WO2014003319A1 - 고농도의 줄기세포 제조방법 - Google Patents

고농도의 줄기세포 제조방법 Download PDF

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강성근
조정윤
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Ra Jeong-Chan
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    • C12N2511/00—Cells for large scale production

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a high concentration of stem cells, and more particularly to a method for proliferating stem cells in a high yield to be applicable to the clinical.
  • Stem cells are cells that have the ability to self-replicate and differentiate into two or more cells, and are totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and multipotent stem cells. can be classified as a multipotent stem cell.
  • Pluripotent stem cells are pluripotent cells that can develop into a complete individual. Cells up to 8-cells after fertilization of eggs and sperm have these properties. Transplantation can result in one complete individual.
  • Pluripotent stem cells are cells that can develop into various cells and tissues derived from ectoderm, mesoderm, and endodermal layer.Inner cell masses located inside the blastocyst appearing after 4-5 days of fertilization.
  • Multipotent stem cells are stem cells that can only differentiate into cells specific to the tissues and organs that contain them, as well as the growth and development of individual tissues and organs in the prenatal, neonatal, and adult phases. It is involved in maintaining homeostasis of adult tissues and inducing regeneration in case of tissue damage and collectively called tissue-specific pluripotent cells are called adult stem cells.
  • the present inventors have made diligent efforts for mass production of stem cells, basal medium; And N-acetyl-L-cysteine (NAC), ascorbic acid, insulin or insulin like factor, hydrocortisone, basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growht factor (EGF), and antioxidants. After culturing the stem cells in a medium containing two or more components, it was confirmed that the stem cells can be grown to a high concentration in a short time, and the present invention was completed.
  • N-acetyl-L-cysteine NAC
  • ascorbic acid insulin or insulin like factor
  • hydrocortisone hydrocortisone
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growht factor
  • An object of the present invention to provide a method for producing a high concentration of stem cells in a short time.
  • the present invention is a basic medium for stem cells; And N-acetyl-L-cysteine (NAC), ascorbic acid, insulin or insulin like factor, hydrocortisone, dexamethasone, basic fibroblast growth factor (bFGF), heparan sulfate, 2-mer It provides a method for producing a high concentration of stem cells, comprising the step of culturing the stem cells in a medium containing two or more components selected from the group consisting of 2-mercaptoethanol, EGF (epidermal growth factor) and antioxidants .
  • Figure 1 shows the cell population doubling level of the adipose derived stem cells obtained from adult men in their twenties, thirties, seventies, and eighties for four days in each medium composition.
  • stem cell used in the present invention refers to a cell having the ability of self-replicating and differentiating into two or more cells, and an "adult stem cell” refers to each organ of the embryo during the development process. Refers to stem cells appearing in the stage of formation or adulthood.
  • the term “mesenchymal stem cell” is an undifferentiated stem cell isolated from human or mammalian tissue, and may be derived from various tissues.
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, adipose-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived mesenchymal stem cells, nerve-derived mesenchymal stem cells, skin-derived mesenchymal stem cells , Amnion derived mesenchymal stem cells and placental derived mesenchymal stem cells, and techniques for isolating stem cells from each tissue are already known in the art.
  • fatty tissue-derived mesenchymal stem cells refers to undifferentiated adult stem cells isolated from adipose tissue, abbreviated herein as “fat-derived adult stem cells,” “fat stem cells,” or “fat. Derived stem cells ”. This can be obtained through conventional methods known in the art, and the separation method can be as follows, for example. In other words, the suspension containing fat suspended in physiological saline obtained from liposuction, and then treated with trypsin of the stem cell layer attached to the culture vessel, such as a flask and recovered or scraped with a scraper to directly float in a small amount of physiological saline. Adipose-derived mesenchymal stem cells can be separated by a method such as recovery.
  • “high concentration stem cell production” means to multiply the number of stem cells in a high yield, and in this specification, “high concentration stem cells” may be referred to as “mass stem cells”.
  • “mass stem cells” it was confirmed that the number of stem cells obtainable when cultured in the medium according to the present invention stem cells isolated from the tissues significantly increased. Preferably, it was confirmed that it is possible to obtain a three to five times when sub-cultured 10 7 ⁇ 5 ⁇ 10 8 The number of cells / ml of stem cells.
  • passage culture means a method of continually cultivating the generation of cells while transferring a portion of the cells periodically to a new culture vessel in order to continuously cultivate the cells in a healthy state for a long time. do.
  • proliferation of nutrients is consumed or contaminants accumulate, causing the cells to die naturally, which is used as a method for increasing the number of healthy cells.
  • Replacing a culture vessel or dividing a cell population is called one passage.
  • the method of subculture may be used without limitation methods known in the art, but may preferably be carried out by mechanical separation or enzymatic separation.
  • mechanical separation means physically or mechanically separating a cell mass, and any method known in the art can be used without limitation, but preferably, a blade, a tissue chopper, The separation may be by using a needle, pipetting, or scraper. According to a preferred embodiment of the present invention it was confirmed that the stem cells were mass-proliferated by passage culture using a blade or tissue mill.
  • “chemical separation” means to separate the cell mass through the enzyme treatment, and methods known in the art can be used without limitation, but preferably include collagenase I, II, III, IV
  • the collagenase Collagenase
  • Accutase Accutase
  • Dispase Dispase
  • trypsin trypsin
  • Stem cells can be administered into the body in a variety of ways, for example, intravenous, intraarterial, or intraperitoneal administration, among which intravenous administration is useful because it is easy and safe to treat the disease without surgery.
  • intravenous, intraarterial, or intraperitoneal administration among which intravenous administration is useful because it is easy and safe to treat the disease without surgery.
  • various requirements must be satisfied.
  • the administration of cells of a certain concentration or more must be premised so that the stem cells reaching the target site have the desired therapeutic effect. Therefore, it is important to obtain a large amount of stem cells to be clinically applied.
  • the stem cells administered intravenously should be sized to be suitable for intravenous administration so as not to reduce the rate of blood flow or to form a thrombus.
  • no cell breakage or aggregation should be formed before administration into the blood vessel, and even after administration into the blood vessel, the cells will stably reach the target site as a single cell without disruption or formation of aggregation. It must be
  • the present invention is to provide a stem cell of a certain concentration or more to be effective in the clinical.
  • the stem cell culture according to the conventional method in order to obtain a high yield of stem cells, it is necessary to carry out passage cultivation several times, which requires a lot of manpower and time. Particularly, some of the media components necessary for passage cultivation are very expensive and economically effective. There was also no advantage.
  • the present invention is capable of producing a high concentration of stem cells that can be clinically applied only by three to five passages.
  • the present invention in one aspect, in one aspect, the stem cell base medium; And N-acetyl-L-cysteine (NAC), ascorbic acid, insulin or insulin like factor, hydrocortisone, dexamethasone, basic fibroblast growth factor (bFGF), heparan sulfate, 2-mer
  • NAC N-acetyl-L-cysteine
  • ascorbic acid insulin or insulin like factor
  • hydrocortisone hydrocortisone
  • dexamethasone basic fibroblast growth factor (bFGF)
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • 2-mercaptoethanol epidermal growth factor
  • Stem cells to be used in the present invention is preferably adult stem cells, especially adipose tissue, or adult stem cells obtained from epithelial tissue such as hair follicles, amniotic membranes can be used. Most preferably, adult stem cells derived from adipose tissue can be used.
  • Mesenchymal stem cells (MSCs) may be used, and in particular, adipose tissue-derived mesencymal stem cells (AdMSCs) may be used. It is preferable that the said fat or epithelial tissue is derived from a mammal, and it is still more preferable that it is derived from a human. In one embodiment of the present invention, human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (AdMSCs) were used.
  • Basal medium used in the present invention refers to a conventional medium having a simple composition known in the art as suitable for stem cell culture.
  • Basic media commonly used for culture include MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), and K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium). If the medium used in is enough.
  • M199 / F12 (mixture) (GIBCO), MEM-alpha medium (GIBCO), low glucose containing DMEM medium (Welgene), MCDB 131 medium (Welgene), IMEM medium (GIBCO), K-SFM, DMEM / It may be selected from the group consisting of F12 medium, PCM medium and MSC expansion medium (Chemicon). In particular, among these, K-SFM medium can be used preferably.
  • the basal medium used to obtain the mesenchymal stem cell culture may be supplemented with additives known in the art, which promote the proliferation of the undifferentiated phenotype of mesenchymal stem cells while inhibiting differentiation.
  • the medium may contain neutral buffers (such as phosphates and / or high concentrations of bicarbonate) and protein nutrients (eg, serums such as FBS, fetal calf serum, horse serum, serum substitutes, albumin, or essential amino acids and non-essentials in isotonic solution).
  • Amino acids such as glutamine, L-glutamine).
  • lipids fatty acids, cholesterol, HDL or LDL extracts of serum
  • other components found in most preservative media of this kind such as insulin or transferrin, nucleosides or nucleotides, pyruvate salts, any ionized form or salt
  • Sugar sources such as glucose, selenium, glucocorticoids such as hydrocortisone and / or reducing agents such as ⁇ -mercaptoethanol.
  • the medium also contains anti-clumping agents, such as those sold by Invitrogen (Cat # 0010057AE), with the aim of preventing the cells from adhering to each other, adhering to the vessel wall, or forming too large a bundle. It can be beneficial to do so.
  • anti-clumping agents such as those sold by Invitrogen (Cat # 0010057AE)
  • SCF Stem cell factor
  • other ligands or antibodies that dimerize the c-kit and other active agents of the same signal transduction pathway
  • tyrosine kinase related receptors such as platelet-Derived Growth Factor (PDGF), macrophage colony-stimulating factor, Flt-3 ligand and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Ligands for PDGF
  • PDGF platelet-Derived Growth Factor
  • macrophage colony-stimulating factor Flt-3 ligand
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • Hematopoietic hair growth factors such as thrombopoietin (TPO)
  • Modified growth factors such as TGF ⁇ -1
  • Neurotropins such as CNTF
  • Antibiotics such as gentamicin, penicillin, streptomycin
  • the medium used in the present invention is, in addition to the basic medium, N-acetyl-L-cysteine (NAC), ascorbic acid (ascorbic acid), insulin or insulin like factor, hydrocortisone, dexamethasone, basic fibroblast growth factor (bFGF), It may further contain two or more ingredients selected from the group consisting of heparan sulfate, 2-mercaptoethanol, epidermal growth factor (EGF) and antioxidants.
  • NAC N-acetyl-L-cysteine
  • ascorbic acid ascorbic acid
  • insulin or insulin like factor hydrocortisone
  • dexamethasone dexamethasone
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • It may further contain two or more ingredients selected from the group consisting of heparan sulfate, 2-mercaptoethanol, epidermal growth factor (EGF) and antioxidants.
  • insulin-like factor as an alternative to insulin, which enhances glucose metabolism and protein metabolism to promote cell growth.
  • IGF-1 Insulin-like growth factor-1
  • the preferred amount of insulin-like factor is 10 to 50 ng / ml, and if its component is less than 10 ng / ml, it causes apoptosis, and if it exceeds 50 ng / ml, problems of cytotoxicity and cost increase are observed. have.
  • fibroblast growth factor bFGF
  • bFGF fibroblast growth factor
  • the preferred content of fibroblast growth factor is 1 to 100 ng / ml.
  • selenium As antioxidants, selenium, ascorbic acid, vitamin E, catechin, lycopene, beta carotene, coenzyme Q-10, EPA (eicosapentaenoic acid), DHA (docosahexanoic acid) can be used, and preferably selenium can be used. have.
  • selenium was used as an antioxidant, and the amount of selenium used is preferably 0.5 to 10 ng / ml. At this time, if the content thereof is less than 0.5 ng / ml is sensitive to oxygen toxicity, if it exceeds 10 ng / ml because it causes severe cytotoxicity.
  • the medium used in the present invention may further contain a component selected from the group consisting of FBS (fetal bovin serum), calcium and EGF.
  • FBS fetal bovin serum
  • EGF epidermal growth factor
  • the preferred content of epidermal growth factor is 10 to 50 ng / ml, the content of which is less than 10 ng / ml has no particular effect, if it exceeds 50 ng / ml is toxic to cells.
  • Stem cells cultured in the medium according to the present invention is preferably multiplied by the number of 1 ⁇ 10 7 to 5 ⁇ 10 8 cells / ml in three to five passages.
  • the stem cells according to the present invention can be effectively applied to the clinic.
  • adipose derived mesenchymal stem cells were cultured in the medium according to the present invention.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells can be obtained by the following method. First, the human adipose tissue obtained from the abdomen by liposuction and the like is separated and washed with PBS, and then the tissue is chopped and digested with DMEM medium containing collagen degrading enzyme, followed by washing with PBS and at 1000 rpm. Centrifuge for 5 minutes. The supernatant is removed and the remaining pellets are washed with PBS and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The float was removed using a 100 ⁇ m mesh and then washed again with PBS.
  • the adipose tissue obtained from the abdomen by liposuction was separated and washed with PBS.
  • the washed adipose tissue was chopped and the tissue was digested at 37 ° C. for 2 hours using DMEM medium to which collagenase type 1 (1 mg / ml) was added.
  • the collagenase treated tissues were washed with PBS, centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, the pellet was washed with PBS and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells were cultured up to 4 passages with K-SFM media containing / ml of selenium every 2 days.
  • FBS N-acetyl-L-cysteine
  • NAC N-acetyl-L-cysteine
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • M1 K-SFM Medium + FBS + NAC + Asocorbic Acid + Insulin + Hydrocortisone + bFGF + EGF + Selenium
  • M2 K-SFM medium + NAC + asocorbic acid + insulin + hydrocortisone + bFGF + EGF + selenium (excluding FBS in the composition of medium 1)
  • M3 K-SFM medium + FBS + NAC + asocorbic acid + insulin + hydrocortisone + EGF + selenium (except bFGF in the composition of medium 1)
  • M4 K-SFM medium + FBS + NAC + asocorbic acid + hydrocortisone + bFGF + EGF + selenium (excluding insulin in the composition of medium 1)
  • Medium 5 K-SFM medium + FBS + NAC + asocorbic acid + insulin + bFGF + EGF + selenium (excluding hydrocortisone among the components of medium 1)
  • M6 K-SFM medium + FBS + NAC + asocorbic acid + insulin + hydrocortisone + bFGF + selenium (excluding EGF in the composition of medium 1)
  • Medium 7 K-SFM medium + FBS + NAC + insulin + hydrocortisone + bFGF + EGF + selenium (excluding ascorbic acid in the composition of medium 1)
  • Medium 8 K-SFM medium + FBS + asocorbic acid + insulin + hydrocortisone + bFGF + EGF + selenium (excluding NAC in the composition of medium 1)
  • M10 K-SFM medium + FBS + NAC + asocorbic acid + insulin + hydrocortisone + selenium (except bFGF and EGF in the composition of medium 1)
  • Adipose derived stem cells were cultured in the medium.
  • Adipose stem cells were obtained from adipose derived stem cells obtained from adult men in their 20s, 30s, 70s and 80s. In each medium, the obtained adipose-derived stem cells were passaged up to 4 passages, followed by trypsin treatment, and the number of cells was confirmed by a confocal microscope.
  • Table 1 1 ⁇ 10 5 fat-derived mesenchymal stem cells of the third passage were inoculated and cultured for 4 days, and the number of cells obtained by medium and primary was expressed.
  • stem cells up to 2.5 ⁇ 10 6 cells / ml could be prepared according to the medium component (Table 1).
  • the media 9 had the highest cell population doubling level (CPDL) value.
  • CPDL cell population doubling level
  • the number of cells increased by 13 to 25 times.
  • the number of cells was 7 to 15 times. It was confirmed that the increase (Fig. 1).
  • cells in which mutations occurred were not identified (not shown).

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Abstract

본 발명은 고농도의 줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 단기간에 줄기세포를 임상에 적용할 수 있을 정도의 양으로 증식시킬 수 있어, 투여된 줄기세포가 안정적으로 표적 조직에 도달하여 활성을 나타내는 효능을 보다 효율적으로 높일 수 있으므로 줄기세포를 이용한 세포치료 효능을 획기적으로 증진시킬 수 있다.

Description

고농도의 줄기세포 제조방법
본 발명은 고농도의 줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 임상에 적용할 수 있을 정도로 높은 수율로 줄기세포를 증식시키는 방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 만능 줄기세포(totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4~5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다.
성체 줄기세포는 인체의 각종 장기에 이미 존재하는 세포를 채취, 줄기세포를 발전시킨 것으로 특정 조직으로만 분화되는 특징이 있다. 그러나 최근에는 성체 줄기세포를 이용, 간세포 등 각종 여러 조직으로 분화시키는 실험이 성공을 거두고 있어 주목된다. 특히, 병이나 사고에 의한 기능 장애나 부조화에 빠진 생체 조직 및 장기의 재생 및 기능 회복을 위해 세포를 적극적으로 활용하여 실시하는 치료법인 재생 의료에 있어서, 환자 본인으로부터 줄기세포, 혈액 유래 단핵세포 혹은 골수 유래 단핵세포를 수집하는 단계, 시험관 배양으로 세포 증식 및/또는 분화를 유도하는 단계, 및 선택된 미분화(줄기세포 및/또는 전구세포) 및/또는 분화세포를 착상에 의해 환자 자신의 몸에 도입하는 단계를 포함하는 방법이 많이 이용되고 있다. 이처럼, 기존의 고전적인 약물처치나 수술적 방법을 통한 질병치료는 손상된 세포·조직·장기를 건강한 것으로 바꾸는 세포·조직대체치료법으로 대체될 것으로 예측됨으로써, 줄기세포의 활용도는 더욱 높아지게 될 것이다.
이에, 현재 줄기세포의 다양한 기능이 연구되고 있는 실정이며, 그 중에서도 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)를 이용한 세포치료기술이 각광을 받기 시작하면서, 인체로부터 분리된 중간엽 줄기세포를 치료에 적합하도록 개선하기 위한 기술이 개발되고 있다 (WO 2006/019357, 대한민국 등록특허 제0795708호, 대한민국 등록특허 제0818214호).
그러나, 분리된 줄기세포를 임상에 적용할 수 있을 정도의 양으로 증식시키는 기술은 아직까지 미흡한 상태이다.
이에, 본 발명자들은 줄기세포의 대량 생산을 위하여 예의 노력한 결과, 기본 배지; 및 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 아스코르브산 (ascorbic acid), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, bFGF (basic fibroblast growth factor), EGF (epidermal growht factor) 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 2가지 이상의 성분을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하면 줄기세포를 단기간에 높은 농도로 증식시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 단기간에 고농도의 줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포를 기본배지; 및 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 아소코르브산 (ascorbic acid), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, 덱사메타손, bFGF (basic fibroblast growth factor), 헤파란 황산 (heparan sulfate), 2-메르캅토에탄올 (2-mercaptoethanol), EGF (epidermal growth factor) 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 2가지 이상의 성분을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 고농도의 줄기세포 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 20대, 30대, 70대, 80대의 성인 남자로부터 수득한 지방 유래 줄기세포를 각 배지 조성에서 4일간 배양하는 동안의 Cell population doubling level을 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서 사용하는 용어 “줄기세포(stem cell)”란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, “성체 줄기세포”는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “중간엽 줄기세포”는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 줄기세포로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있다. 특히, 제대 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 근육 유래 중간엽 줄기세포, 신경 유래 중간엽 줄기세포, 피부 유래 중간엽 줄기세포, 양막 유래 중간엽 줄기세포 및 태반 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “지방 조직 유래 중간엽 줄기세포”란 지방조직에서 분리해 낸 미분화된 성체 줄기세포로서, 본 명세서에 축약하여 “지방 유래 성체 줄기세포”, “지방 줄기세포” 또는 “지방 유래 줄기세포”라고 지칭하기도 한다. 이는 당업계에 공지된 통상의 방법을 통하여 수득할 수 있는데, 그 분리 방법은 예를 들어 다음과 같을 수 있다. 즉, 지방흡입술로부터 얻어지는 생리 식염수에 부유된 지방 함유 suspension을 배양한 다음, 플라스크 등 배양용기에 부착된 줄기세포 층을 트립신으로 처리한 다음 회수하거나, 스크래퍼로 긁어서 소량의 생리 식염수에 부유되는 것을 직접 회수하거나 하는 방법 등을 통해 지방 유래 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다.
본 발명에서 “고농도의 줄기세포 제조”란 줄기세포의 수를 높은 수율로 증식시키는 것을 의미하는 것이고, 본 명세서에서 “고농도의 줄기세포”는 “대량의 줄기세포”라고 지칭하기도 한다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 조직으로부터 분리한 줄기세포를 본 발명에 따른 배지에서 배양하는 경우 수득할 수 있는 줄기세포의 수가 확연히 늘어나는 것을 확인하였다. 바람직하게는 3회 내지 5회 계대 배양시 107 ~ 5 × 108 세포수/ml 의 줄기세포를 수득할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 “계대 배양”이란 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대 (代)를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지 (배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대 (1 passage)라고 한다. 계대 배양의 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 기계적 분리 또는 효소적 분리로 수행될 수 있다.
본 발명에서, “기계적 분리”란 물리적 또는 기계적으로 세포 덩어리를 분리하는 것을 의미하며, 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 블레이드 (blade), 조직 분쇄기 (tissue chopper), 바늘 (needle), 피펫팅 (pipetting) 또는 스크래퍼 (scrapper)를 이용하여 분리하는 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면 블레이드 또는 조직 분쇄기를 이용하여 계대 배양하여 줄기세포가 대량 증식된 것을 확인하였다.
본 발명에서, “화학적 분리”란 효소 처리를 통하여 세포 덩어리를 분리하는 것을 의미하며, 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 콜라게네이즈 I, II, III, IV를 포함하는 콜라게네이즈(Collagenase), 아큐타제 (Accutase), 디스파제 (Dispase) 또는 트립신을 처리하여 분리하여 계대 배양할 수 있다.
줄기세포는 다양한 방법, 예를 들면, 정맥내, 동맥내 또는 복강내 투여 등의 방법으로 신체 내로 투여될 수 있는데 그 중에서도 정맥 내 투여는 외과적 수술 없이도 간편하면서도 안전하게 질병을 치료할 수 있어 유용하다. 그러나 정맥 내로 투여된 줄기세포가 실제로 표적 부위에 안정적으로 도달하여 목적하는 치료효과를 나타내기 위해서는 여러 가지 요건이 만족되어야 한다. 먼저, 표적 부위에 도달한 줄기세포가 목적하는 치료효과를 나타내도록 일정 농도 이상의 세포 투여가 전제되어야 한다. 따라서, 임상적으로 적용하고자 하는 줄기세포를 대량으로 수득하는 것이 중요하다. 또한, 혈관 내로 투여된 줄기세포가 혈류 내 속도를 감소시키거나 혈전을 형성하지 않도록 혈관 내 투여에 적합한 크기여야 한다. 뿐만 아니라, 혈관 내로 투여되기 전 세포의 파쇄나 응집 (aggregation)이 형성되지 않아야 하며, 혈관 내로 투여된 후에도 단일 세포 (single cell)로서 세포의 파괴나 응집의 형성 없이 표적 부위에 안정적으로 도달할 것이 전제되어야 한다.
상기 여러 요건 중, 본 발명은 임상에 효과적이기 위한 일정 농도 이상의 줄기세포를 제공하기 위한 것이다. 종래의 방법에 의한 줄기세포 배양에 의하면, 높은 수율의 줄기세포를 얻기 위해서는 계대 배양을 여러 차례 수행하여야 하므로 인력 및 시간이 많이 소요되며, 특히 계대 배양에 필요한 배지 성분 중 일부는 대단히 고가여서 경제적으로도 장점이 존재하지 않았다. 그러나, 본 발명은 단 3회 내지 5회의 계대 배양만으로도 임상적으로 적용 가능할 정도의 고농도의 줄기세포를 제조하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 줄기세포를 기본배지; 및 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 아소코르브산 (ascorbic acid), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, 덱사메타손, bFGF (basic fibroblast growth factor), 헤파란 황산 (heparan sulfate), 2-메르캅토에탄올 (2-mercaptoethanol), EGF (epidermal growth factor) 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 2가지 이상의 성분을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 고농도의 줄기세포 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 줄기세포는 바람직하게는 성체 줄기세포, 그 중에서도 지방조직, 또는 모낭·양막 등 상피조직에서 얻어지는 성체 줄기세포를 이용할 수 있다. 가장 바람직하게는 지방 조직 유래 성체 줄기세포를 사용할 수 있다. 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSCs)를 사용할 수 있고, 특히 지방조직 유래 중간엽 줄기세포 (Adipose tissue-derived mesencymal stem cell, AdMSCs)일 수 있다. 상기 지방 또는 상피조직은 포유류 유래인 것이 바람직하고, 그 중에서도 인간 유래인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기세포 (Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell, AdMSCs)를 사용하였다.
본 발명에서 사용되는 기본 배지(basal medium)는 당업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 알려져 있는 간단한 조성을 가지는 통상적인 배지를 뜻한다. 일반적으로 배양에 이용되는 기본 배지로는 MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium)이 있으며, 이 외에도 당해 업계에서 이용되는 배지이면 족하다. 바람직하게는, M199/F12(mixture)(GIBCO), MEM-alpha배지(GIBCO), 저농도 글루코오스 함유 DMEM배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), K-SFM, DMEM/F12 배지, PCM 배지 및 MSC 확장배지 (Chemicon)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 특히, 이 중에서도 바람직하게는 K-SFM 배지를 사용할 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포 배양물의 획득에 사용되는 기본 배지는 당 업계에 공지된, 중간엽 줄기세포의 미분화된 표현형의 증식을 촉진하면서 분화는 억제하는 첨가제로 보충될 수 있다. 또한, 배지는 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, FCS (fetal calf serum), horse serum, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민, L-글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다.
또한, 배지는 세포가 서로 유착하거나, 용기벽에 유착하거나, 너무 큰 다발을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 항응집제 (anti-clumping agent), 예컨대 Invitrogen이 판매하는 것들(Cat ＃0010057AE)을 포함하는 것이 유익할 수 있다.
그 중에서도, 하기의 1이상의 추가의 첨가제를 사용하는 것이 유리할 수 있다:
·줄기 세포 인자 (SCF), c-키트를 이량화하는 다른 리간드 또는 항체, 및 동일한 신호 전달 경로의 다른 활성제
·다른 티로신 키나아제 관련 수용체, 예컨대 혈소판-유도된 성장 인자(Platelet-Derived Growth Factor; PDGF), 대식세포 콜로니-자극 인자, Flt-3 리간드 및 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF)의 수용체를 위한 리간드
·환형 AMP 농도를 높이는 인자, 예컨대 포르스콜린
·gp130을 유도하는 인자, 예컨대 LIF 또는 Oncostatin-M
·조혈모 성장 인자, 예컨대 트롬보포이에틴(TPO)
·변형성 성장 인자, 예컨대 TGFβ-1
·뉴로트로핀, 예컨대 CNTF
·항생제, 예컨대 겐타마이신 (gentamicin), 페니실린, 스트렙토마이신
본 발명에서 사용되는 배지는 상기 기본 배지 이외에, NAC(N-acetyl-L-cysteine), 아소코르브산 (ascorbic acid), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, 덱사메타손, bFGF (basic fibroblast growth factor), 헤파란 황산 (heparan sulfate), 2-메르캅토에탄올 (2-mercaptoethanol), EGF (epidermal growth factor) 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 2가지 이상의 성분을 추가로 함유할 수 있다.
구체적으로, 인슐린을 대체하는 성분으로 인슐린 유사인자를 함유할 수 있는데, 이는 포도당 대사와 단백질 대사를 향상시켜 세포성장을 촉진하는 역할을 한다. 특히 재조합 IGF-1 (Insulin-like growth factor-1)을 사용하는 것이 바람직하다. 인슐린 유사인자의 바람직한 함량은 10 내지 50 ng/ml이며, 이의 성분이 10ng/ml미만일 경우에는 세포자살(Apoptosis)을 초래하며, 50 ng/ml을 초과할 경우에는 세포독성 및 비용증가의 문제점이 있다.
섬유아세포 증식인자 (bFGF)를 함유할 수 있는데, 이는 in vivo 상태에서 다양한 형태의 세포증식을 야기할 수 있으며, 바람직하기로는 재조합 단백질을 사용한다. 섬유아세포 증식인자의 바람직한 함량은 1 내지 100 ng/ml이다.
항산화제로는 셀레늄 (selenium), 아스코르브산, 비타민 E, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, 코엔자임 Q-10, EPA (eicosapentaenoic acid), DHA (docosahexanoic acid) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 셀레늄을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 항산화제로서 셀레늄을 사용하였으며, 사용되는 셀레늄의 양은 0.5 내지 10 ng/ml 인 것이 바람직하다. 이때, 이의 함량이 0.5 ng/ml 미만이면 산소독성에 민감하며, 10 ng/ml을 초과하면 심각한 세포독성을 초래하기 때문이다.
본 발명에서 사용되는 배지는 FBS (fetal bovin serum), 칼슘 및 EGF으로 구성된 군에서 선택되는 성분을 추가로 함유할 수 있다. 상피세포 성장인자(Epidermal growth factor; EGF)는 in vivo 상태에서 다양한 형태의 세포증식을 야기할 수 있으며, 바람직하기로는 재조합 단백질을 사용한다. 상피세포 성장인자의 바람직한 함량은 10 내지 50 ng/ml이며, 이의 함량이 10 ng/ml 미만이면 특별한 효과가 없으며, 50 ng/ml을 초과하면 세포에 독성을 가진다.
본 발명에 따른 배지에서 배양된 줄기세포는, 바람직하게는 3회 내지 5회 계대 배양시 1×107 ~ 5×108 세포수/ml로 그 수가 증식한다. 또한, 상기 계대 배양을 통해 줄기세포의 수를 증가시키는 동안 기능적/형태학적으로 세포의 변형도 일어나지 않으므로 본 발명에 따른 줄기세포는 임상에 효과적으로 적용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 배지에서 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하였다. 지방 유래 중간엽 줄기세포는 다음과 같은 방법으로 획득할 수 있다. 우선, 지방흡입술(Liposuction) 등에 의해 복부로부터 얻어진 인간 지방조직을 분리하여 PBS로 세척한 다음, 조직을 잘게 자른 후 콜라겐 분해 효소를 첨가한 DMEM배지를 사용하여 분해 후, PBS로 세척하고 1000 rpm에서 5분간 원심분리 한다. 상층액은 제거하고 바닥에 남은 펠렛은 PBS로 세척한 후 1000 rpm으로 5분간 원심분리 한다. 100 ㎛ 매쉬를 사용하여 부유물을 제거한 다음, PBS로 다시 세척하였다. DMEM(10% FBS. 2 mM NAC, 0.2 mM 아스코르브산)배지에서 배양하고, 하룻밤 지난 후 배양용기 바닥에 부착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, NAC, 아스코르브산, 칼슘, rEGF, 인슐린, bFGF, 하이드로코티손 및 셀레늄을 함유한 K-SFM 배지를 2일마다 교체하면서 배양하여 중간엽 줄기세포를 분리하여 계대 배양하여 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있다. 그러나 이 외에도 당업계에 공지된 방법으로 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기세포 분리
지방흡입술(Liposuction)에 의해 복부로부터 얻어진 지방조직을 각각 분리하여 PBS로 세척하였다. 세척된 지방조직을 잘게 자른 후 콜라게나아제 타입 1 (1mg/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 이용해 37℃에서 2시간 동안 조직을 분해시켰다. 콜라게나아제 처리된 조직을 PBS로 세척 후 1000rpm에서 5분간 원심분리 하여, 상층액을 제거하고, 펠렛을 PBS로 세척한 후 1000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 100㎛ mesh에 필터링하여 부유물을 제거한 후 PBS로 세척하고, 10% FBS, 2mM NAC(N-acetyl-L-cysteine), 0.2mM 아스코르브산이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다.
하룻밤 지난 후 부착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 5% FBS, 2mM NAC, 0.2mM 아스코르브산, 0.09mM 칼슘, 5ng/ml rEGF, 5㎍/ml 인슐린, 10ng bFGF, 74ng/ml 하이드로코티손 및 1ng/ml의 셀레늄(selenium)을 함유한 K-SFM media를 2일마다 교체하면서 4계대까지 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하였다.
실시예 2: 줄기세포의 증식능에 영향을 미치는 배지성분의 탐색
실시예 1에서 사용된 K-SFM 배지에 첨가되는 활성성분인 FBS, NAC(N-acetyl-L-cysteine), 아소코르브산 (ascorbic acid), 인슐린, 하이드로코르티손, bFGF (basic fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor) 및 셀레늄을 모두 함유하는 배지 (배지 1)와 상기 활성성분 중 하나 이상을 제거한 배지 (배지 2 ~ 배지 9)를 하기와 같이 제조하였다. 구체적인 배지 성분은 다음과 같다:
배지 1 (M1): K-SFM 배지 + FBS + NAC + 아소코르브산 + 인슐린 + 하이드로코르티손 + bFGF + EGF + 셀레늄
배지 2 (M2): K-SFM 배지 + NAC + 아소코르브산 + 인슐린 + 하이드로코르티손 + bFGF + EGF + 셀레늄 (배지 1의 성분 중 FBS 제외)
배지 3 (M3): K-SFM 배지 + FBS + NAC + 아소코르브산 + 인슐린 + 하이드로코르티손 + EGF + 셀레늄 (배지 1의 성분 중 bFGF 제외)
배지 4 (M4): K-SFM 배지 + FBS + NAC + 아소코르브산 + 하이드로코르티손 + bFGF + EGF + 셀레늄 (배지 1의 성분 중 인슐린 제외)
배지 5 (M5): K-SFM 배지 + FBS + NAC + 아소코르브산 + 인슐린 + bFGF + EGF + 셀레늄 (배지 1의 성분 중 하이드로코르티손 제외)
배지 6 (M6): K-SFM 배지 + FBS + NAC + 아소코르브산 + 인슐린 + 하이드로코르티손 + bFGF + 셀레늄 (배지 1의 성분 중 EGF 제외)
배지 7 (M7): K-SFM 배지 + FBS + NAC + 인슐린 + 하이드로코르티손 + bFGF + EGF + 셀레늄 (배지 1의 성분 중 아소코르브산 제외)
배지 8 (M8): K-SFM 배지 + FBS + 아소코르브산 + 인슐린 + 하이드로코르티손 + bFGF + EGF + 셀레늄 (배지 1의 성분 중 NAC 제외)
배지 9 (M9): K-SFM 배지 + FBS + NAC + 아소코르브산 + 인슐린 + 하이드로코르티손 + bFGF + EGF (배지 1의 성분 중 셀레늄 제외)
배지 10 (M10): K-SFM 배지 + FBS + NAC + 아소코르브산 + 인슐린 + 하이드로코르티손 + 셀레늄 (배지 1의 성분 중 bFGF 및 EGF 제외)
상기 배지에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 지방 줄기세포는 20대, 30대, 70대, 80대의 성인 남자로부터 수득한 지방 유래 줄기세포를 이용하였다. 상기 각각의 배지에서 상기 수득한 지방 유래 줄기세포를 4 계대까지 계대한 후 트립신을 처리한 뒤 공초점 현미경 (confocal microscope)으로 세포 수를 확인하였다. 하기 표 1에서는 3계대째 지방유래 중간엽 줄기세포 1 × 105 개를 접종하여 4일 동안 배양하였을 때 배지별, 일차별 수득세포수를 표기하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 배양방법에 의하면 줄기세포를 4일 동안 배양하는 경우, 배지성분에 따라 최대 2.5 × 106 cells/ml의 줄기세포를 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다 (표 1). 또한, 연령별로 다소 차이가 있지만 배지 9번의 경우 CPDL(Cell population doubling level) 값이 가장 높았다. 20대 및 30대의 경우 1 × 105 cells/ml의 줄기세포를 접종하여 4일(day 4) 동안 배양하면 세포 수가 13~25 배 증가하였고, 70대 및 80대의 경우에는 세포 수가 7~15 배 증가함음을 확인할 수 있었다 (도1). 또한, 변이가 일어난 세포는 확인되지 않았다 (도시하지 않음).
표 1 고농도 줄기세포를 제조하기 위한 배지 성분의 탐색
Age Post seedingDay Total Cell Count (×104/ml)
M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
20 Day0 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Day1 8 16 15 13 12 16 12 12 8 12
Day2 39 13.5 30.5 38 29.5 33.5 39 30 26.5 9.5
Day3 115 11.5 70 110 115 110 110 110 105 11
Day4 230 10.5 135 195 180 225 250 230 205 13
30 Day0 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Day1 12 10 14 11 16 27 23 10 26 25
Day2 35 12 24.5 40 40 35.5 33.5 39.5 41 10.5
Day3 120 150 0 90 110 95 105 110 125 10.5
Day4 215 10 150 185 130 165 230 220 220 13
70 Day0 10 10 10 1000 10 10 10 10 10 10
Day1 12 7 16 12 13 20 10 13 20 11
Day2 37 9 31 32.5 27.5 29 29.5 30.5 26 13
Day3 85 12 60 65 80 86 90 100 95 12
Day4 155 7 85 120 135 105 145 150 155 13.5
80 Day0 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Day1 20 10 17 15 16 13 16 13 17 16
Day2 24.5 11.5 16.5 21 19.5 26 17 24.5 23 10.5
Day3 37 7.5 31 41 37 47 65 55 48.5 9
Day4 75 9 55 90 70 70 65 80 65 14.5
본 발명에 따르면, 3회 내지 5회 계대 배양만으로도 임상에 적용할 수 있을 정도의 양으로 줄기세포를 대량 생산할 수 있으므로 줄기세포의 투여에 의한 세포치료 효능을 획기적으로 증진시킬 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 줄기세포를 기본배지; 및 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 아소코르브산 (ascorbic acid), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, 덱사메타손, bFGF (basic fibroblast growth factor), 헤파란 황산 (heparan sulfate), 2-메르캅토에탄올 (2-mercaptoethanol), EGF (epidermal growth factor) 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 2가지 이상의 성분을 함유하는 배지에서 줄기세포를 3회 내지 5회 계대 배양하는 단계를 포함하는, 1 × 107 ~ 5 × 108 세포수/ml의 줄기세포 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기본 배지는 M199/F12(mixture)(GIBCO), MEM-alpha배지(GIBCO), 저농도 글루코오스 함유 DMEM배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), K-SFM, DMEM/F12 배지, PCM 배지 및 MSC 확장 배지 (Chemicon)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 1 × 107 ~ 5 × 108 세포수/ml 의 줄기세포 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항산화제는 셀레늄, 비타민 E, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, 코엔자임 Q-10, EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DHA(docosahexanoic acid)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 1 × 107 ~ 5 × 108 세포수/ml 의 줄기세포 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항산화제는 셀레늄인 것을 특징으로 하는 1 × 107 ~ 5 × 108 세포수/ml 의 줄기세포 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배지는 FBS (fetal bovin serum), 칼슘 및 EGF으로 구성된 군에서 선택되는 성분을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 1 × 107 ~ 5 × 108 세포수/ml 의 줄기세포 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 1 × 107 ~ 5 × 108 세포수/ml 의 줄기세포 제조방법.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101830062B1 (ko) * 2017-06-30 2018-02-20 주식회사 차바이오텍 피부줄기세포 배양액을 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물 및 이의 용도
KR20190003303A (ko) * 2017-12-26 2019-01-09 (주) 차바이오에프앤씨 피부줄기세포 배양액을 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물 및 이의 용도
WO2019004800A3 (ko) * 2017-06-30 2019-05-23 주식회사 차바이오텍 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 및 이의 제조 방법
US10640541B2 (en) 2015-09-15 2020-05-05 Stemlab Inc. Method for preparing composition for promoting hair growth using Nanog-introduced mesenchymal stem cells derived from fetus in amniotic fluid

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2811015B1 (en) * 2011-12-01 2020-09-02 R Bio Co., Ltd. Culture-medium composition for rejuvenating stem cells
CN104520423B (zh) 2012-04-18 2017-07-04 K-干细胞有限公司 用于生产具有适于血管内给药的尺寸的干细胞的方法
CN105473706B (zh) 2013-06-14 2021-10-26 昆士兰大学 肾祖细胞
KR101753557B1 (ko) 2014-06-30 2017-07-05 가톨릭대학교 산학협력단 줄기세포 증식 향상 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법
CN106659741B (zh) * 2014-07-07 2020-03-17 米迪波斯特股份有限公司 小尺寸干细胞的毛发生长促进功能及其用途
US10287551B2 (en) 2014-10-29 2019-05-14 R Bio Co., Ltd. Medium composition for culturing stem cells
US20180037867A1 (en) * 2015-03-04 2018-02-08 Mesoblast International Sàrl Cell culture method for mesenchymal stem cells
US10894947B1 (en) * 2016-04-29 2021-01-19 Hope Biosciences, Llc Method for generating protein rich conditioned medium
JP6918943B2 (ja) * 2016-07-29 2021-08-11 ラ，チョンチャン 癌細胞の増殖を抑制する間葉幹細胞の製造方法
US11268950B2 (en) 2016-09-28 2022-03-08 Organovo, Inc. Use of engineered renal tissues in assays
EP3569239A4 (en) * 2017-01-11 2020-12-09 Stemlab Inc. METHOD OF PREPARING A COMPOSITION IN AN EXOSOME FROM NANG-INTRODUCED FETAL MESENCHYMAL STEM CELL IN THE FRUIT WATER FOR HAIR GROWTH
KR101878441B1 (ko) * 2017-02-14 2018-07-16 경상대학교산학협력단 신생아 말초혈액 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법
KR102025474B1 (ko) * 2017-10-30 2019-09-25 사회복지법인 삼성생명공익재단 에티오나마이드를 이용한 줄기세포 이동성 향상 방법
US11932874B2 (en) * 2018-05-25 2024-03-19 R Bio Co., Ltd. Method for culturing mesenchymal stem cells using gamma-irradiated serum
KR102556520B1 (ko) * 2019-07-15 2023-07-18 사회복지법인 삼성생명공익재단 에티오나마이드를 이용한 줄기세포의 효능 강화방법
CN111150746A (zh) * 2020-01-06 2020-05-15 湖南护宫福生物科技有限公司 一种用于阴道给药治疗妇科炎症的干细胞修复液
CN113801836A (zh) * 2020-06-16 2021-12-17 台湾粒线体应用技术股份有限公司 提升线粒体功能的培养方法及其使用的组合物
KR102439335B1 (ko) * 2021-12-10 2022-09-02 주식회사 엠케이바이오텍 태반-유래 줄기세포를 함유하는 피부 재생용 바이오패치형 세포치료제

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6103530A (en) * 1997-09-05 2000-08-15 Cytotherapeutics, Inc. Cultures of human CNS neural stem cells
WO2006019357A1 (en) 2004-08-16 2006-02-23 Cellresearch Corporation Pte Ltd Isolation of stem/progenitor cells from amniotic membrane of umbilical cord.
KR100795708B1 (ko) 2006-12-26 2008-01-17 주식회사 알앤엘바이오 인간 양막 상피세포 유래 성체 줄기세포의 분리 및 배양방법
KR100818214B1 (ko) 2006-09-29 2008-04-01 재단법인서울대학교산학협력재단 인간 태반조직의 양막 또는 탈락막 유래 다분화능 줄기세포및 그 제조방법
KR20080075959A (ko) * 2007-02-14 2008-08-20 (주)프로스테믹스 지방 줄기세포의 조직 재생 능력을 최적화한 배양액을 함유한 조직 재생용 주사제 조성물
US20090124007A1 (en) * 2006-11-15 2009-05-14 Seoul National University Industry Foundation Method for the Simultaneous Primary-Isolation and Expansion of Endothelial Stem/Progenitor Cell and Mesenchymal Stem Cell Derived From Mammal Including Human Umbilical Cord
US20090233360A1 (en) * 2008-03-17 2009-09-17 Uti Limited Partnership Methods and Compositions for Culturing of neural Precursor Cells
US20110312091A1 (en) * 2008-12-17 2011-12-22 Baona Zhao Pluripotent stem cells, method for preparation thereof and uses thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100679642B1 (ko) * 2005-11-16 2007-02-06 주식회사 알앤엘바이오 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 및 이를 함유하는세포치료제
NZ595786A (en) * 2005-12-29 2013-05-31 Anthrogenesis Corp Placental stem cell populations
CN101473030A (zh) * 2006-06-15 2009-07-01 Rnl生物技术株式会社 含有来自人类脂肪组织的多塑性干细胞、成纤维细胞和脂肪或脂肪细胞的整容或整形组合物
JP2013529917A (ja) * 2010-06-17 2013-07-25 ステムアールディー， インコーポレイテッド 化学的に定められている無血清細胞培養培地
KR101211913B1 (ko) * 2010-07-16 2012-12-13 주식회사 알앤엘바이오 양막유래 중간엽 줄기세포 배양을 위한 배지조성물 및 이를 이용한 양막유래 중간엽 줄기세포의 배양방법
EP2811015B1 (en) * 2011-12-01 2020-09-02 R Bio Co., Ltd. Culture-medium composition for rejuvenating stem cells

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6103530A (en) * 1997-09-05 2000-08-15 Cytotherapeutics, Inc. Cultures of human CNS neural stem cells
WO2006019357A1 (en) 2004-08-16 2006-02-23 Cellresearch Corporation Pte Ltd Isolation of stem/progenitor cells from amniotic membrane of umbilical cord.
KR100818214B1 (ko) 2006-09-29 2008-04-01 재단법인서울대학교산학협력재단 인간 태반조직의 양막 또는 탈락막 유래 다분화능 줄기세포및 그 제조방법
US20090124007A1 (en) * 2006-11-15 2009-05-14 Seoul National University Industry Foundation Method for the Simultaneous Primary-Isolation and Expansion of Endothelial Stem/Progenitor Cell and Mesenchymal Stem Cell Derived From Mammal Including Human Umbilical Cord
KR100795708B1 (ko) 2006-12-26 2008-01-17 주식회사 알앤엘바이오 인간 양막 상피세포 유래 성체 줄기세포의 분리 및 배양방법
KR20080075959A (ko) * 2007-02-14 2008-08-20 (주)프로스테믹스 지방 줄기세포의 조직 재생 능력을 최적화한 배양액을 함유한 조직 재생용 주사제 조성물
US20090233360A1 (en) * 2008-03-17 2009-09-17 Uti Limited Partnership Methods and Compositions for Culturing of neural Precursor Cells
US20110312091A1 (en) * 2008-12-17 2011-12-22 Baona Zhao Pluripotent stem cells, method for preparation thereof and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP2865749A4

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10640541B2 (en) 2015-09-15 2020-05-05 Stemlab Inc. Method for preparing composition for promoting hair growth using Nanog-introduced mesenchymal stem cells derived from fetus in amniotic fluid
KR101830062B1 (ko) * 2017-06-30 2018-02-20 주식회사 차바이오텍 피부줄기세포 배양액을 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물 및 이의 용도
WO2019004800A3 (ko) * 2017-06-30 2019-05-23 주식회사 차바이오텍 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 및 이의 제조 방법
RU2754043C2 (ru) * 2017-06-30 2021-08-25 Чха Байотек Ко., Лтд. Культуральная среда клеток-предшественников кожи, происходящих из стволовых клеток, и способ ее получения
US11773370B2 (en) 2017-06-30 2023-10-03 Cha Biotech Co., Ltd. Stem cell-derived skin precursor cell culture medium and preparation method therefor
KR20190003303A (ko) * 2017-12-26 2019-01-09 (주) 차바이오에프앤씨 피부줄기세포 배양액을 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물 및 이의 용도
KR102178778B1 (ko) * 2017-12-26 2020-11-13 (주) 차바이오에프앤씨 피부줄기세포 배양액을 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물 및 이의 용도

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