하였다.

그 결과들을 도 7 내지 도 10에 도시하였고, 도 8 내지 도 10에 각각 지방, 골수 및 제대혈 유래 간엽줄기간엽줄기른 결과를 각각 별개의 그래프로 도시하였다.

제대혈 유래 간엽줄기세포 배양액은 타 성체줄기세포(예: 지방, 골수)유래 배양액과 비교하여도 탁월한 멜라닌 양의 감소 효과를 보였다(도 10). 특히, 멜라닌 양의 감소효과에 탁월한 효과를 가지는 것으로 알려진 RSV 50μM를 처리했을 때보다 2배 정도 멜라닌 양의 감소 효과를 나타냈다.

골수, 지방 유래 간엽줄기세포 배양액에 대해 동일한 실험을 수행한 결과(도 8 및 도 9), 비록 제대혈 유래 간엽줄기세포 배양액의 멜라닌 양 감소 효과 정도만큼은 아니지만(도 10), 대조군인 혼합 줄기세포(heterogenous)와 비교하여 상대적으로 8㎛ 이하의 세포배양액을 처리한 경우에서 10% 정도 멜라닌 양 감소 효과를 나타내었는 바, 줄기세포의 유래 조직의 종류보다 줄기세포의 "크기"가 미백 효능에 대해 보다 중요한 결정 요소임을 알 수 있었다.

실시예 7 : 멜라닌 합성 저해능 및 분해 촉진능 확인

본 발명의 제대혈 유래 간엽줄기세포 배양액을 이용하여, 티로시나아제의 웨스턴블럿 분석으로 멜라닌 합성 저해능을 , 그리고, 자가소화(autophagy) 현상 분석으로 멜라닌 분해 촉진능을 확인하고, 그 결과를 도 11에 도시하였다.

도 11 A 에서 나타난 바와 같이, 제대혈 유래 간엽줄기세포 배양액을 처리한 경우, 특히, 8㎛ 이하의 세포 배양액을 처리한 경우는 양성 대조군인 RSV 처리군 만큼 멜라닌 세포의 티로시나아제 활성이 억제되는 것이 관찰되었다.

또한, 도 11 B 에서 나타난 바와 같이, 제대혈 유래 간엽줄기세포의 배양액을 처리한 경우는, 멜라닌 세포내의 자가소화(autophagy) 활성도를 현저히 증가시켰다. 더욱이, 8㎛이하의 세포 배양액을 처리한 경우는 양성 대조군인 RSV를 처리한 군과 유사하게 멜라닌 세포내의 자가소화(autophagy) 활성도가 음성대조군에 비해 40%나 증가하는 것이 확인되었다.

이러한 결과를 통해, 본 발명의 8㎛이하 제대혈 유래 간엽줄기세포의 배양액 처리는 멜라닌 세포 내의 티로시나아제 활성 억제를 통한 멜라닌 합성 저해 및 자가소화(autophagy) 활성에 의한 멜라닌 분해를 촉진함으로써 멜라닌 양을 감소시키는 것을 알 수 있었다.

실시예 8 : 멜라닌 양 감소에 관여하는 분비 단백질

실시예 1에서와 같이 배양액 처리된 Melan-a 세포를 배양하면서 멜라닌 양의 감소에 관여하는, 작은 크기 줄기세포들의 분비 단백질을 조사하였다(도 12). 이 때, 배양액 속에 분비된 650 단백질들을 풀문 어세이(Fullmoon assay) 방법을 이용하여 분석하였다.

그 결과를 하기 표에 나타내었다.,

[표 1]

특히, 종래 알려져 있던 단백질 외에도, 본 발명에서 직경이 8㎛이하의 작은 줄기세포로부터 CD32/Fcg Receptor II, 프로게스테론 수용체(Progesterone Receptor), 페리틴(Ferritin), 프로히비틴(Prohibitin), 라미닌B1(LamininB1), 트롬보스폰딘(Thrombospondin), C-ERB-4/HER-4 등의 단백질이 더 분비됨을 확인할 수 있었다.

그러므로, 작은 크기의 줄기세포로부터 분비되는 이러한 단백질이 보다 우수한 멜라닌 합성 저해능 및 멜라닌 분해 촉진능에 영향을 끼치는 것으로 생각된다.

실시예 9. 인공피부에서의 멜라닌 양 감소

본 발명자들은 추가로 본 발명에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포 배양액을 인공피부에 처리하여 그 결과를 관찰하였다.

그 결과, 도 13에 도시한 바와 같이, 본 발명의 8㎛ 이하의 세포 배양액을 처리한 그룹에서 배양액 처리 5일 후부터 멜라닌 색소를 나타내는 세포가 현저히 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.

이러한 결과들을 통해, 줄기세포 유래 조직의 종류에 관계없이, 8㎛ 이하의 작은 직경 크기를 가지는 줄기세포는 다양한 미백 관련 단백질을 분비하여 멜라닌 합성 저해 및 멜라닌 분해 촉진을 함께 진행함으로써 멜라닌 양 감소효과에 가장 탁월한 기능을 나타내고, 이는 종래 단순히 줄기세포의 크기별 분리 없이 그대로 배양한 경우(heterogenous)에 비하여 유난히 현저한 미백 효과를 발휘함을 알 수 있었다. 또한, 오히려 20㎛ 이상의 큰 직경 크기를 가지는 세포 배양액을 사용한 경우는 멜라닌 양 감소 효과에 그다지 유의미한 영향을 끼치지 못하는 바, 줄기세포의 미백 기능은 줄기세포의 크기에 큰 영향을 받음을 알 수 있었다.

Claims

직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 지방 유래, 혈액 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래, 신경 유래, 부신 유래, 상피 유래 및 자궁 유래의 인간조직 성체 줄기세포, 및 배아 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 이상의 줄기세포를 포함하는 미백용 화장료 조성물.
제2항에 있어서,
상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 또는 지방 유래인 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
제3항에 있어서,
상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 제대혈 유래인 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 제대혈 유래 간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배양액은 기본 배지로 K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium) 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액은 멜라닌 생성세포(melanocyte)에서의 멜라닌 합성을 저해하여 멜라닌 발현량을 감소시키면서, 합성된 멜라닌을 분해시키는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 멜라닌 생성세포는 멜란-에이(Melan-a) 세포 또는 B16F1 세포인 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 과다색소침착 질환(hyperpigmentation disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 또는 지방 유래인 것을 특징으로 하는 과다색소침착 질환(hyperpigmentation disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제10항에 있어서,
상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 제대혈 유래인 것을 특징으로 하는 과다색소침착 질환(hyperpigmentation disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제11항에 있어서,
상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 제대혈 유래 간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 과다색소침착 질환(hyperpigmentation disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 배양액은 기본 배지로 K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium) 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 과다색소침착 질환(hyperpigmentation disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
직경 8㎛이하의 작은 줄기세포를 α-MEM(Minimal Essential Medium) 배지에서 컨플루언스가 80~90% 정도로 증식될 때까지 배양하고 세척한 후, K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium) 배지에서 20~25시간 동안 추가 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항 또는 제9항의 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 배양액의 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 세척은 PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 제1항 또는 제9항의 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 배양액의 제조방법.