KR102178778B1 - 피부줄기세포 배양액을 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
피부줄기세포 배양액을 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물, 이의 제조방법, 및 이의 용도를 제공한다.
Description
줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 함유하는 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
피부 주름 생성을 포함한 피부노화 과정은 일반적으로 내인성 노화 (intrinsic aging)와 광노화 (photoaging)에 의해 일어난다. 내인성 노화는 시간이 지남에 따라 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되어 일어난다. 외인성 노화는 오존층 파괴로 인하여 태양 광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하게 되고 환경 오염이 더욱 심화됨에 따라, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가되고, 탄력이 감소될 뿐 아니라, 기미, 주근깨 및 검버섯 또한 증가하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다.
피부는 표피층, 진피층, 피하지방층의 순서로 구성되며, 표피층는 외부로부터 순서대로 각질층, 과립층, 유극층, 기저층으로 구분되며, 표피층의 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하고 표피세포 사이의 세포간 지질들은 모르타르와 같은 역할로 작용하여 피부 장벽을 구성한다. 또한, 건강한 사람의 표피세포에는 고농도의 자연 보습 인자 (Natural Moisturing Factor: NMF)가 존재하여 피부의 수분 보유를 돕는데, 예를 들면 아미노산과 같은 물질은 수용성이기 때문에 효과적으로 수분과 결합하여 피부에서 수분이 건조되는 것을 억제한다.
그러나, 요즘과 같이 환경의 변화나 생활 패턴의 변화에 따른 냉/난방의 인위적인 온도 조절, 사회 생활에서 발생되는 각종 스트레스와 환경 오염으로 인한 피부 스트레스, 화장 습관에 따른 잦은 세안 및 연령 증가에 따른 자연적인 피부 노화 등의 여러 가지 원인으로 인하여 표피층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠게 되며 피부가 촉촉함을 잃어 생기가 없어 보이는 등의 현상이 발생하기 때문에 피부 보습제의 필요가 증가하고 있다. 또한 외부로부터 받는 과도한 물리적, 화학적 자극, 자외선, 스트레스 및 영양 결핍 등은 피부의 정상 기능을 저하시키고 탄력 손실, 표피화, 주름 생성 등의 피부 노화 현상을 촉진시키게 되는데, 특히 자외선에 의해 표피층 및 진피층은 심하게 손상을 받는다.
진피는 섬유아세포 (fibroblast)가 있어 콜라겐, 엘라스틴 등의 단백질과 여러 가지 뮤코 다당류 (mucopolysaccharide)를 생산하여 세포외기질 (extra cellular matrix: ECM)을 형성하고 있으며, 적절한 분해 과정을 통해 조직의 흡수와 재형성이 일어난다. 인간의 체내에서는 콜라겐의 분해와 합성이 반복되는데 나이가 들어감에 따라 균형이 붕괴되어 합성보다는 분해가 더욱 많아지게 된다. 노년기에는 타입 Ⅰ 콜라겐의 전사 활동 및 mRNA 수준이 감소되어, 콜라겐 합성이 저하되고 피부가 얇아지며 탄력성이 감소하고 처지는 현상이 일어난다.
또한, 피부 노화는 자외선이 피부로 흡수되면서 나타나는 활성산소종 (reactive oxygen species: ROS)을 경유한 이차적 반응들에 의해 유발될 수 있다 (이희경, 2012; Afaq & Mukhtar, 2006; Bowden, 2004). 이 때, ROS는 결합 조직 성분인 콜라겐 등의 사슬 절단 및 비정상적인 교차 결합에 의해 주름 생성을 유발하며, 기질 금속단백질분해효소-1 (Matrix metalloproteinase-1: MMP-1)의 활성을 증가시켜 콜라겐 합성을 감소시키므로 노화를 가속화시키는 원인으로 작용된다 (권승빈, 2014; Fisher et al., 2002; Rhee, 1999; Torres et al. , 2003). 한편 자외선에 의한 광노화 또는 외부 자극에 의해 표피 기저층의 멜라닌생성세포 (melanocyte)에서 멜라닌의 합성과 분비가 증가하여 피부의 색이 어두워지는 색소침작 현상이 동반된다.
따라서, 자외선 및 내ㆍ외부 인자에 의해 콜라겐 합성 감소를 억제시킬 수 있고, ROS에 의한 피부 노화를 억제시킬 수 있으며, 피부 재생을 촉진할 수 있는 물질을 발굴하는 것이 중요하다고 할 수 있다.
일 양상은 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
일 양상은 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
다른 양상은 상기한 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부 재생을 촉진 또는 피부 노화를 예방 또는 개선시키는 방법을 제공한다.
일 양상은 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 "화장료 조성물"은 인체를 청결, 미화하여 매력을 더하고 용모를 밝게 변화시키거나 피부, 모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위하여 인체에 사용되는 물품을 의미한다. 상기 화장료 조성물은 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선 효과를 갖는 기능성 화장품인 것일 수 있다.
피부는 표피층, 진피층 및 피하지방층으로 구성된다. 표피층의 가장 아랫 부분에는 기저층 (base layer)이 위치하며, 새로운 표피세포 (keratinocyte, 피부조직세포 또는 각질형성세포)는 세포 분열을 통해 이 기저층에서 형성되고, 형성된 표피세포는 표피층 상부의 죽은 세포들을 계속해서 대체한다. 이러한 과정은 피부세포의 재생을 유도한다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 표피층, 예를 들면 기저층을 구성하는 세포인 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 표피세포의 전구세포인 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 이의 분화능 및 자기재생능이 줄기세포에 비하여 제한된 세포인 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 줄기세포 유래 표피전구세포, 분화된 피부전구세포, 분화된 표피세포, 피부줄기세포 또는 표피줄기세포와 호환적으로 사용될 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 케라틴 5 (keratin 5: Krt5), 케라틴 1 (keratin 1: Krt1) 및 케라틴 14 (keratin 14: Krt14)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 발현되는 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 줄기세포에 비하여 케라틴 5, 케라틴 1 및 케라틴 14로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현이 증가한 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 분화 정도에 따라 Krt10 및/또는 IVL를 다량으로 발현하는 분화 후기에 도달하지 않은 상태로 분화되는 것일 수 있다. 상기 발현은, 예를 들면 실시간 중합효소 연쇄 반응법 (real-time PCR: RT-PCR), 또는 면역블롯 (Immunoblot: IB)과 같은 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 일정한 크기의 원형의 특이적인 형태를 나타내는 것일 수 있다.
상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하는 과정 중 또는 배양한 후 수득된, 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물 또는 이의 상층액인 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하는 과정 중 또는 배양한 후 수득된, 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물 또는 이의 상층액의 농축물 또는 이의 동결건조물인 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 줄기세포 유래 피부전구세포가 배양되는 과정 중에 세포간에 상호작용을 통해서 유용한 단백질을 생산 및 세포 밖으로 분비하는 세포 유래 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 단백질은 사이토카인, 성장인자 등의 유용한 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 하기 도 6에 기재된 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 트롬보스폰딘 (Thrombospondin: TSP), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 1 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 1: TIMP1), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 2 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 2: TIMP2), 엑토디스플라신-A2 (Ectodysplasin-A2: EDA-A2), X-연관 엑토디스플라신-A 수용체 (X-linked ectodysplasin-A receptor: XEDAR), 안지오포이에틴-1 (Angiopoietin-1), 스팍 (secreted protein acidic and rich in cysteine: SPARC), 상피세포성장인자 유사 및 두 폴리스타틴 유사 도메인 1을 갖는 막관통 단백질/토모레굴린-1 (Transmembrane protein with EGF-like and two Follistatin-like domains 1/ Tomoregulin-1: TMEFF1/Tomoregulin-1), 니도겐-1 (Nidogen-1), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3 (Insulin-like growth factor-binding protein-3: IGFBP-3), 트롬보스폰딘-2 (Thrombospondin-2), 종양 괴사 인자-관련 활성 유도 사이토카인 (TNF-related activation-induced cytokine: TRANCE), 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha: IL-15R 알파)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 트롬보스폰딘 (Thrombospondin: TSP), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 2 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 2: TIMP2), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 1 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 1: TIMP1), 엑토디스플라신-A2 (Ectodysplasin-A2: EDA-A2) X-연관 엑토디스플라신-A 수용체 (X-linked ectodysplasin-A receptor: XEDAR), 안지오포이에틴-1 (Angiopoietin-1), 스팍 (secreted protein acidic and rich in cysteine: SPARC), 상피세포성장인자 유사 및 두 폴리스타틴 유사 도메인 1을 갖는 막관통 단백질/토모레굴린-1 (Transmembrane protein with EGF-like and two Follistatin-like domains 1/ Tomoregulin-1: TMEFF1/Tomoregulin-1), 니도겐-1 (Nidogen-1), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3 (Insulin-like growth factor-binding protein-3: IGFBP-3), 트롬보스폰딘-2 (Thrombospondin-2), 종양 괴사 인자-관련 활성 유도 사이토카인 (TNF-related activation-induced cytokine: TRANCE), 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha: IL-15R 알파)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 농도를 약 10 pg/㎖ 이상, 약 15 pg/㎖ 이상, 또는 약 20 pg/㎖ 이상으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 그루초 (groucho: GRO), 잠재성 TGF-베타 결합 단백질 (latent TGF-beta binding protein 1: latent TGF-beta bp1), 크로스베인리스-2 (Crossveinless-2: CV-2), 스매드4 (Smad4), 인터루킨-8 (interleukin-8: IL-8), 액티빈 C (Activin C) 및 액티빈 A (Activin A)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 미분화 줄기세포 배양액에 비하여, C-C 케모카인 수용체 타입 4 (C-C chemokine receptor type 4: CCR4), 과립구 주화성 단백질 (granulocyte chemotactic protein-2: GCP-2)/ 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 6 (chemokine (C-X-C motif) ligand 6: CXCL6), 엔도칸 (Endocan), P-셀렉틴 (P-selectin), C-C 케모카인 수용체 타입 5 (C-C chemokine receptor type 5: CCR5), 란테스 (Regulated on Activation, Normal T Cell Expressed and Secreted: RANTES) 및 신경 아교 세포계 유도 신경 영양 인자 (Glial cell line-derived neurotrophic factor: GDNF)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 0.1% 이하, 0.01% 이하 또는 0.005% 이하의 농도로 포함되거나 또는 포함되지 않은 것일 수 있다.
상기 조성물은 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 활성 성분 또는 유효 성분으로 포함하는 것일 수 있다. "활성 성분 또는 유효 성분"이란 본 명세서에서 언급된 기능을 수행하는 것을 의도한 것이며, 불순물로 소량으로 포함되어 있어서 상기 기능을 수행하지 않은 것을 제외한다.
상기 조성물은 피부 주름을 예방 또는 개선하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 피부 탄력성을 증가시키기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 피부 광노화, 또는 색소침착을 예방 또는 개선하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 피부 재생을 위한 것일 수 있다. 싱기 조성물은 피부 조직의 형성 또는 재생을 촉진하기 위한 것일 수 있다.
주름은 피부의 탄력성이 상실되어 느슨해진 상태을 의미하며, 예를 들면 피부가 접히는 것일 수 있다. 색소침착은 체내에 있는 색소의 양이 비정상적인 경우 또는 색소가 나타나는 장소에 이상이 있는 상태를 의미하며, 예를 들면 기미 및 주근깨 등인 것일 수 있다. 광노화는, 자외선, 예를 들면 자외선 A, 자외선 B 및 자외선 C 등에 의하여, 콜라겐 및 엘라스틴이 부족하여 피부 탄력이 감소하거나, 피부 윤기가 감소하거나, 피부에 피지선이 과형성되거나, 피부가 건조해지거나, 또는 피부가 두꺼워지면서 거칠어지는 상태를 의미한다.
용어 "예방"은 상기 조성물의 투여로 피부 광노화, 색소침착, 또는 주름을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 용어 "개선"은 상기 조성물의 투여로 피부 광노화, 색소침착, 또는 주름이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 조성물은 세포 중 콜라겐 합성을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 조성물은 콜라겐 예를 들면, 프로콜라겐 타입 Ⅰ 유전자의 발현, 즉 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 조성물은 콜라겐 예를 들면, 프로콜라겐 타입 Ⅰ C-말단 단백질의 분비량을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 조성물은 항산화 활성을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 조성물은 활성산소종 (reactive oxygen species: ROS) 생성을 억제하여 항산화 활성을 증가시키는 것 일 수 있다.
상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 줄기세포가 분화된 것일 수 있다.
용어 "줄기세포"는 분화능 (potency) 및 자기재생 (self-renewal)능을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화 능력에 따라 전분화능 (pluripotency), 다분화능 (multipotency) 또는 단일분화능 (unipotency)로 나누어진다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cell: ESC)(착상 전 배아의 내세포), 성체줄기세포 (adult stem cell) (각 조직 및 장기에 존재하는 미분화된 세포) 및 역분화 줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC)(체세포에 유전자 및/또는 단백질을 삽입하여 역분화가 유도된 세포, 또는 유도만능 줄기세포)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것일 수 있다. 용어 "중간엽 줄기세포 (Mesenchymal sterm cell: MSC)"는 성체 줄기세포로서, 다분화능과 자기재생능을 갖고, 증식능이 우수하고 유전적으로 안정화되어 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 연골, 뼈, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포이며, 다양한 세포 예를 들면, 지방세포, 연골세포, 피부세포 및 골세포 등으로 분화할 수 있다. 상기 줄기세포는 분화능과 자기재생능을 갖는 것이라면, 그 종류 및 유래가 제한되지 아니한다. 상기 줄기세포는, 예를 들면, 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 분리된 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수로부터 유래한 것일 수 있다. 용어 "분리된"은 자연적으로 발생하는 세포 또는 조직의 환경과는 다른 환경에 존재하는 것을 의미한다.
용어 "탯줄 (umbilical cord)"은 포유류의 태아가 태반에서 성장할 수 있도록 모체와 배를 연결해주는 줄을 의미하며, 일반적으로 와튼 젤리로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉, 2개의 배꼽 동맥과 1개의 배꼽 정맥으로 구성된 조직인 것일 수 있다. 용어 "태반 (placenta)"은 포유류의 임신 중에 태아를 위해 만들어지는 기관을 의미하며, 태반의 한쪽은 모체와 닿아 있고 다른 한쪽은 태아와 맞닿아 있으며 그 사이 공간에 모체의 혈액이 담겨 있어 태아에게 영양분을 공급하는 것일 수 있다. 태반은 양막, 융모막, 탈락막의 3층으로 구성되어 있다. 양막은 태아를 둘러싸고 있는 얇고 투명한 막으로, 양수가 들어 있으며, 양수 및/또는 양막에는 태아의 줄기세포가 존재한다. 탈락막은 수정란이 자궁에 착상되기 위해 자궁의 상피세포가 변형되어 형성된 막으로써 모체의 줄기세포가 존재한다. 융모막은 태아나 양수를 둘러싸고 있는 양막과 탈락막 사이에 있는 막으로, 수정란에서 발생하여 난막의 일부를 구성한다. 태반 유래 줄기세포는 태아 또는 모체에서 유래한 것일 수 있다. 양수 유래 줄기세포는 태아에서 유래한 것일 수 있다. 탯줄 또는 태반로부터 유래된 줄기세포는 그 양이 아주 풍부하며 증식이 잘되고 다른 세포로 분화도 가능하다. 용어 "골수 (bone marrow)" 는 적혈구, 백혈구 및 혈소판 등을 포함하는 혈액 세포를 만드는 조직을 의미한다. 용어 "제대혈 (cord blood)"은 분만 후 신생아의 탯줄에서 나온 혈액을 의미한다. 용어 "지방"은 체지방을 의미하며, 지방으로부터 유래된 줄기세포는 수득이 용이하고, 지방 세포의 1% 정도가 줄기세포로 추정되므로 수득률이 높다.
상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 상기 화장료 조성물 총 부피에 대하여 약 0.01% 내지 약 60%로 포함되는 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 상기 화장료 조성물 총 부피에 대하여 약 0.01% 내지 약 60%, 약 0.02% 내지 약 50%, 약 0.05% 내지 약 30%, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.2% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 17%, 약 0.5% 내지 약 16%, 약 0.6% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 1% 내지 약 13%, 약 2% 내지 약 12%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 7%, 약 4% 내지 약 6% 또는 약 5%인 것일 수 있다.
상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은, 줄기세포를 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 분화 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계; 상기 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물을 생성시키는 단계; 및 상기 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물로부터 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 회수하는 단계;를 거쳐 수득된 것일 수 있다. 상기 단계는 아래의 방법에서 자세히 설명한다.
다른 양상은 줄기세포를 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 분화 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계; 상기 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물을 생성시키는 단계; 및 상기 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물로부터 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 회수하는 단계;를 포함하는 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 분리된 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 분리된 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수는 통상의 해부학적 방법에 의하여 수득될 수 있다. 상기 분리된 탯줄, 태반, 양수 또는 제대혈은 산모의 모체로부터 출산 후 분리된 탯줄, 태반, 양수 또는 제대혈인 것일 수 있다. 상기 분리된 탯줄, 태반, 양수 또는 제대혈은 분리된 후 신속하게 멸균된 용기 및 얼음에 담아 보관될 수 있다. 상기 태반의 경우 예를 들면, 태반 내에 존재하는 태반 조직들을 멸균된 가위로 여러 부위로 잘라냄으로써 얻을 수 있다. 상기 탯줄의 경우 예를 들면, 탯줄을 태반으로부터 분리하고 멸균된 가위로 여러 부위로 잘라냄으로써 얻을 수 있다. 상기 지방의 경우 예를 들면, 복부 또는 허벅지의 피하지방층에서 지방흡인 (liposuction)을 수행함으로써 얻을 수 있다. 얻어진 태반 조직, 탯줄 또는 지방은 항생제, 예를 들면, 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 또는 이들의 조합이 포함된 인산염 완충 식염수 (phosphate buffered saline: PBS)로, 1회, 2회 또는 3회 이상 세척함으로써, 조직에 존재하는 혈액 등의 오염 물질들을 제거할 수 있다. 상기 태반, 탯줄 또는 지방은 직접 효소와 반응시키거나, 또는 멸균된 가위 등을 사용하여 더 잘게 세절한 후, 세절된 세포를 효소와 반응시킬 수 있다.
상기 방법은 줄기세포를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 줄기세포를 수득하는 방법은 통상의 기술자에게 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 탯줄 또는 태반의 경우, 예를 들면, 상기 분리된 탯줄 또는 태반을 배양 용기에 부착하여 5 내지 20일, 10 내지 20일, 또는 10 내지 15일 배양하는 단계; 상기 배양된 탯줄 또는 태반에서 세포가 뻗어나오는 것을 확인하는 단계; 및/또는 탯줄 또는 태반과 분리 효소를 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 또는, 탯줄 또는 태반의 경우, 예를 들면, 상기 분리된 탯줄 또는 태반과 분리 효소를 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 분리 효소는 콜라게나아제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 콜라게나아제는 콜라겐의 펩티드 결합을 파괴하는 효소를 의미하며, 콜라게나아제 타입 I, 타입 II, 타입 III, 타입 IV 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 분리 효소는 10 U/㎖ 내지 4000 U/㎖, 20 U/㎖ 내지 2000 U/㎖, 50 U/㎖ 내지 800 U/㎖, 100 U/㎖ 내지 400U/㎖, 150 U/㎖ 내지 300U/㎖, 또는 200 U/㎖의 콜라게나아제를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 분리 효소는 트립신 (trypsin), 디스파아제 (Dispase) 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 분리 효소를 포함하는 용액은 콜라게나아제, 트립신, 디스파아제 또는 이들의 조합을 포함하는 물, 염수 (saline), 예를 들면, HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 탯줄 또는 태반과 분리 효소를 반응시키는 단계는 진탕 또는 정치하여 수행될 수 있다. 상기 진탕 또는 정치는 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 35℃ 내지 약 40℃, 또는 약 37℃에서 수행될 수 있고, 1 내지 20시간, 2 내지 10시간, 4 내지 9시간, 또는 5 내지 6시간 동안 수행될 수 있다. 지방의 경우, 예를 들면, 상기 분리된 지방과 분리 효소를 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 분리 효소는 콜라게나아제, 트립신, 디스파아제 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 분리 효소를 포함하는 용액은 콜라게나아제, 트립신, 디스파아제 또는 이들의 조합을 포함하는 물, 염수, 예를 들면, HBSS를 포함하는 것일 수 있다. 상기 지방과 분리 효소를 반응시키는 단계는 진탕 또는 정치하여 수행될 수 있다.
추가적으로, 상기 태반, 탯줄 또는 지방과 분리 효소를 반응시킨 후에, 분리 효소를 불활성화하기 위한 과정을 수행할 수 있으며, 예를 들면, 혈청을 첨가하여 효소 반응을 정지시킬 수 있다. 상기 태반, 탯줄 또는 지방과 분리 효소를 반응시킨 후에, 태반, 탯줄 또는 지방 유래 줄기세포를 얻는 방법은 통상의 기술자에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들면 원심분리한 후, 세포체 (strainer)를 사용하여 세포를 분리하여 수행될 수 있다.
상기 방법은 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계 전에, 수득된 줄기세포를 혈청을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 혈청은 우태혈청 (fetal bovine serum: FBS), 우아혈청 (bovine calf serum: BCS) 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 혈청은 분화 배지의 총 부피에 대하여 약 1% 내지 약 50%, 약 2% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 약 7.5% 내지 약 12.5%, 또는 약 10%인 것일 수 있다. 상기 배지는 섬유아세포성장인자-4 (fibroblast growth factor-4: FGF-4) 및/또는 헤파린을 포함하는 것일 수 있다. 상기 배지 중 FGF-4의 농도는 약 10 ng/㎖ 내지 약 40 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 약 30 ng/㎖, 또는 약 25 ng/㎖인 것일 수 있다. 상기 배지 중 헤파린의 농도는 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 2 ㎍/㎖, 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 1.5 ㎍/㎖, 또는 약 1 ㎍/㎖인 것일 수 있다. 상기 배지는 항생제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 항생제는 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 배지 중 항생제의 농도는 약 10㎍/㎖ 내지 약 250㎍/㎖, 약 25㎍/㎖ 내지 약 100㎍/㎖, 약 40㎍/㎖ 내지 약 65㎍/㎖, 또는 약 50㎍/㎖인 것일 수 있다.
상기 방법은 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계 전에, 줄기세포를 혈청을 포함하는 배지에서 10 내지 350시간 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양은 10 내지 350시간, 20 내지 170시간, 또는 50 내지 70시간, 또는 0.5 내지 14일, 1일 내지 7일, 또는 2 내지 3일 동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 배양은 분리된 줄기세포를 P0으로 하는 것일 수 있다. 상기 배양의 계대수는 특별히 제한되는 것은 아니며, 원하는 증식 세포의 수에 따라 적절히 계대수를 선택할 수 있다. 상기 배양의 계대수는 1 내지 20계대, 2 내지 10계대, 3 내지 7계대, 또는 4 내지 5계대 수행함으로써 필요한 수의 누적 증식 세포를 얻을 수 있다.
상기 방법은 상기 줄기세포를 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 분화 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 줄기세포는 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 분화 배지에서 배양되어 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화될 수 있다.
용어 "분화 (differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화되는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 의미한다. 특정 세포 유형으로의 분화 정도를 측정 또는 판단하는 것은 당해 분야에 익히 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 분화는 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표면 표지 (예를 들면, 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 세포 형태의 변화를 측정하면서, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포 형태를 조사함으로써, 또는 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR) 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다.
상기 줄기세포는 주변 미세 환경에 따라 세포 분열, 분화 또는 이동하는 등 행동 양상이 달라질 수 있다. 상기 줄기세포는 주변 미세 환경으로부터 오는 자극에 의해 유전자 발현 양상이 달라질 수 있으며, 이에 따라 분화되는 세포가 달라질 수 있다.
상기 분화 배지는 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 것일 수 있다. 아스코르브산 (ascorbic acid)은 항산화 특성을 가지는 유기 화합물로, 비타민 C의 일종이며, 수용성이고, 분자식은 C6H8O6을 갖는다. 상기 아스코르브산은 L-아스코르브산인 것일 수 있다. 상기 아스코르브산은, 아스코르브산 또는 이의 염의 형태인 것일 수 있다. 상기 아스코르브산의 염은 무기산염, 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염인 것일 수 있으며, 예를 들면 염산염, 질산염, 황산염 등의 무기산염, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염 등일 수 있고, 예를 들면 L-아스코르브산나트륨, L-아스코르브산마그네슘, L-아스코르브산칼륨, L-아스코르브산칼슘 등의 L-아스코르브산염인 것일 수 있다. 상기 아스코르브산은 줄기세포 유래 피부전구세포의 증식 및 기저막 형성 (basement membrane formation)에 영향을 줄 수 있다. 배지 중에 상기 아스코르브산의 농도는 약 0.03 μM 내지 약 3μM, 약 0.05 내지 약 2 μM, 약 0.1 내지 약 1 μM, 또는 약 0.1 μM 내지 약 0.5 μM인 것일 수 있다.
상기 히드로코르티손 (hydrocortison)은 부신 피질 호르몬의 일종이며, 분자식 C21H30O5 를 갖는다. 상기 히드로코르티손은, 히드로코르티손 또는 이의 염의 형태인 것일 수 있다. 상기 히드로코르티손의 염은 산 부가염인 것일 수 있으며, 예를 들면 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등의 무기산염, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산 등의 무독성 유기산 등인 것일 수 있다. 히드로코르티손은 피부전구세포로의 분화능을 자극하는 인자로서, 작게는 지질 합성 (lipid synthesis)과 세포막 (plasma membrane) 구성에 역할을 하며, 표피층의 윗 부분에 위치하는 각질층 형성을 촉진시킬 수 있다. 배지 중에 상기 히드로코르티손의 농도는 약 0.05㎍/㎖ 내지 약 5㎍/㎖, 약 0.075㎍/㎖ 내지 약 3.5㎍/㎖, 약 0.1㎍/㎖ 내지 약 2.5㎍/㎖, 약 0.2㎍/㎖ 내지 약 1.25㎍/㎖, 약 0.3㎍/㎖ 내지 약 1㎍/㎖, 또는 약 0.4㎍/㎖ 내지 약 0.6㎍/㎖인 것일 수 있다.
상기 분화 배지는 세포 배양에 이용될 수 있는 것이라면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMaxⅡ complete 배지, EBM-2 Basal 배지, Chang's Medium 및 MesenCult-XF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 분화 배지는 혈청을 포함하는 것일 수 있다. 상기 혈청은 우태혈청 (fetal bovine serum: FBS), 우아혈청 (bovine calf serum: BCS) 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 혈청은 분화 배지의 총 부피에 대하여 약 1% 내지 약 50%, 약 2% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 또는 약 7.5% 내지 약 12.5%인 것일 수 있다.
상기 방법은 줄기세포를 분화 배지에서, 120 내지 600시간, 150 내지 500시간, 180 내지 450시간, 또는 200 내지 300시간, 또는 5 내지 25일, 6 내지 21일, 7 내지 18일, 8 내지 15일, 또는 9 내지 12일 동안 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 이의 분화능 및 자기재생능이 줄기세포에 비하여 제한된 세포인 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 분화 배지에서 배양하기 전의 줄기세포에 비하여 케라틴 5 (keratin 5: Krt5), 케라틴 1 (keratin 1: Krt1) 및 케라틴 14 (keratin 14: Krt14)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현이 증가한 것일 수 있다. 즉 상기 줄기세포가 피부전구세포로 분화하면서 Krt5, Krt1 및 Krt14로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현이 증가할 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 분화 정도에 따라 Krt10 및/또는 IVL를 다량으로 발현하는 분화 후기에 도달하지 않은 상태로 분화되는 것일 수 있다. 상기 증가는 유전자의 발현, 즉 mRNA 양 및/또는 단백질 양이 2배 이상, 4배 이상, 8배 이상, 10배 이상, 또는 20배 이상 증가한 것일 수 있다.
상기 방법은 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물을 생성시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양은 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 계대 배양 없이 배양하여 수행될 수 있다. 상기 배지는 단백질 생산에 적합한 배지로서, 줄기세포 유래 피부전구세포가 배양되는 과정 중에 세포간에 상호작용을 통해서 유용한 단백질을 생산 및 세포 밖으로 분비할 수 있는 배지를 의미한다. 상기 배지는 무혈청 배지인 것일 수 있다. 상기 배지는 콜린 클로리드 (choline chloride), 페놀 레드 (phenol red, 또는 페놀술포프탈레인) 또는 이들의 조합을 포함하지 않는 배지인 것일 수 있다. 상기 배지는 세포 배양에 이용될 수 있는 것이라면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMaxⅡ complete 배지, EBM-2 Basal 배지, Chang's Medium 및 MesenCult-XF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서, 10 내지 350 시간, 15 내지 200시간, 20 내지 170시간, 또는 40 내지 80시간, 또는 0.5 내지 15일, 1 내지 8일, 1.5 내지 4일, 또는 2 내지 3일 동안 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물을 생성시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물은 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하는 과정 중 또는 배양한 후 수득된, 배지, 분화된 피부전구세포, 또는 이의 혼합물을 의미하는 것일 수 있다.
상기 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포는 배지에서 배양되면서 세포간 상호작용을 통하여 세포 밖으로 피부전구세포 유래 단백질을 분비할 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 주변 환경으로부터 오는 자극에 의해 유전자 발현 양상이 달라질 수 있으며, 이에 따라 줄기세포 유래 피부전구세포로부터 분비되는 단백질의 종류 및 이의 양도 달라질 수 있다. 상기 자극은 줄기세포 유래 피부전구세포가 배양되는 배지 및/또는 배양 시간을 포함하는 것일 수 있다. 즉 배양되는 배지 및/또는 배양 시간에 따라 줄기세포 유래 피부전구세포에서 분비하는 단백질의 종류 및 이의 양이 달라질 수 있고, 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 내에 존재하는 단백질의 조성 및 함량도 달라질 수 있다.
상기 방법은 상기 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물로부터 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 회수는 분화된 피부전구세포를 배지에서 배양하는 과정 중 또는 배양한 후 수득된, 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물 또는 이의 상층액을 그대로 수득하는 것일 수 있다. 상기 회수는 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하는 과정 중 또는 배양한 후 수득된, 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물 또는 이의 상층액을 원심분리하거나 또는 필터에 여과하여 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포 및/또는 거대 분자를 제거한 후에 수득하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 화장품학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 피부 노화를 억제, 지연 또는 개선 효과를 저해하지 않는 범위에서 통상의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 성분, 예를 들면 보습제, 분말 성분, 자외선 흡수제, 산화 방지제, 미용 성분, 당지질, 식물 추출액, 방부제, 향료, pH 조정제, 색소, 점도 조정제 또는 겔화제 등을 보조 성분으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 밀크로션, 모이스처 로션, 모이스처 크림, 핸드크림, 영양에센스, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형인 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다. 상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁화제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
다른 양상은 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 의미한다. 상기 건강기능식품은 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선 효과를 갖는 기능성 식품인 것일 수 있다.
상기 조성물은 식품학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 건강기능식품은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있다. 상기 "식품보조첨가제"는 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성 요소를 의미하며, 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 통상의 기술자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 상기 건강기능식품은 예를 들면, 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 식품보조첨가제로 포함할 수 있다. 상기 건강기능식품은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 약학적 조성물과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
줄기세포 유래 피부전구세포 배양액, 피부 재생 및 피부 노화에 대하여는 상기한 바와 같다.
다른 양상은 줄기세포를 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 분화 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계; 상기 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물을 생성시키는 단계; 및 상기 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물로부터 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 회수하는 단계;를 포함하는 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제조하는 방법을 제공한다.
줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계, 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물을 생성시키는 단계, 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 회수하는 단계에 대하여는 상기한 바와 같다.
다른 양상은 상기 화장료 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부 재생을 촉진 또는 피부 노화를 예방 또는 개선시키는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 건강기능식품을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부 재생을 촉진 또는 피부 노화를 예방 또는 개선시키는 방법을 제공한다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적 또는 간접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 피부 재생이 필요한 부위 또는 피부 노화가 존재하는 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다. 상기 투여는 예를 들면 도포에 의한 것일 수 있다. 상기 도포는 적절한 방법으로 개체의 피부에 상기 조성물을 접촉시키는 모든 방법을 의미하며, 이를 통하여 상기 조성물을 피부 내부로 흡수시킬 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부 재생을 촉진 또는 피부 노화를 예방 또는 개선시키는 것을 필요로 하는 개체일 수 있다. 상기 개체는 콜라겐 합성을 촉진시키는 것 또는 항산화 활성을 증가시키는 것을 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 방법은 조성물 총 부피에 대하여 약 0.01% 내지 약 60%, 약 0.02% 내지 약 50%, 약 0.05% 내지 약 30%, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.2% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 17%, 약 0.5% 내지 약 16%, 약 0.6% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 1% 내지 약 13%, 약 2% 내지 약 12%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 7%, 약 4% 내지 약 6% 또는 약 5%의 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 함유하는 조성물을, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 7일 이상, 1개월 이상, 3개월 이상, 6개월 이상, 또는 1년 이상, 또는 5일 내지 150일, 10일 내지 75일, 15일 내지 50일, 20일 내지 40일, 또는 25일 내지 35일 동안, 일당 1회 이상 투여하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물에 의하면, 개체의 피부 재생을 촉진하고 피부 노화를 효율적으로 예방 또는 개선시킬 수 있다. 일 양상에 따른 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물을 제조하는 방법에 의하면, 상기 단계를 반복적으로 수행하는 경우에도 유용한 단백질의 조성 및 이의 농도가 일정한 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물을 수득할 수 있어, 개체의 피부 재생을 촉진시키고 피부 노화를 효율적으로 예방 또는 개선시킬 수 있다.
도 1은 피부 유래 미분화 표피세포 (skin derived undifferentiated keratinocyte)를 표피세포로 분화시킨 후, 및 태반 유래 줄기세포 및 탯줄 유래 줄기세포를 분화 배지에서 11일 동안 피부전구세포로 분화시킨 후, 각 세포의 형태를 나타내는 도면이다.
도 2는 태반 유래 줄기세포를 분화 배지에서 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, Krt5, Krt1, IVL, Krt14, 및 Krt10의 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 3 및 4는 태반 유래 줄기세포를 분화 배지에서 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, Krt14의 단백질 수준을 측정한 결과이다.
도 5는 미분화 줄기세포 배양액에서 발현양이 높은 사이토카인 가운데 상위 22종을 나타낸 것이다.
도 6는 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액에서 발현양이 높은 사이토카인 가운데 상위 24종을 나타낸 것이다.
도 7은 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 (분화 배양액), 미분화 줄기세포 배양액 (미분화 배양액), 및 통상의 표피세포 배양액 (표피세포 배양액)에서 니도겐-1의 농도를 나타낸 것이다.
도 8은 인간 진피 섬유아세포의 배지에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고 과산화수소에 노출시킨 후, 세포의 생존 정도를 대조군에 대한 비율로 나타낸 결과이다.
도 9은 인간 진피 섬유아세포의 배지에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고 과산화수소에 노출시킨 후, 세포 내 ROS 수준을 대조군에 대한 배수로 나타낸 결과이다.
도 10는 인간 진피 섬유아세포의 배지에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고 과산화수소를 첨가한 후, 과산화수소분해효소 (catalase) 활성의 변화를 나타낸 결과이다.
도 11은 진피 배양계에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고 자외선을 조사한 후, 프로콜라겐 타입 I의 mRNA 수준을 분석한 결과이다.
도 12은 진피 배양계에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고 자외선을 조사한 후, 분비된 프로콜라겐 타입 I C-말단 펩티드의 양을 측정한 결과이다.
도 13은 분화된 피부전구세포 배양액을 함유한 에센스를 도포하기 전과 후에 Antera 3D 기기를 이용하여, 피부 주름 및 피부 질감을 측정한 결과를 나타낸다.
도 14는 분화된 줄기세포 배양액을 함유한 에센스를 도포하기 전과 후에 피부 상태를 측정한 이미지를 나타낸다.
도 15는 태반 유래 줄기세포의 표면 항원 특성을 나타낸 결과이다.
도 2는 태반 유래 줄기세포를 분화 배지에서 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, Krt5, Krt1, IVL, Krt14, 및 Krt10의 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 3 및 4는 태반 유래 줄기세포를 분화 배지에서 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, Krt14의 단백질 수준을 측정한 결과이다.
도 5는 미분화 줄기세포 배양액에서 발현양이 높은 사이토카인 가운데 상위 22종을 나타낸 것이다.
도 6는 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액에서 발현양이 높은 사이토카인 가운데 상위 24종을 나타낸 것이다.
도 7은 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 (분화 배양액), 미분화 줄기세포 배양액 (미분화 배양액), 및 통상의 표피세포 배양액 (표피세포 배양액)에서 니도겐-1의 농도를 나타낸 것이다.
도 8은 인간 진피 섬유아세포의 배지에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고 과산화수소에 노출시킨 후, 세포의 생존 정도를 대조군에 대한 비율로 나타낸 결과이다.
도 9은 인간 진피 섬유아세포의 배지에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고 과산화수소에 노출시킨 후, 세포 내 ROS 수준을 대조군에 대한 배수로 나타낸 결과이다.
도 10는 인간 진피 섬유아세포의 배지에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고 과산화수소를 첨가한 후, 과산화수소분해효소 (catalase) 활성의 변화를 나타낸 결과이다.
도 11은 진피 배양계에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고 자외선을 조사한 후, 프로콜라겐 타입 I의 mRNA 수준을 분석한 결과이다.
도 12은 진피 배양계에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고 자외선을 조사한 후, 분비된 프로콜라겐 타입 I C-말단 펩티드의 양을 측정한 결과이다.
도 13은 분화된 피부전구세포 배양액을 함유한 에센스를 도포하기 전과 후에 Antera 3D 기기를 이용하여, 피부 주름 및 피부 질감을 측정한 결과를 나타낸다.
도 14는 분화된 줄기세포 배양액을 함유한 에센스를 도포하기 전과 후에 피부 상태를 측정한 이미지를 나타낸다.
도 15는 태반 유래 줄기세포의 표면 항원 특성을 나타낸 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 줄기세포 유래
피부전구세포
배양액 제조 및 피부 노화 억제 효과의 확인
1. 줄기세포 유래
피부전구세포
배양액 제조
(1) 태반 유래 줄기세포로부터
피부전구세포로의
분화
정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 정상 태반 분만시에 수집된 태반으로부터 탯줄을 분리하였다. 분리된 태반 및 탯줄 각각을 Ca/Mg를 함유하지 않는 (free) 둘베코스 인산염 완충 식염수 (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline: DPBS)로 2 내지 5회 세척하여 혈액을 제거하였다. 이후, 태반 조직을 1 내지 5 mm 정도 크기로 잘라내었다. 또한, 탯줄에서 동맥과 정맥을 제거한 뒤 1 내지 5 mm 정도 크기로 탯줄을 잘라내었다. 이후, 상기 태반 및 탯줄 각각을 배양 용기에 부착하여 10 내지 15일 배양을 하였고, 상기 배양된 조직에서 세포가 뻗어나오는 것을 확인한 후, 5 내지 6시간 동안 200 U/㎖의 콜라게나아제 I을 첨가하여 태반 유래 줄기세포 및 탯줄 유래 줄기세포를 각각 분리하였다.
태반 유래 줄기세포가 중간엽 줄기세포의 특성을 나타내는지 확인하기 위하여, 표면 단백질 분석을 위해 유세포 분석을 수행하였다. 세포를 DPBS를 사용하여 세척하고, 2%의 FBS가 함유된 DPBS에 담아 CD44, CD73, CD90, CD105, CD45, CD34, CD31, CD29, CD49, CD9, HLA-ABC, 및 HLA-ER 항체와 약 20분간 반응시켰다. 이 후, 유세포 분석기 (FACS Calibur, Becton Bickinson)를 통해 표면 항원 특성을 분석하였다. 도 15는 태반 유래 줄기세포의 표면 항원 특성을 나타낸 결과이다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 태반 유래 줄기세포에서 CD44, CD73, CD90, CD105, CD29, CD49, CD9 및 HLA-ABC의 발현양이 높게 나타난 것으로부터, 상기 태반 유래 줄기세포가 중간엽 줄기세포의 성격을 갖는 것을 알 수 있다.
상기 분리된 세포를 100 내지 5,000 세포/cm2의 농도로 멀티 플라스크 (multi-flask)에 접종하고, 상기 세포를 P0으로하여, 25 ng/㎖의 섬유아세포성장인자-4 (fibroblast growth factor-4: FGF-4), 1 ㎍/㎖의 헤파린, 50 ㎍/㎖의 겐타마이신, 및 10%의 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum: FBS)이 함유된 MEM alpha GlutaMAX (PS-CM) 배지에서, 37℃, 5%의 CO2의 조건에서, 2일 동안, 5계대 동안 계대 배양하였다.
이후, 배양된 세포에, DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배지와 0.3μM의 아스코르브산 (ascorbic acid), 0.5㎍/㎖의 히드로코르티손 (hydrocortison) 및 10%의 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum: FBS)을 함유하는 분화 배지를, 멀티 플라스크에 5㎖/cm2가 되도록 첨가하고, 37℃, 5%의 CO2의 조건에서 11일 동안 배양하였다. 대조군은 아스코르브산 및 히드로코르티손을 함유하지 않는 배지에서 배양한 것을 사용하였다.
도 1은 피부 유래 미분화 표피세포를 표피세포로 분화시킨 후, 및 태반 유래 줄기세포 및 탯줄 유래 줄기세포를 분화 배지에서 11일 동안 피부전구세포로 분화시킨 후, 각 세포의 형태를 나타내는 도면이다. 태반 유래 줄기세포 및 탯줄 유래 줄기세포 각각은 분화 배지에서 피부전구세포의 형태와 유사한 작고 일정한 크기의 원형의 세포 모양으로 분화하였다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 태반 유래 줄기세포 및 탯줄 유래 줄기세포는 분화 배지에서 배양된 후 피부전구세포의 형상를 나타냄을 알 수 있다.
(2) 분화된
피부전구세포에서
유전자 발현 확인
(2.1) 실시간 중합효소 연쇄 반응법 (real-time
PCR
: RT-
PCR
) 분석
(1)의 태반 유래 줄기세포를 피부전구세포로 분화시키는 과정 중에, 중기 및 말기 단계에 발현하는 유전자인 Krt5, Krt1, IVL, Krt14, 및 Krt10의 발현 수준을 RT-PCR로 측정하였다.
태반 유래 줄기세포를 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, 세포를 수득하고 페놀/클로로포름을 사용하여 세포로부터 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하였다. cDNA의 유전자 발현 정도는 Applied Biosystems 700 서열 검출 시스템 (Foster City, CA, USA) 상에서, RT-PCR로 분석하였다. 이 때, 합성된 cDNA, 하기 표 1에 기재된 Krt5, Krt1, IVL, Krt14, 및 Krt10 각각에 특이적인 프라이머 세트, 2 x TaqMan 마스터 혼합물 및 20 x premade TaqMan 유전자 발현 분석 (Applied Biosystems) 키트를 이용하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 10분, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분, 40회 반복. Krt5, Krt1, IVL, Krt14, 및 Krt10의 mRNA 수준을 인간 글리세르알데히드-3-인산디히드로게나아제 (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase: GAPDH) 수치로 정규화하였다.
| 유전자명 | 정방향 프라이머 | 역방향 프라이머 |
| Krt5 | GTC TCG CCA GTC AAG TGT GT (서열번호 1) |
GAC ACG GAG GTG AAG CTG (서열번호 2) |
| Krt1 | GGG TGG TTA TGG TCC TGT CT (서열번호 3) |
GGA TCT CAG GGT CAA TCT CC (서열번호 4) |
| IVL | CCA GGT CCA AGA CAT TCA AC (서열번호 5) |
ACT GCG GGT GGT TAT TTA TG (서열번호 5) |
| Krt14 | GAG CAG CAG AAC CAG GAG T (서열번호 7) |
GAG AAC TGG GAG GAG GAG AG (서열번호 8) |
| Krt10 | ACT ACT CTT CCT CCC GCA GT (서열번호 9) |
TGA GCT AAA TCC TCC ACC AA (서열번호 10) |
도 2는 탯줄 유래 줄기세포를 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, Krt5, Krt1, IVL, Krt14, 및 Krt10 유전자의 발현 수준을 측정한 결과이다. Y축은 인간 GAPDH로 정규화된 상기 유전자의 발현양을 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 분화가 진행되면서 5일 이후 피부전구세포의 분화 단계에서 중기에 발현하는 Krt14의 mRNA 수준이 증가하였다.
(2.2)
면역블롯
(
Immunoblot
:
IB
)
(1)의 태반 유래 줄기세포를 피부전구세포로 분화시키는 과정 중에, 중기 단계에 발현하는 유전자인 Krt14의 단백질 수준을 면역블롯으로 측정하였다.
태반 유래 줄기세포를 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, 세포를 수득하고 수득된 세포를 세포 용해 버퍼에서 용해하였다. 상기 세포 용해 버퍼는 RIPA 버퍼 (Thermofisher) 및 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche, Inc., Indianapolis, IN, USA)을 포함하는 것을 사용하였다. 세포 용해물에 함유된 단백질을 정량하고, 각 시험군 및 대조군에 대하여 단백질 20μg을 7.5%의 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis: SDS-PAGE)으로 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐덴디플루오리드 (polyvinylidene fluoride: PVDF) 막 (EMD Millipore, Billerica, MA, USA)으로 이동시켰다. 상기 PVDF 막을 1차 항체와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음 날, 상기 PVDF 막을 Tween과 Tris, NaCl이 함유된 TBST 용액으로 세척하고, HRP가 결합된 2차 항체와 상온에서 반응시켰다. 단백질 밴드를 증가된 화학 발광 (Enhanced chemiluminescence: ECL) 키트 시스템 (EMD Millipore)을 사용하여 가시화하였다.
도 3 및 4는 태반 유래 줄기세포를 분화 배지에서 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, Krt14의 단백질 수준을 측정한 결과이다. 도 3 및 4에서 나타낸 바와 같이, 태반 유래 줄기세포는 분화 배지에서 배양된 후 5일 이후부터 Krt14 단백질 양이 점차적으로 증가하였음을 알 수 있다. 반면, 태반 유래 줄기세포는 아스코르브산 및 히드로코르티손을 함유하지 않는 배지에서 배양된 후 Krt14 유전자가 발현되지 않거나 또는 매우 낮은 정도로 발현됨을 확인하였다.
(3) 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 제조
(1)에서 분화된 피부전구세포로부터 배양액을 생산하였다.
(1)에서 분화된 피부전구세포에서 분화 배지를 제거하고, DPBS로 세척하여 잔류 혈청을 제거하였다. 이 후, 콜린 클로리드 (choline chloride) 및 페놀 레드 (phenol red)를 포함하지 않는 DMEM/F12 배지를 배양 플레이트에 2 내지 3㎖/cm2가 되도록 첨가하고, 37℃, 5%의 CO2의 조건에서 3일 동안 배양하였다. 이어서, 분화된 피부전구세포 및 배지가 혼합된 피부전구세포의 배양물에서 상층액을 회수하였다. 이어서, 상기 상층액을 0.22μm의 필터에 여과하여 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 수득하였다. 대조군은 아스코르브산 및 히드로코르티손을 함유하지 않는 배지에서 배양된 태반 유래 줄기세포 (이하, 미분화 줄기세포) 및 통상의 표피세포 각각에, 배지를 첨가하고 배양하여 회수된 배양액을 사용하였다.
(4) 줄기세포 유래
피부전구세포
배양액의 성분 분석
(3)에서 수득한 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 및 미분화 줄기세포 배양액 내에서 세포 유래 단백질의 성분을 세크리톰 분석으로 확인하였다. 구체적으로 총 507종의 사이토카인의 수준을 확인하였다.
세크리톰분석은 RayBio 인간 사이토카인 항체 어레이 (RayBio Human Cytokine Antibody Array)의 프로토콜에 따라 RayBio™ 커스톰 L-시리즈 인간 사이토카인 어레이 (RayBio™ Custom C-Series Human Cytokine Array) (RayBiotech, Norcross, GA)를 이용하여 수행하였다. 얻어진 스폿 (spot)의 상대 강도는 이미지 J에 의해 측정되었고, 배경 제거 (background subtraction)에 의해 보정되었다. 결과는 2회 판독 결과의 평균치로 나타내었다.
(4.1) 미분화 줄기세포 배양액
세크리톰
분석
도 5는 미분화 줄기세포 배양액에서 발현양이 높은 사이토카인 가운데 상위 22종을 나타낸 것이다. 표 2는 미분화 줄기세포 배양액에서 단독으로 발현되는 사이토카인 6종을 나타낸 것이다. 미분화 줄기세포 배양액은 C-C 케모카인 수용체 타입 4 (C-C chemokine receptor type 4: CCR4), 과립구 주화성 단백질 (granulocyte chemotactic protein-2: GCP-2)/ 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 6 (chemokine (C-X-C motif) ligand 6: CXCL6), 엔도칸 (Endocan), P-셀렉틴 (P-selectin), C-C 케모카인 수용체 타입 5 (C-C chemokine receptor type 5: CCR5), 란테스 (Regulated on Activation, Normal T Cell Expressed and Secreted: RANTES) 및 신경 아교 세포계 유도 신경 영양 인자 (Glial cell line-derived neurotrophic factor: GDNF)를 특이적으로 함유하는 것을 알 수 있다.
| No. | 사이토카인 | 신호 강도 (Signial intensity) | |
| 미분화 배양액 | 분화 배양액 | ||
| 1 | CCR4 | 107,943 | 1 |
| 2 | GCP-2 / CXCL6 | 58,109 | 1 |
| 3 | 엔토칸 (Endocan) | 57,883 | 1 |
| 4 | P-셀렉틴 (P-selectin) | 34,935 | 1 |
| 5 | RANTES | 24,995 | 1 |
| 6 | GDNF | 21,206 | 1 |
(4.2) 분화된 줄기세포 유래
피부전구세포
배양액
세크리톰
분석
도 6는 분화된 피부전구세포 배양액에서 발현양이 높은 사이토카인 가운데 상위 24종을 나타낸 것이다. 표 3은 분화된 피부전구세포 배양액에서 다량으로 발현하는 사이토카인 24종을 나타낸 것이다. 분화된 피부전구세포 배양액은 트롬보스폰딘 (Thrombospondin: TSP), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 1 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 1: TIMP1), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 2 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 2: TIMP2), 엑토디스플라신-A2 (Ectodysplasin-A2: EDA-A2) X-연관 엑토디스플라신-A 수용체 (X-linked ectodysplasin-A receptor: XEDAR), 안지오포이에틴-1 (Angiopoietin-1), 스팍 (secreted protein acidic and rich in cysteine: SPARC), 상피세포성장인자 유사 및 두 폴리스타틴 유사 도메인 1을 갖는 막관통 단백질/토모레굴린-1 (Transmembrane protein with EGF-like and two Follistatin-like domains 1/ Tomoregulin-1: TMEFF1/Tomoregulin-1), 니도겐-1 (Nidogen-1), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3 (Insulin-like growth factor-binding protein-3: IGFBP-3), 트롬보스폰딘-2 (Thrombospondin-2), 종양 괴사 인자-관련 활성 유도 사이토카인 (TNF-related activation-induced cytokine: TRANCE), 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha: IL-15R 알파) 등을 다량 함유하는 것을 알 수 있다.
| No. | 사이토카인 | 신호 강도 |
| 1 | 트롬보스폰딘 (TSP) | 5,886,805 |
| 2 | IGFBP-rp1/IGFBP-7 | 3,970,222 |
| 3 | TIMP-2 | 3,950,540 |
| 4 | EDA-A2 | 3,938,694 |
| 5 | XEDAR | 1,572,912 |
| 6 | 안지오포이에틴-1 | 1,167,638 |
| 7 | SPARC | 1,020,366 |
| 8 | GDF-3 | 1,009,469 |
| 9 | sFRP-4 | 999,123 |
| 10 | GRO | 963,242 |
| 11 | MIP 2 | 865,819 |
| 12 | TIMP-1 | 785,939 |
| 13 | 잠재성 TGF-베타 bp1 | 554,608 |
| 14 | CV-2/크로스베인리스-2 | 475,676 |
| 15 | IL-6 | 441,917 |
| 16 | TMEFF1/토모레굴린 -1 | 430,143 |
| 17 | 니도겐-1 | 413,625 |
| 18 | Smad 4 | 391,810 |
| 19 | 액티빈 C | 228,189 |
| 20 | IGFBP-3 | 182,444 |
| 21 | 트롬보스폰딘-2 | 112,674 |
| 22 | TRANCE | 100,065 |
| 23 | 액티빈 A | 76,102 |
| 24 | IL-15 R 알파 | 51,270 |
(5) 줄기세포 유래
피부전구세포
배양액 내 단백질 농도 분석
상기 분화된 피부전구세포 배양액에서 표 3의 단백질이 다량 분비되는 것을 확인하였으며, 이들의 분비량을 효소 결합 면역흡착 분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)으로 정량적으로 분석하였다. 대조군은 아스코르브산 및 히드로코르티손을 함유하지 않는 배지에서 배양된 태반 유래 줄기세포 (이하, 미분화 줄기세포)에, 배지를 첨가하고 2 내지 4일 동안 배양하여 회수된 배양액, 및 표피세포에 배지를 첨가하고 2 내지 4일 동안 배양하여 회수된 배양액을 사용하였다. ELISA 키트는 트롬보스폰딘에 대하여 DTP00B (R&D system, Minieapolis, MN), 니도겐-1에 대하여 ELH-Nidogen1 (Raybiotec, Norcross, GA), TRANCE에 대하여 MBS262463 (Mybiosource), IL-15R 알파에 대하여 ELH-IL15RA (Raybiotec, Norcross, GA)를 이용하였으며, 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 모두 450nm에서 마이크로 플레이트 리더기 Epoch (BioTek Inc.)를 사용하여 흡광도를 측정하였으며, Gen5 (2.00) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
하기 표 4는 분화된 피부전구세포 배양액에서 트롬보스폰딘, TRANCE, 및 IL-15R 알파의 농도를 측정한 결과이다. 분화된 피부전구세포 배양액은 니도겐, 트롬보스폰딘 등을 다량 함유하는 것을 알 수 있다. 도 7은 분화된 피부전구세포 배양액, 미분화 줄기세포 배양액 및 통상의 표피세포 배양액에서 니도겐-1의 농도를 나타낸 것이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 분화된 피부전구세포 배양액은 미분화 줄기세포 배양액 및 표피세포 배양액에 비하여 니도겐-1의 함량이 10배 이상 높은 것을 알 수 있다.
| No. | 사이토카인 | 농도(pg/㎖) | 신호 강도 |
| 1 | 트롬보스폰딘 | 63.65 | 5,886,805 |
| 2 | 니도겐-1 | 15180 | 413,625 |
| 3 | TRANCE | 29 | 100,065 |
| 4 | IL-15R 알파 | 19 | 51,270 |
2. 줄기세포 유래
피부전구세포
배양액의 피부 재생 촉진 및 피부 노화 억제 효과 확인
1에서 제조된 분화된 피부전구세포 배양액이 피부 재생을 촉진하고, 피부 노화를 억제하는지 확인하였다.
(1) 분화된
피부전구세포
배양액의 산화 손상 보호 활성 확인
1에서 제조된 배양액을 첨가하고 배양한 인간 진피 섬유아세포 (human dermal fibroblast) (human dermal fibroblast, Lonza, Switzerland)에, 산화 손상을 유도하였을 때, 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액이 산화 손상에 의한 세포 사멸로부터 세포를 보호할 수 있는 능력을 가지고 있는지를 평가하였다.
48웰 (well) 마이크로 플레이트 (microplate)에 약 4,000 세포/웰로 세포를 접종하고, 37℃, 5%의 CO2 조건의 인큐베이터에서 24시간 동안 두어 플레이트에 세포가 안정적으로 부착되도록 하였다. 그 후, 1x 분화된 피부전구세포 배양액, 1x 미분화 줄기세포 배양액 및 250 μM의 아스코르브산을 각각 첨가하고, 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 600 μM의 과산화수소를 배지에 섞어 넣어주고, 24시간 뒤에 수용성 테트라졸륨염 (water soluble tetrazolium salt)-기반의 세포 증식 분석법을 통해 세포의 수를 측정하였다 (EZ-cytox, Daeil Lab Service, Korea). 수용성 테트라졸륨염은 살아있는 세포의 미토콘드리아 전자전달계에 존재하는 탈수소효소 (dehydrogenase)와 반응하여 오렌지색의 포르마잔 (formazan)을 만들며, 이 생성물은 450nm에서 흡광한다. 이 생성물의 양은 살아있는 세포 수와 직선의 상관 관계를 가지기 때문에 흡광도의 측정으로 해당 웰 (well) 내에 존재하는 살아있는 세포 수를 분석할 수 있다. 세포가 들어있는 웰의 배지를 새로운 배지 200 ㎕로 교환하고, 수용성 테트라졸륨염 20 ㎕를 첨가하고, 암 (dark) 환경에서 2시간 동안 반응시켰다. 이어서, 바닥이 투명한 96웰 마이크로 플레이트에 반응이 일어난 배지를 100 ㎕씩 옮겨 담고, 플레이트 판독기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이미 알고 있는 숫자의 세포군을 배지로 희석하여 다양한 수로 이루어진 군들을 만들고, 이들을 각각 테트라졸륨염과 반응시켜 나온 흡광도를 토대로 직선의 방정식을 얻었다. 그 뒤, 실험군의 흡광도를 이 방정식에 대입하여 세포의 수를 얻었다.
도 8은 인간 진피 섬유아세포에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고, 과산화수소에 노출시킨 후, 세포 내 미토콘드리아 탈수소효소의 활성 정도를 세포의 수로 변환하여, 세포의 생존 정도를 과산화수소 및 배양액 모두에 노출되지 않은 대조군에 대한 비율로 나타낸 결과이다. 즉, 분화된 표피세포 배양액의 산화 손상에 따른 세포 보호 효능을 확인한 결과이다. 도 8에서 CM은 1x 미분화 줄기세포 배양액을 첨가한 군, D-CM은 1x 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가한 군, Vit.C는 양성 대조군으로서, 아스코르브산을 첨가한 군을 의미한다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가한 경우에는, 과산화수소에 의해 감소된 세포의 생존 비율이 유의미하게 회복되어 있음을 확인할 수 있다. 이는 분화된 피부전구세포 배양액을 세포에 가하는 과정이 산화 손상에 의한 세포 사멸로부터 세포 자신을 보호하는 기전을 활성화시킴을 의미하는 결과이다.
(2) 분화된
피부전구세포
배양액의 항산화 활성 확인
(2.1)
DCFH
-DA 분석
1에서 제조된 배양액이 세포 내 활성산소종 (Reactive Oxygen Species: ROS) 생성에 미치는 효과를 카르복시-H2DCFDA가 포함된 ROS 검출 키트 (Abcam)를 사용하여 측정하였다. DCFH-DA는 쉽게 세포막을 뚫고 세포 안으로 확산되어 세포 안의 에스테라아제에 의해 형광을 잃은 DCFH로 가수분해 되고, 이후 ROS가 존재하는 환경에서 높은 형광을 띄는 DCF로 빠르게 산화된다. 따라서 DCF의 형광 강도는 세포 안의 ROS의 양과 비례한다.
인간 진피 섬유아세포를 24웰 (well) 마이크로 플레이트 (microplate)에 20,000세포/웰로 접종하고, 10%의 FBS가 포함된 배지, 및 37℃, 5%의 CO2 조건의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 1x 분화된 피부전구세포 배양액, 1x 미분화 줄기세포 배양액 및 250 μM의 아스코르브산을 각각 첨가하고, 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 600 μM의 과산화수소와 10 μM의 DCFDA를 동시에 첨가하고, 15분 동안 세포에 노출시켰다. 1x 인산염 완충 식염수로 1회 씻어내고, 각 웰의 세포를 1N의 수산화나트륨 용액 250 ㎕에 용출시켰다. 암 (dark) 환경이면서 바닥이 투명한 96웰 마이크로 플레이트에 세포 용출액을 180 ㎕씩 옮겨 담고, 플레이트 판독기를 이용하여 활성파장 (excitation) 485 nm, 및 방출파장 (emission) 528 nm에서 그 형광값을 획득하였다. 남은 세포 용출액 중 일부는 브래드포드 단백질 정량에 사용하였고, 형광값을 각각의 단백질 농도로 나누어 표준화 (normalization) 하였다. 아스코르브산을 첨가한 군은 실험의 양성 대조군으로 사용하였다.
도 9는 인간 진피 섬유아세포에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고 과산화수소에 노출시킨 후, 세포 내 ROS 수준을 대조군에 대한 배수로 나타낸 결과이다. 도 9에서 CM은 1x 미분화 줄기세포 배양액을 첨가한 군, D-CM은 1x 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가한 군을 의미한다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가한 경우에는, 과산화수소에 의해 ROS 수준이 증가한 산화 손상 유도군에 비하여 ROS 수준이 유의하게 낮은 것을 알 수 있었다. 이는 분화된 피부전구세포 배양액을 미리 첨가함으로써 인간 진피 섬유아세포 내 항산화 시스템의 활성이 증가되었으며, 이를 통해 같은 농도의 과산화수소에 노출되었음에도 낮은 수준의 ROS를 유지할 수 있음을 의미한다.
(2.2) 과산화수소분해효소 (
Catalase
) 유사 활성 분석
1에서 제조된 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가한 인간 진피 섬유아세포에서 과산화물에 의한 세포 사멸이 줄고 세포 내 활성산소종의 수준 역시 줄어들었음을 확인하였다. 따라서 분화된 피부전구세포 배양액이 세포 내 과산화물을 제거하는 효소인 과산화수소분해효소의 활성에 미치는 영향을 분석하였다. 과산화수소분해효소는 과산화수소가 물과 산소로 분해되는 카탈라아제 활성 (catalytic activity)과 알코올 존재하에 산소를 발생시키지 않고 알코올을 산화시키는 과산화 활성 (peroxidatic activity)을 가진다. 과산화수소분해효소 분석키트 (Cyman, MI, USA)를 사용하면, 과산화수소는 과산화수소분해효소의 존재하에 메탄올을 기질로 사용하여 포름알데히드를 생성하고, 생성된 포름알데히드는 보라색 색원체 (chromogen)인 4-아미노-3-히드라지노- 5-메르캅토-1,2,4- 트리아졸 (4- amino- 3- hydrazino- 5- mercapto- 1,2,4- triazole, Purpald)을 이용하여, 540nm에서 흡광도를 측정할 수 있다.
인간 진피 섬유아세포를 100 mm의 배양 플레이트에 약 5x105 세포가 되도록 접종하고, 37℃, 5%의 CO2 조건의 인큐베이터에서 24시간 동안 두어 플레이트에 세포가 안정적으로 부착되도록 하였다. 그 후, 1x 분화된 피부전구세포 배양액, 1x 미분화 줄기세포 배양액 및 250 μM의 아스코르브산을 각각 첨가하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 이어서 600 μM의 과산화수소에 노출시켜 24시간 동안 배양한 후, 막대로 배양 플레이트를 긁어 세포를 수거하였다. 300 ㎕의 용출액을 넣고 세포를 부순 뒤, 색원체인 Purpald와 반응시키고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 포름알데히드를 이용하여 얻은 표준식에 대입하고, 과산화수소분해효소 활성 정도를 분석하였다.
도 10는 인간 진피 섬유아세포에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가한 뒤, 과산화수소를 첨가하여 과산화수소분해효소의 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 도 10에서 CM은 1x 미분화 줄기세포 배양액을 첨가한 군, D-CM은 1x 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가한 군을 의미한다. Vit.C로 표기한 군은 아스코르브산을 첨가한 군으로, 양성 대조군으로 사용하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이 분화된 피부전구세포 배양액 및 미분화 줄기세포 배양액을 세포의 성장 배지에 미리 첨가한 후, 과산화수소에 노출시킨 경우에, 미분화 줄기세포 배양액을 첨가한 군과 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가한 군 모두에서 아스코르브산을 첨가한 군보다 과산화수소분해효소의 활성이 높았다. 특히 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가한 경우, 과산화수소에 의해 저해된 과산화수소분해효소의 활성이 완벽하게 회복되어 과산화수소 제거를 우수하게 했음을 알 수 있다.
(3) 분화된
피부전구세포
배양액이 콜라겐 발현 수준에 미치는 영향 확인
(3.1) 3차원 재조합 진피
배양계
제작
재조합 진피배양계를 만들기 위한 콜라겐 용액을 다음과 같이 제작하였다. 0.1%의 아세트산을 이용하여 래트 꼬리에서 콜라겐 조직을 녹여낸 뒤, 한 시간 동안 초고속 원심분리 (12,000 rpm)를 수행하여 불순물을 제거하였다. 이어서, 1 M의 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH를 7로 맞추고, 침전되는 콜라겐 펠렛 (pellet)을 다시 0.1%의 아세트 산에 녹였다. 3차원 진피배양계를 만들기 위해, 우선 튜브에 3.5 mg/㎖의 L-글루타민, 5.84 mg/㎖의 글루코즈, 37 mg/㎖의 탄산수소나트륨, 및 0.01 mg/㎖의 엽산이 포함된 10x DMEM (sigma, Missouri, USA) 배지를 300 ㎕ 넣고, 0.05 N의 수산화나트륨, 0.026 mM의 탄산수소나트륨 및 200 mM의 헤페스 (HEPES)를 함유하는 중화 완충 용액 300 ㎕를 첨가하였다. 10%의 FBS를 함유하는 DMEM 배지 600 ㎕에 인간 진피 섬유아세포를 5x105 세포가 되도록 준비하고, 마지막으로 래트 꼬리에서 수득한 콜라겐 용액을 1.8 mg/㎖이 되도록 넣어, 최종 부피를 3 ㎖로 맞추었다. 혼합된 용액을 잘 섞어서 6 웰 배양 플레이트 (6 well trans-well plate, Corning, NY, USA)의 삽입 웰에 접종하였다. 그 후, 37℃, 5%의 CO2 조건의 인큐베이터에서, 30분 동안 젤라틴화하고, 10%의 FBS가 들어간 페놀레드-프리 DMEM을 6 웰 배양 플레이트의 삽입 웰의 안과 밖에 채우고, 다음날 섬유아세포가 콜라겐 젤 안에서 뻗어 자리하였는지 확인하였다.
(3.2) 재조합 진피
배양계에
분화된
피부전구세포
배양액 첨가 및 자외선 B 조사
(3.1)에서 제작된 진피 배양계를 주 3회 신선한 배지로 교체하면서 일주일 동안 배양한 후, 1x 분화된 피부전구세포 배양액 및 1x 미분화 줄기세포 배양액을 각각 첨가하고, 24시간 동안 배양하였다. 이 때, 양성 대조군은 1mM의 N-아세틸-L-시스테인 (NAC: N-acetyl-L-cysteine, Sigma)을 첨가한 군을 사용하였다. 배지를 제거하고 1x 인산염 완충 식염수로 2회 씻어낸 후, 삽입 웰을 UV 조사기 (UV crosslinker, NY, USA)에 넣고 자외선 B (600 mJ/cm2)를 조사하였다. 0%의 FBS를 함유하는 DMEM을 삽입 웰의 안과 밖에 채우고 24시간 후, 재조합 진피를 수거하여 RT-PCR, 면역블롯 분석 및 프로콜라겐 타입 I C-말단 단백질의 양을 분석하는데 사용하였다.
(3.3) RT-PCR 분석
분화된 피부전구세포 배양액이 3차원 재조합 진피에 콜라겐 합성과 관련된 유전자의 발현을 촉진시키는지를 RT-PCR로 측정하였다. (3.2)에서 제작된 재조합 진피를 수거하였다. 수거된 재조합 진피는 100 μM 포어 (pore) 크기의 그물망에 담아 원심분리하여 탈수시켰다. 이어서, mRNA 추출 키트 (Intron, seongnam, Korea)를 사용하여 재조합 진피로부터 mRNA를 추출한 뒤, 역전사효소로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 프로콜라겐 타입 I 유전자의 발현 수준을 분석하기 위한 RT-PCR의 주형 (template)으로 사용하였다. 2x Smart PCR premix (Solgent, Deajeon, Korea) 및 Applied Biosystems Verity 96 well thermal cycler (CA, USA)를 사용하여, 95에서 20초, 57.4에서 20초, 및 72에서 1분씩 32회 반복하여 핵산을 증폭하였고, 베타-액틴으로 표준화하였다.
| 유전자명 | 정방향 프라이머 | 역방향 프라이머 |
| 프로콜라겐Ⅰ | GGC AGT TCT TGG TCT CGT CAC (서열번호 11) |
AGA CAT CCC ACC AAT CAC CTG (서열번호 12) |
도 11은 진피 배양계의 배지에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고, 자외선을 조사한 후, 프로콜라겐 타입 I의 mRNA 수준을 측정한 결과이다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 분화된 피부전구세포 배양액과 미분화 줄기세포 배양액을 첨가하지 않은 군은 자외선에 의해 프로콜라겐의 mRNA 수준이 크게 감소하였으나, 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가한 군은 mRNA 수준이 유의하게 높아져 있었다. 미분화 줄기세포 배양액을 첨가한 군에서도 프로콜라겐 타입 I의 mRNA의 수준이 증가하는 경향성은 관찰되었으나 유의미한 수준은 아니었다. 이는 인간 진피 섬유아세포 내 프로콜라겐의 mRNA 수준을 감소시키는 자외선의 영향이 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가함으로써 상쇄되고, 자외선을 조사하지 않은 군과 유사한 수준으로 프로콜라겐의 mRNA의 발현이 회복되었음을 보이는 결과이다.
(3.4) C-말단
단백질 양
분석
3차원 진피 배양계에서 배양액으로 방출되는 프로콜라겐 타입 I C-말단 펩티드 (Procollagen type I C-terminal propeptide: PICP)의 양을 효소결합 면역흡착 분석법 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: ELISA)으로 측정하였다. 상기 프로콜라겐 타입 I C-말단 펩티드는 콜라겐 신합성의 지표가 되므로 분화된 피부전구세포 배양액이 3차원 진피배양계의 콜라겐 신합성에 미치는 영향을 직접적으로 분석할 수 있다.
(3.2)에서 제작된 진피배양계의 배양액을 20㎕을 취하고, 제조사의 지시에 따라 프로콜라겐 타입 I C-펩티드 EIA 키트 (PICP, Takara, Japan)를 이용하여, 신합성 콜라겐의 양을 측정하였다.
도 12는 진피 배양계의 배지에 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하고, 자외선을 조사한 후, 배양액으로 분비된 프로콜라겐 타입 I C-말단 펩티드의 양을 측정한 결과이다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 배양액으로 분비된 신합성 콜라겐의 양은 자외선에 의해 현저하게 감소하였고, 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가한 뒤 자외선을 조사한 군에서는 분화된 피부전구세포 배양액을 첨가하지 않은 군에 비하여 신합성 콜라겐의 양이 증가하였다. 한편, 미분화 줄기세포 배양액을 첨가한 군에서는 신합성 콜라겐 양이 유의하게 증가하지 않았다.
상기 실험 결과로부터, 분화된 피부전구세포 배양액은 과산화수소 및 UV 조사에 의해 유도된 인간 진피 섬유아세포 내 산화 손상 모델에서, 세포 사멸을 억제하고, 세포 내 활성산소종을 억제하며, 프로콜라겐 타입 I의 발현을 촉진시킴을 알 수 있다.
(4) 인체 피부에서 주름 및 피부 질감 변화 확인
30세 내지 60세의 여성 피시험자 25명을 대상으로, 5%의 분화된 줄기세포 배양액을 함유한 에센스를 4주 동안 도포하고, 도포 전과 후를 비교하였다. Antera 3D 기기를 이용하여, 피부 주름 (wrinkle)과 피부 질감 (texture)를 측정하였다.
도 13은 분화된 줄기세포 배양액을 함유한 에센스를 도포하기 전과 후에 Antera 3D 기기를 이용하여, 피부 주름 및 피부 질감을 측정한 결과를 나타낸다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 배양액을 함유한 에센스를 4주 동안 도포한 결과 피부 주름이 유의하게 감소하였으며, 피부 질감 (피부결) 또한 매끄러워지고 부드러워졌다.
도 14는 분화된 줄기세포 배양액을 함유한 에센스를 도포하기 전과 후에 Antera 3D 기기를 이용하여, 피부 상태를 측정한 이미지를 나타낸다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 배양액을 함유한 에센스를 4주 동안 도포한 결과 눈가의 피부 주름 및 잔선이 현저하게 감소하고, 피부 탄력이 향상되어 피부결이 매끄러워졌다.
<110> CHA BIOTECH CO., LTD.
<120> Composition for skin-regeneration or anti-aging containing
epidermal stem cell conditioned medium and use thereof
<130> PN117146
<160> 12
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Krt5 primer
<400> 1
gtctcgccag tcaagtgtgt 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Krt5 primer
<400> 2
gacacggagg tgaagctg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Krt1 primer
<400> 3
gggtggttat ggtcctgtct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Krt1 primer
<400> 4
ggatctcagg gtcaatctcc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IVL primer
<400> 5
ccaggtccaa gacattcaac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IVL primer
<400> 6
actgcgggtg gttatttatg 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Krt14 primer
<400> 7
gagcagcaga accaggagt 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Krt14 primer
<400> 8
gagaactggg aggaggagag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Krt10 primer
<400> 9
actactcttc ctcccgcagt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Krt10 primer
<400> 10
tgagctaaat cctccaccaa 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> procollagen primer
<400> 11
ggcagttctt ggtctcgtca c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> procollagen primer
<400> 12
agacatccca ccaatcacct g 21
Claims (14)
- 줄기세포로부터 분화된 피부전구세포 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물로서, 상기 피부 노화는, 자외선에 의한 광노화, 색소침착, 또는 주름인 것인 화장료 조성물.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 또는 역분화 줄기세포인 것인 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수로부터 분리된 중간엽 줄기세포인 것인 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포로부터 분화된 피부전구세포 배양액은 트롬보스폰딘 (Thrombospondin: TSP), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 1 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 1: TIMP1), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 2 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 2: TIMP2), 엑토디스플라신-A2 (Ectodysplasin-A2: EDA-A2), X-연관 엑토디스플라신-A 수용체 (X-linked ectodysplasin-A receptor: XEDAR), 안지오포이에틴-1 (Angiopoietin-1), 스팍 (secreted protein acidic and rich in cysteine: SPARC), 상피세포성장인자 유사 및 두 폴리스타틴 유사 도메인 1을 갖는 막관통 단백질/토모레굴린-1 (Transmembrane protein with EGF-like and two Follistatin-like domains 1/ Tomoregulin-1: TMEFF1/Tomoregulin-1), 니도겐-1 (Nidogen-1), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3 (Insulin-like growth factor-binding protein-3: IGFBP-3), 트롬보스폰딘-2 (Thrombospondin-2), 종양 괴사 인자-관련 활성 유도 사이토카인 (TNF-related activation-induced cytokine: TRANCE), 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha: IL-15R 알파)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포로부터 분화된 피부전구세포 배양액은 트롬보스폰딘 (Thrombospondin: TSP), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 1 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 1: TIMP1), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 2 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 2: TIMP2), 엑토디스플라신-A2 (Ectodysplasin-A2: EDA-A2), X-연관 엑토디스플라신-A 수용체 (X-linked ectodysplasin-A receptor: XEDAR), 안지오포이에틴-1 (Angiopoietin-1), 스팍 (secreted protein acidic and rich in cysteine: SPARC), 상피세포성장인자 유사 및 두 폴리스타틴 유사 도메인 1을 갖는 막관통 단백질/토모레굴린-1 (Transmembrane protein with EGF-like and two Follistatin-like domains 1/ Tomoregulin-1: TMEFF1/Tomoregulin-1), 니도겐-1 (Nidogen-1), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3 (Insulin-like growth factor-binding protein-3: IGFBP-3), 트롬보스폰딘-2 (Thrombospondin-2), 종양 괴사 인자-관련 활성 유도 사이토카인 (TNF-related activation-induced cytokine: TRANCE), 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha: IL-15R 알파)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 10pg/㎖ 이상의 농도로 포함하는 것인 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포로부터 분화된 피부전구세포 배양액은 상기 화장료 조성물 총 부피에 대하여 0.01 내지 60%로 포함되는 것인 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포로부터 분화된 피부전구세포 배양액은
줄기세포를 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 분화 배지에서 배양하여 줄기세포로부터 분화된 피부전구세포로 분화시키는 단계;
상기 줄기세포로부터 분화된 피부전구세포를 배지에서 배양하여 줄기세포로부터 분화된 피부전구세포의 배양물을 생성시키는 단계; 및
상기 줄기세포로부터 분화된 피부전구세포의 배양물로부터 줄기세포로부터 분화된 피부전구세포 배양액을 회수하는 단계;를 거쳐 수득된 줄기세포로부터 분화된 피부전구세포 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 동결건조물을 포함하는 것인 화장료 조성물. - 줄기세포로부터 분화된 피부전구세포 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 피부 노화 예방 또는 개선용 건강기능식품로서, 상기 피부 노화는, 자외선에 의한 광노화, 색소침착, 또는 주름인 것인 건강기능식품.
- 삭제
- 청구항 9에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 또는 역분화 줄기세포인 것인 건강기능식품.
- 청구항 9에 있어서, 상기 줄기세포는 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수로부터 분리된 중간엽 줄기세포인 것인 건강기능식품.
- 청구항 9에 있어서, 상기 줄기세포로부터 분화된 피부전구세포 배양액은 트롬보스폰딘 (Thrombospondin: TSP), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 1 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 1: TIMP1), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 2 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 2: TIMP2), 엑토디스플라신-A2 (Ectodysplasin-A2: EDA-A2) X-연관 엑토디스플라신-A 수용체, (X-linked ectodysplasin-A receptor: XEDAR), 안지오포이에틴-1 (Angiopoietin-1), 스팍 (secreted protein acidic and rich in cysteine: SPARC), 상피세포성장인자 유사 및 두 폴리스타틴 유사 도메인 1을 갖는 막관통 단백질/토모레굴린-1 (Transmembrane protein with EGF-like and two Follistatin-like domains 1/ Tomoregulin-1: TMEFF1/Tomoregulin-1), 니도겐-1 (Nidogen-1), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3 (Insulin-like growth factor-binding protein-3: IGFBP-3), 트롬보스폰딘-2 (Thrombospondin-2), 종양 괴사 인자-관련 활성 유도 사이토카인 (TNF-related activation-induced cytokine: TRANCE), 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha: IL-15R 알파)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 건강기능식품.
- 삭제
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