KR20170126564A

KR20170126564A - 소변 유래 세포 배양용 배지 조성물

Info

Publication number: KR20170126564A
Application number: KR1020160056659A
Authority: KR
Inventors: 유승권; 고위위; 강필준; 박규만
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2016-05-09
Filing date: 2016-05-09
Publication date: 2017-11-20
Also published as: KR101960497B1

Abstract

본 발명은 소변 유래 세포의 안정적인 배양을 유지시켜 줄 수 있는 세포 배양용 배지 조성물 및 이의 배양방법에 관한 것으로, 기존의 배양방법과 비교하여 배양 기간을 늘릴 수 있으며, 신장세포 특이적인 분화 마커 유전자의 발현 확인을 통해 소변 유래 세포의 분화능력을 향상시킬 수 있다.

Description

소변 유래 세포 배양용 배지 조성물 {Medium composition for culturing urine-derived cells}

본 발명은 소변 유래 세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 소변 유래 세포의 배양방법에 관한 것이다.

소변 유래 세포의 배양은 인간의 체세포를 배양함에 있어 대표적인 비침습적 방식으로서, 기존의 침습적 방식에 비해 공여자에게 안전하고 용이하다는 장점을 가지고 있는바, 세포 모델링 및 규모가 큰 세포 라인 확보에 활용되고 있다. 소변 유래 세포 배양 기술의 경우, 1972년 영국의 Sutherland와 Bain에 의해 최초로 개발된 이래, 현재까지 다양한 연구에서 인간의 체세포원으로 활용되고 있다. 특히, 2011년 중국의 Ting Zhou에 의해 유도만능줄기세포 확립 기술의 세포원으로 사용됨으로써 환자 특이적인 세포원으로써 그 가치가 더욱 증대되고 있는 실정이다.

이러한 중요성에도 불구하고, 기존의 배양방법으로는, 소변 유래 세포의 노화가 급격히 진행되어 유도만능줄기세포 확립 기술의 경우, 3번 이내의 계대배양 수준에서 실험을 진행해야 하며, 5번 이상의 계대배양이 지날 경우 세포의 생장이 급격히 감소하여 배양이 어렵다는 한계가 존재하였다. 이러한 배경 하에서, 연속적인 계대배양에도 세포의 생장이 유지될 수 있는, 소변 유래 세포 배양기술에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직은 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 소변 유래 세포가 신장의 조직에서 유래하였을 가능성이 높다는 점, 및 초기 계대배양시 매우 활발한 분열 활동을 한다는 점에 착안하여, 해당 소변 유래 세포는 신장 전구세포의 특성을 지니고 있을 것이라고 전제하였으며, 이러한 점에 기반하여 신장 전구세포 특이적 성장인자 (FGF 9 (Fibroblast growth factor 9), FGF 2 (Fibroblast growth factor 2), Activin A)를 첨가한 배양용 배지 조성물에 소변 유래 세포를 배양시킨 결과, 기존의 방식에 비해 보다 안정적으로 배양될 수 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 세포 배양 배지, 및 신장 전구세포 특이적 성장인자를 함유하는, 소변 유래 세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 배양용 배지 조성물에 소변 유래 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 소변 유래 세포의 배양방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 세포 배양 배지, 및 FGF 9 (Fibroblast growth factor 9)을 함유하고, FGF 2 (Fibroblast growth factor 2), 및 Activin A로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인자를 함유하는, 소변 유래 세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 세포 배양 배지는 Advanced-RPMI 1640 배지일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 FGF 9 (Fibroblast growth factor 9)은 50 내지 150ng/ml 농도로 함유될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 FGF 2 (Fibroblast growth factor 2)는 50 내지 150ng/ml 농도로 함유될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 Activin A는 5 내지 15ng/ml 농도로 함유될 수 있다.

또한, 본 발명은 배양용 배지 조성물에 소변 유래 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 소변 유래 세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 소변 유래 세포는 NCAM1, WT-1, SIX2, 및 CITED1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자가 발현되어 있을 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예로서, 상기 방법은 세포 배양 배지, FGF 9 (Fibroblast growth factor 9), 및 FGF 2 (Fibroblast growth factor 2)를 함유하는, 배양용 배지 조성물에 소변 유래 세포를 3 내지 5회 계대배양하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 계대배양된 소변 유래 세포를 세포 배양 배지, FGF 9 (Fibroblast growth factor 9), 및 Activin A를 함유하는, 배양용 배지 조성물에 계대배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예로서, 상기 세포 배양 배지는 Advanced-RPMI 1640 배지일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 배양방법에 의해 배양된 소변 유래 세포의 신장 질환에 대한 치료 용도를 제공한다.

도 1은, 수득한 직후의 소변 유래 세포 (UC-P1), 기존의 배양 조성물에 의한 소변 유래 세포 (UC-P3), 및 본 발명의 1차 계대배양 조성물에 의한 소변 유래 세포 (FGF2/FGF9)에서, 신장 전구세포 특이적 인자들 (E-cadherine, beta-catenin, vimentin, CD13, L1CAM, OSR1, PAX2 및 SIX2 등)의 발현 양상을 관찰한 결과이다.
도 2는, 기존의 방법을 통해 3회차까지 계대배양한 경우 (UC), 및 본 발명의 1차 계대배양 방법을 통해 3회차까지 계대배양한 경우 (FGF2/FGF9), 각각의 배양 조건에 따른 생장 변화를 비교한 결과이다.
도 3은, 기존의 방법을 통해 7회차까지 계대배양한 경우(UC medium), 및 본 발명의 1차 계대배양 방법에 의해 7회차까지 계대배양한 경우 (FGF2/FGF9 medium), 각각의 배양 조건에 따른 소변 유래 세포의 생장 변화를 비교한 결과이다.
도 4는, 5회차 이후, 본 발명의 2차 계대배양 방법으로 배양한 경우 (FGF9/ Activin A medium), 소변 유래 세포의 생장 변화를 확인한 결과이다.
도 5는, 5회차 이후, 본 발명의 2차 계대배양 방법으로 배양한 22개의 세포주에서, 신장 전구세포 특이적 인자 (NCAM1, WT-1, SIX2, 및 CITED1)들의 발현 양상을 관찰한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 세포 배양 배지, 및 FGF 9 (Fibroblast growth factor 9)을 함유하고, FGF 2 (Fibroblast growth factor 2), 및 Activin A로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인자를 함유하는, 소변 유래 세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 배양용 배지 조성물은 기존의 배양 조성물에 비해, 연속적인 계대배양 조건 하에서도, 소변 유래 세포의 신장세포 특이적 분화 마커 유전자의 발현을 유지하면서, 안정적으로 오랜 기간 배양시킬 수 있다는 점에 기술적 의의가 있으며, 바람직하게 초기 계대배양 조성물은 세포 배양 배지, FGF 9 (Fibroblast growth factor 9), 및 FGF 2 (Fibroblast growth factor 2)를, 후기 계대배양 조성물은 세포 배양 배지, FGF 9 (Fibroblast growth factor 9), 및 Activin A를 함유할 수 있다. 이 밖에도, 본 발명에 따른 배양용 배지 조성물은 당업계에서 일반적으로 알려진 세포 배양 배지 성분들이 포함될 수 있으며, 일례로서, FBS (Fetal Bovine Serum) 등과 같은 혈청 성분; 페니실린, 스트렙토마이신 등과 같은 약물 성분; 및 L-글루타민, 1% NEAA (Non-Essential Amino Acids) 등과 같은 아미노산 성분들이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한 구체예로서, 상기 세포 배양 배지는 Advanced-RPMI 1640 배지일 수 있으나, 소변 유래 세포가 배양될 수 있는 조건을 제공하는 조성을 제공하는 배지라면, 제한없이 포함될 수 있으며, 상기 소변 유래 세포는 NCAM1, WT-1, SIX2, 및 CITED1 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 신장 전구세포 특이적 인자가 발현되어 있는 세포일 수 있으나, 개체로부터 채취한 소변에 존재하는 세포라면 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서, "개체"는 신장 질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하며, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또한, 상기 FGF 9 (Fibroblast growth factor 9) 또는 FGF 2 (Fibroblast growth factor 2)는 바람직하게 50 내지 150ng/ml, 가장 바람직하게 100ng/ml 농도로 함유될 수 있으며, 상기 Activin A는 바람직하게 5 내지 15ng/ml, 가장 바람직하게 10ng/ml 농도로 함유될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 다른 양태로서, 상기 배양용 배지 조성물에 소변 유래 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 소변 유래 세포의 배양방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 세포 배양 배지, FGF 9 (Fibroblast growth factor 9), 및 FGF 2 (Fibroblast growth factor 2)를 함유하는, 배양용 배지 조성물에 소변 유래 세포를 계대배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 계대배양하는 단계는 바람직하게 3회 내지 5회, 가장 바람직하게는 5회까지 실시할 수 있으며, 다만, 5회 이상 실시할 경우에 급격한 세포 손상이 야기되어 안정적 배양이 불가능해진다는 한계가 있다 (실시예 2 참조).

이에, 본 발명은 상기의 한계를 극복하기 위한 방안으로서, 이후의 계대배양에서는 세포 배양 배지, FGF 9 (Fibroblast growth factor 9), 및 Activin A를 함유하는, 배양용 배지 조성물에 상기 소변 유래 세포를 계대배양할 수 있다. 상기와 같은 방법에 의해 소변 유래 세포의 신장 전구세포적 특성을 유지하면서, 5회 이상의 계대배양에서도 안정적인 배양 조건을 제공할 수 있다 (실시예 3 참조).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 제조예 ]

제조예 1. 소변 유래 세포의 배양

소변 유래 세포 배양을 위한 기존의 방법으로서, Lonza사의 REGM (Renal Epithelial Growth Medium)과 MC proliferation medium (DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 기본 배지로 이용하였으며, 상기 기본 배지에 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 100u/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 1% L-글루타민, 1% NEAA (Non-Essential Amino Acids), 5ng/ml FGF2, 5ng/ml EGF가 함유된 배지를 1:1로 혼합한, 배양 배지 조성물에 소변 유래 세포를 계대배양하였다.

한편, 본 발명의 배양방법에서는, Advanced-RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 기본 배지에, 100u/ml 페니실린, 1% L-글루타민, 100ng/ml FGF2, 및 100ng/ml FGF9이 함유된 배지 (FGF2/FGF9 배지)를 첨가한, 배양 배지 조성물에 소변 유래 세포를 5회차까지 계대배양하였다 (1차 계대배양으로 명명함.). 상기와 같이, 5회차까지 계대배양한 이후에는, Advanced-RPMI 1640 기본 배지에, 100u/ml 페니실린, 1% L-글루타민, 100ng/ml FGF9, 및 10ng/ml Activin A가 함유된 배지 (FGF9/Activin A 배지)를 첨가한, 배양 배지 조성물에 소변 유래 세포를 다시 계대배양하였다 (2차 계대배양으로 명명함.).

[ 실시예 ]

실시예 1. 초기 계대배양에서 신장 전구세포 특이적 인자의 발현 비교

본 실시예에서는, 검체로부터 수득한 직후의 소변 유래 세포에서, 다수 발현되는 인자들을 관찰하였으며, 상기 결과에 기초하여, 기존의 방법에 의해 3회차 계대배양한 경우와 본 발명의 방법에 의해 3회차 계대배양 (1차 계대배양)한 경우, 각각에 대한 신장 전구세포 특이적 인자의 발현 양상을 비교하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 수득한 직후의 소변 유래 세포에서는, 신장 전구세포에서 주로 발현된다고 알려진, E-cadherine, beta-catenin, vimentin, CD13, L1CAM, OSR1, PAX2 및 SIX2이 다량 발현되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 기존의 방법을 통해 3회 계대배양한 경우, WT-1, SIX2, SALL1, PAX2, OSR1, GDNF, 및 CITED1과 같은 신장 전구세포 특이적 인자의 발현이 나타나지 않은 반면, 본 발명의 1차 계대배양에 의한 경우, SIX2, SALL1, PAX2, OSR1 및 CITED1과 같은 신장 전구세포 특이적 인자의 발현을 확인할 수 있었는바, 기존의 배양 조건에 변화를 줌으로써, 소변 유래 세포의 생장에 변화를 줄 수 있음을 확인하였다.

실시예 2. 배양 조건 변화에 따른 초기 5회차 계대배양까지 소변 유래 세포 생장의 비교

본 실시예에서는, 상기 실시예 1의 결과에 기초하여, 배양 조건 변화에 따른 소변 유래 세포의 생장을 비교하였다. 구체적으로, 기존의 방법을 통해 7회차까지 계대배양한 경우와 본 발명의 방법에 의해 7회차까지 계대배양 (1차 계대배양)한 경우, 각각에 대한 소변 유래 세포의 생장을 비교하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 기존의 배양 조건에서 소변 유래 세포는 계대배양 4회차부터 점차 생장 능력이 감소하며 5회차의 경우, 세포의 노화가 급격히 진행되어 세포질이 넓게 퍼진 양상의 세포 모양을 확인할 수 있었다. 이에 반하여, 본 발명의 배양 조건에서 소변 유래 세포를 배양한 경우, 5회차까지 안정적으로 생장하는 양상을 확인할 수 있다. 다만, 이러한 배양 조건에서도 7회차 계대배양시, 급격한 세포 손상이 야기되어 안정적 배양이 불가능해짐을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 배양 조건 변화에 따른 5회차 이후의 계대배양시 소변 유래 세포 생장의 비교

본 실시예에서는, 5회차 이후의 계대배양에서도 안정적으로 소변 유래 세포를 배양할 수 있는 조건을 도출하고자, 5회차 이후의 계대배양에서는 상이한 조건 (2차 계대배양)에서 소변 유래 세포를 배양하였으며, 이에 따른 소변 유래 세포의 생장을 관찰하였다.

그 결과, 5회차 이후, 1차 계대배양 조건에서 배양한 경우, 7회차 이상에서 급격한 세포 손상이 야기되었던 반면 (도 3 참조), 도 4에 나타낸 바와 같이, 5회차 이후, 2차 계대배양 방법으로 배양한 경우, 9회차 이상까지 안정적으로 배양이 가능함을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 방법으로 진행하여 수득한 22개의 세포주에 발현된 신장 전구세포 특이적 인자들을 관찰한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, NCAM1, WT-1, SIX2, 및 CITED1 인자들이 여전히 발현되어 있음을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 본 발명의 배양방법은, 소변 유래 세포의 신장 전구세포적 특성을 유지하면서, 안정적인 세포 배양이 유도됨을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

세포 배양 배지, 및 FGF 9 (Fibroblast growth factor 9)을 함유하고, FGF 2 (Fibroblast growth factor 2), 및 Activin A로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인자를 함유하는, 소변 유래 세포 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 세포 배양 배지, FGF 9 (Fibroblast growth factor 9), 및 FGF 2 (Fibroblast growth factor 2)를 함유하는 것을 특징으로 하는, 소변 유래 세포 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 세포 배양 배지, FGF 9 (Fibroblast growth factor 9), 및 Activin A를 함유하는 것을 특징으로 하는, 소변 유래 세포 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서,
상기 세포 배양 배지는 Advanced-RPMI 1640 배지인 것을 특징으로 하는, 소변 유래 세포 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서,
상기 FGF 9 (Fibroblast growth factor 9)은 50 내지 150ng/ml 농도로 함유되는 것을 특징으로 하는, 소변 유래 세포 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서,
상기 FGF 2 (Fibroblast growth factor 2)는 50 내지 150ng/ml 농도로 함유되는 것을 특징으로 하는, 소변 유래 세포 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서,
상기 Activin A는 5 내지 15ng/ml 농도로 함유되는 것을 특징으로 하는, 소변 유래 세포 배양용 배지 조성물.
제1항의 배양용 배지 조성물에 소변 유래 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 소변 유래 세포의 배양방법.
제8항에 있어서,
상기 소변 유래 세포는 NCAM1, WT-1, SIX2, 및 CITED1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자가 발현되어 있는 것을 특징으로 하는, 소변 유래 세포의 배양방법.
제8항에 있어서,
상기 방법은 세포 배양 배지, FGF 9 (Fibroblast growth factor 9), 및 FGF 2 (Fibroblast growth factor 2)를 함유하는, 배양용 배지 조성물에 소변 유래 세포를 계대배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 소변 유래 세포의 배양방법.
제10항에 있어서,
상기 계대배양하는 단계는 3회 내지 5회 실시되는 것을 특징으로 하는, 소변 유래 세포의 배양방법.
제10항에 있어서,
상기 세포 배양 배지는 Advanced-RPMI 1640 배지인 것을 특징으로 하는, 소변 유래 세포의 배양방법.
제10항의 배양방법에 의한 소변 유래 세포를 세포 배양 배지, FGF 9 (Fibroblast growth factor 9), 및 Activin A를 함유하는, 배양용 배지 조성물에 계대배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 소변 유래 세포의 배양방법.
제13항에 있어서,
상기 세포 배양 배지는 Advanced-RPMI 1640 배지인 것을 특징으로 하는, 소변 유래 세포의 배양방법.