KR102218126B1 - 소변 유래 줄기세포의 미분화능을 유지하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소변으로부터 분리된 줄기세포가 계대배양 동안 미분화능을 유지하도록 하는 요줄기세포의 배양방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 요 줄기세포의 미분화능을 유지하는 방법은 장기간의 계대배양에서도 미분화능이 유지되는 요줄기세포를 얻을 수 있어, 임상적으로 사용가능한 요 줄기세포 수량을 확보하는데 매우 유용하다.

Description

소변 유래 줄기세포의 미분화능을 유지하는 방법{Method for Maintaining Ability of Undiffrentation of Urine Stem Cell}

본 발명은 소변 유래 줄기세포(이하, 요尿)줄기세포의 미분화능을 유지하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 소변으로부터 분리된 줄기세포가 계대배양 동안 미분화능을 유지하도록 하는 요줄기세포의 배양방법에 관한 것이다.

줄기세포는 크게 배아줄기세포와 성체줄기세포로 나눌 수 있으며, 이 중 성체줄기세포는 중간엽줄기세포와 조혈모세포로 나눌 수 있다. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 태반 (placenta), 양막 (amniotic membrane), 지방 조직 (adipose tissue), 골수 (bone marrow), 제대혈 (umbilical cord blood) 등 다양한 조직에 존재하며, 골세포, 지방세포, 연골세포로 분화하는 능력을 가지고 있다. 중간엽줄기세포는 주로 제대혈이나, 지방조직에서 분리되어 제조되어 왔으며, 이렇게 제조된 중간엽 줄기세포는 체내 및 체외에서 다양한 세포로 분화가 가능한 다능성 (multipotency)을 지니고 있어, 질병치료와 다방면으로 활용 연구가 활성화되고 있다.

그러나, 제대혈, 태반 등의 조직에서 중간엽 줄기세포를 분리하는데는 윤리적 제한이 있기 때문에 세포치료제로 사용하기에 한계가 있으며, 채취되는 조직의 양이 한정되어 있어 다량의 줄기세포를 획득하는데 어려움이 있다. 또한, 지방조직에서 중간엽 줄기세포를 분리하기 위하여는 침습적인 방법을 사용하여야 하기 때문에 고통과 수고를 유발하게 된다.

최근에는 소변에 중간엽줄기세포가 다량으로 존재하는 것을 확인하고, 요 줄기세포는 줄기세포를 소변에서 획득하는 대표적인 비침습적 방식으로서, 다른 중간엽 줄기세포에 비해 통증과 후유증을 전혀 유발하지 않으므로 기존의 침습적 방식에 비해 안전하고 용이하다는 장점이 있다. 또한, 요 줄기세포는 여러 번 수확이 가능하여 조치 배양에 필요한 줄기세포 수가 기존 세포원에 비해 많고, 요 줄기세포는 HLA-DR의 발현이 낮아 면역 반응을 유발하지 않는 자가세포치료제로 사용 가능하다는 점에서 임상적 접근이 매우 용이하다.

요 유래 세포 배양 기술의 경우, 1972년 영국의 Sutherland와 Bain에 의해 최초로 개발된 이래, 현재까지 다양한 연구에서 인간의 체세포원으로 활용되고 있다. 특히, 2011년 중국의 Ting Zhou에 의해 유도만능줄기세포 확립 기술의 세포원으로 사용됨으로써 환자 특이적인 세포원으로써 그 가치가 더욱 증대되고 있는 실정이다. 그러나, 소변에서 분리된 줄기세포의 경우, 계대배양 시에 분화능을 상실하고 섬유아세포 표현형이 나타나는 경향이 있어, 요줄기세포의 미분화능을 유지시키는 배양방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 요줄기세포의 장기 배양시에도 미분화능을 유지시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여, 예의 노력한 결과, 기존의 줄기세포 배양 배지에 멜라토닌을 첨가하여 요줄기세포를 배양하는 경우, 미분화능 판별 마커인 CD133 양성 세포가 멜라토닌 미처리군에 비하여 현저히 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 요줄기세포의 미분화능을 유지시키는 배양방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적은 미분화능이 유지된 요줄기세포의 제조방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 요 줄기세포를 분리하여 부착배양하는 단계; 및 (b) 상기 부착배양된 요 줄기세포를 멜라토닌을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 요줄기세포의 미분화능을 유지시키는 배양방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 요 줄기세포를 분리하여 부착배양하는 단계; (b) 상기 부착배양된 요 줄기세포를 멜라토닌을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 요 줄기세포를 수득하는 단계를 포함하는 미분화능이 유지된 요줄기세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 요 줄기세포의 미분화능을 유지하는 방법은 장기간의 계대배양에서도 미분화능이 유지되는 요줄기세포를 얻을 수 있어, 임상적으로 사용가능한 요 줄기세포 수량을 확보하는데 매우 유용하다.

도 1은 멜라토닌 미첨가 배지와 멜라토닌 첨가 배지에서 배양된 요줄기세포의 세포형태를 나타낸 사진이다.
도 2는 멜라토닌 미첨가 배지와 멜라토닌 첨가 배지에서 배양된 요줄기세포의 배양시 생존율을 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 사람의 소변을 채뇨하여 요 줄기세포를 분리하였으며, 줄기세포능을 유지하기 위한 배지로 배양하여 미분화능이 유지된 요 줄기세포를 수득하였다. 구체적으로는, 소변을 원심분리하여 세포 침전물을 FBS가 포함된 DMEM/F12 : KSFM (1:1)의 부착배지에서 배양하여 요 줄기세포를 분리한 후, 멜라토닌이 첨가된 B배지에서 계대배양하였다. 그 결과, 멜라토닌을 함유하는 배지를 사용한 세포에서 4계대 후에도 미분화 마커인 CD133 마커 발현량이 높은 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 본 발명은(a) 요 줄기세포를 분리하여 부착배양하는 단계; 및 (b) 상기 부착배양된 요 줄기세포를 멜라토닌을 포함하는 배지에서 배양하는 단계.를 포함하는 요줄기세포의 미분화능을 유지시키는 배양방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 멜라토닌은 0.001~10 mM 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.01~1mM 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1~1mM 농도로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 배지는 아스코브산, b-FGF, MEM NEAA, EGF, 셀레늄, 인슐린, 하이드로코티손, 칼슘, NAC 및 FBS를 포함하는 배지인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배지는 DMEM, K-SFM 또는 DMEM과 K-SFM의 혼합배지인 것을 특징으로 할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 (a) 요 줄기세포를 분리하여 부착배양하는 단계; (b) 상기 부착배양된 요 줄기세포를 멜라토닌을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 요 줄기세포를 수득하는 단계를 포함하는 미분화능이 유지된 요줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 멜라토닌은 0.001~10 mM 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.01~1mM 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1~1mM 농도로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 배지는 아스코브산, b-FGF, MEM NEAA, EGF, 셀레늄, 인슐린, 하이드로코티손, 칼슘, NAC 및 FBS를 포함하는 배지인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배지는 DMEM, K-SFM 또는 DMEM과 K-SFM의 혼합배지인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배지는 항산화제를 추가로 함유하는 것이 바람직하며, 상기 항산화제는 셀레늄 (selenium), 비타민 E, 아스코르브산, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, 코엔자임 Q-10, EPA (eicosapentaenoic acid) 또는 DHA (docosahexanoic acid)인 것이 더욱 바람직하고, 가장 바람직하게는 셀레늄을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 항산화제로서 셀레늄을 사용하였으며, 사용되는 셀레늄은 0.5 ~ 1 ng/mL 을 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 이의 함량이 0.5 ㎍/ℓ미만이면 산소독성에 민감하며, 10 ㎍/ℓ을 초과하면 심각한 세포독성을 초래한다.

또한, 배지는 등장액 중의 중성 완충제 (예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분 (예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질 (지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분 (예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다.

본 발명에서 인슐린을 대체하는 성분으로 인슐린 유사인자를 사용하며, 이는 포도당 대사와 단백질 대사를 향상시켜 세포성장을 촉진하는 역할을 하며, 특히 바람직하기로는 재조합 IGF-1 (Insulin-like growth factor-1)을 사용한다. 인슐린 유사인자의 바람직한 함량은 10 ~ 50 n/mL이며, 이의 성분이 10ng/mL 미만일 경우에는 세포자살(Apoptosis)을 초래하며, 50 ㎍/ℓ을 초과할 경우에는 세포독성 및 비용증가의 문제점이 있다.

본 발명에서는 상피세포 성장인자 (Epidermal growth factor; EGF)를 사용하였으며, EGF는 in vivo 상태에서 다양한 형태의 세포증식을 야기할 수 있으며, 바람직하기로는 재조합 단백질을 사용한다. 상피세포 성장인자의 바람직한 함량은 10 ~ 50 ng/mL이며, 이의 함량이 10 ng/mL 미만이면 특별한 효과가 없으며, 50ng/mL을 초과하면 세포에 독성을 가진다.

또한, 본 발명에서는 섬유아세포 증식인자 (bFGF)를 사용하며, 이는 in vivo 상태에서 다양한 형태의 세포증식을 야기할 수 있으며, 바람직하기로는 재조합 단백질을 사용한다. 섬유아세포 증식인자의 바람직한 함량은 1 ~ 100 ng/mL이다.

일반적으로 줄기세포를 배양하고 유지하기 위해서는 소 유래 혈청이 필요한데, 세포 배양액을 임상적 용도로 사용하기 위해서는 배양액 중에 소 유래 혈청이 포함되지 않는 것이 바람직하다. 줄기세포의 배양 배지에 소 유래 혈청이 포함되지 않을 경우 세포를 안정적으로 유지하기 어렵다.

본 발명에서는 소 유래 혈청이 포함되지 않은 무혈청 배지에서 요 줄기세포를 안정적으로 배양할 수 있는 방법을 제공한다. 이 방법에 따라 얻어진 배양액은 기존의 방법으로 생산된 배양액에 비해 매우 고함량의 성장인자를 포함한다. 따라서 임상적으로 매우 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명에서 "생리활성물질"은 세포나 신체의 기능에 영향을 미칠 수 있는 사이토카인, 세포성장인자 등을 통칭하여 나타낸다. 생리활성물질의 예로는 EGF (epidermal growth factor), IL-1α (Interleukin-1 alpha), TNF-α (tumor necrosis factor-alpha), TGF-β (Transforming growth factor beta), HGF (Hepatocyte Growth Factor), PGE2(Prostaglandin E2), TGF-β1 (Transforming growth factor beta1), FGF (fibroblast growth factor), FGF-2 (fibroblast growth factor-2), VEGF (Vascular endothelial growth factor), PDGF (Platelet derived growth factor), IL-6 (Interleukin-6) 등을 포함하며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 사용하는 용어 "줄기세포 배양액"은 줄기세포를 배양한 세포배양 상등액을 지칭한다. 줄기세포 배양액은 줄기세포 배양 과정에서 세포로부터 분비되는 여러 가지 생리활성 물질을 함유하고 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "줄기세포(stem cell)"란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, "성체 줄기세포"는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "중간엽 줄기세포"는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 줄기세포로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있다 특히, 제대 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 근육 유래 중간엽 줄기세포, 신경 유래 중간엽 줄기세포, 피부 유래 중간엽 줄기세포, 양막 유래 중간엽 줄기세포, 태반 유래 중간엽 줄기세포 및 소변 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.

본 발명에서 용어 "요 줄기세포 (Urine stem cell; USC)"는 소변에서 분리 배양된 줄기세포 특성을 지닌 세포를 의미한다.

본 발명에서, "배지(culture media)"는 체외배양 조건에서 줄기세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배양액을 의미하고, 줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 또한, 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다.

본 발명에서 "계대 배양"이란 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대 (代)를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지 (배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대 (1 passage)라고 한다 계대 배양의 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 바람직하게는 효소적 분리로 수행될 수 있다.

본 발명에서, "효소적 분리"란 효소 처리를 통하여 세포 덩어리를 분리하는 것을 의미하며, 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 콜라게네이즈 I, II, III, IV를 포함하는 콜라게네이즈 (Collagense), 아큐타제 (Accutase), 디스파제 (Dispase) 또는 트립신을 처리하여 분리하여 계대 배양할 수 있다.

본 발명에서, "조건 배지 (conditioned mdeium)"란 세포를 세포분열 최성기인 대수성장기에 도달했을 때 무혈청 배지로 교환한 후 배양액만 수거한 배지를 말한다. 이는 분열중인 세포로부터 배지 내에서 추출되어 나오는 미지의 성장인자 (growth factor), 사이토카인 (cytokine)을 이용하는 것을 말한다. 상기 조건 배지는 요 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 후 요 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포를 제거한 용액을 포함하는 것으로서, 요 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 성장인자, 사이토카인 등의 물질이 풍부하게 함유되어 있을 수 있다.

본 발명에 있어서, 요 줄기세포 배양에 사용되는 배지는 DMEM과 KSFM, 5~10% FBS 조합이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 배지는 당 업계에 공지된, 중간엽 줄기세포의 미분화된 표현형의 증식을 촉진하면서 분화는 억제하는 첨가제로 보충될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 요 줄기세포의 분리

건강한 성인의 소변을 채뇨통에 200mL 이상 수집하여 50mL 튜브에 40mL씩 분주하여 500g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후 항생제가 포함된 PBS로 펠렛을 세척하고, 원심분리한 4~5개의 튜브를 20mL의 PBS로 한 튜브로 모아 500g, 5분 동안 다시 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 20mL의 PBS로 2차 세척 후 100㎛ Cell strainer에 거르고 한번 더 원심분리 후 상등액을 제거하였다. 세포 침전물을 부착배지 (DMEM/F12(Gibco, BRL) : KSFM(Invigtrogen) (1:1), 10% FBS, 2X Antibiotic-Antimycotic)에 부유시킨 다음, 제1형 콜라겐이 코팅된 12웰 플레이트에 시딩하였다.

48시간 이후 처음으로 배지를 교환하고, 세포가 confluency 90% 이상 도달될 때까지 48시간 간격으로 배지 교환을 수행하였다.

실시예 2: 요줄기세포의 계대배양

실시예 1에서 분리된 요줄기세포의 세포증식이 confluency 90% 이상 도달하면 배양 배지를 제거하고 PBS로 세척 후 트립신을 처리하여 세포를 회수하였다.

1700rpm에서 3분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 1:3 계대하여 대조군은 A 배지(표 1), 실험군 1은 B 배지(표 2) 및 실험군 2는 B 배지에 0.5mM 멜라토닌(melatonin)을 첨가한 배지를 사용하여 현탁하여 12웰 플레이트에 1 웰씩 배양하였다(passage 2). 배지 교환은 48시간 간격으로 confluency 90% 이상 배양될 때까지 실시하였다. 이후 동일한 방법으로 세포를 회수하여 12웰 플레이트에 1:2 계대배양(passage 3), T25 플라스크(passage 4)로 배양 용기의 면적을 넓혀가며 배양하였다.

A 배지 조성

성분	입수처	농도
KSFM, DMEM (1:1)	Invigtrogen, Gibco, BRL	기본배지
FBS	Invigtrogen	5%
Ascorbic acid	Sigma-aldrich	0.2mM
bFGF	Prospec	10ng/mL
EGF	Prospec	10ng/mL
셀레늄	Sigma-aldrich	5ng/mL
인슐린	Sigma-aldrich	5ug/mL
하이드로코티손	Sigma-aldrich	74ng/mL
칼슘	Sigma-aldrich	0.09mM
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-aldrich	2mM

B 배지 조성

기본배지		기본배지		입수처	혼합비
DMEM based 배지		KSFM based 배지			2:1 (DMEM based 배지: KSFM based 배지)
Ascorbic acid	0.2mM	Ascorbic acid	0.2mM	Sigma-aldrich
bFGF	10ng/mL	bFGF	10ng/mL	Prospec
MEM NEAA	100ㅧ	EGF	10ng/mL	Prospec
FBS	10%	셀레늄	5ng/mL	Sigma-aldrich
		인슐린	5ug/mL	Sigma-aldrich
		하이드로코티손	74ng/mL	Sigma-aldrich
		칼슘	0.09mM	Sigma-aldrich
		N-acetyl-L-cysteine	2mM	Sigma-aldrich

실험군 별 세포 배양 시 생존율은 모두 80% 이상으로 측정되었으며(도 1), 멜라토닌 첨가군은 세포증식에 있어 다른 실험군보다 낮은 증식률이 상대적으로 낮은 것으로 나타났다

실시예 3: 요줄기세포의 표면 CD마커의 확인

실시예 2에서 각 배지별로 배양한 세포의 CD 마커의 발현 수준을 확인하기 위하여 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)을 이용하여 확인하였다.

Passage 4의 세포를 효소처리하여 배양플라스크에서 분리하여 세포를 회수하였다. 세포를 PBS로 세척하고 일차항체의 비특이적 결합을 차단하기 위하여 5% BSA 함유 PBS에 재현탁하여 1시간 동안 냉장 처리하였다. 세포를 PBS로 2회 세척 후, Isotype control antibodies (IgG1-PE)와 Fluorochrome conjugated antibodies(표 3 )을 30분 동안 냉장에서 반응시켰다. 이어서 PBS로 2회 세척 후 펠렛을 PBS에 재 현탁하여 작은 세포 파편과 응집체를 배제한 살아있는 세포를 각 시료 당 최소 1.0 x 10⁴ cells 씩 FACS Calibur (BD Biosciences, USA) 유세포 분석기를 사용하여 측정하고, 형광 발현된 세포 수를 전체 세포군에서 차지하는 퍼센트 비율을 Cell Quest (BD Biosciences, USA) 소프트웨어로 분석하였다.

FACS 분석용 일차 항체

Primary Antibody	Company / Cat No.
PE Mouse Anti-Human CD24	BD, 555428
PE Mouse Anti-Human CD90	BD, 555596
PE Mouse Anti-Human CD133	BD, 566593
PE Mouse lgGI k Isotype Control	BD, 555749

각 배양 배지 별로 배양한 요줄기세포를 표지 항원으로 간엽 줄기세포 마커 (mesenchymal stem cell markers)인 CD90을 확인한 결과 양성을 나타냈으며 실험군 2의 경우 CD90이 다른 실험군보다 증가되는 것을 확인하였다(표 4).

신장의 보우만캡슐의 parietal epithelial cells(PECs)에는 신장의 성체줄기세포의 근원이 있는 것으로 알려져 있고 이 줄기세포의 마커로 CD24 와 CD133 가 양성인 세포가 자기 재생능력과 다능성의 특징을 가지고 있다고 보고 되고 있다.

신장상피세포 마커로 알려진 CD24와 CD133을 확인한 결과, CD24는 모두 강한 양성을 나타냈으며, CD133의 경우 실험군 1에 비하여 멜라토닌 첨가군(실험군 2)에서 증가되는 것을 확인하였으며, 멜라토닌 첨가가 CD90과 CD133의 발현을 높일 수 있음을 확인하였다(표 4).

아울러, 멜라토닌을 농도별로 추가한 패시지 5의 요줄기세포의 CD133 발현을 확인한 결과를 표 5에 나타내었다.

배양 배지별 CD 마커 발현 %(P4)

	Media	CD24	CD90	CD133
대조군	A 배지(표 1)	99.95 %	76.14 %	97.61 %
실험군 1	B 배지(표 2)	99.97 %	75.03 %	52.71 %
실험군 2	B 배지 + melatonin(0.5mM)	99.95 %	91.76 %	97.94 %

멜라토닌 농도별 CD133 마커 발현 %(P5)

배지	멜라토닌 농도	CD133
B 배지 (P5)	0	75.98 %
	0.05mM	84.18 %
	0.5mM	92.91 %
	1mM	93.95 %

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (8)

1. 다음 단계를 포함하는 요줄기세포의 미분화능을 유지시키는 배양방법:
   (a) 요 줄기세포를 분리하여 부착배양하는 단계; 및
   (b) 상기 부착배양된 요 줄기세포를 아스코브산, b-FGF, MEM NEAA, EGF, 셀레늄, 인슐린, 하이드로코티손, 칼슘, NAC, FBS 및 멜라토닌을 포함하는 배지에 서 배양하는 단계.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 멜라토닌은 0.001~10 mM 농도로 함유되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 배지는 DMEM, K-SFM 또는 DMEM과 K-SFM의 혼합배지인 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 다음 단계를 포함하는 미분화능이 유지된 요줄기세포의 제조방법:
   (a) 요 줄기세포를 분리하여 부착배양하는 단계;
   (b) 상기 부착배양된 요 줄기세포를 아스코브산, b-FGF, MEM NEAA, EGF, 셀레늄, 인슐린, 하이드로코티손, 칼슘, NAC, FBS 및 멜라토닌을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
   (c) 상기 배양된 요 줄기세포를 수득하는 단계.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 멜라토닌은 0.001~10 mM 농도로 함유되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 삭제
8. 제5항에 있어서, 상기 배지는 DMEM, K-SFM 또는 DMEM과 K-SFM의 혼합배지인 것을 특징으로 하는 방법.
   

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