JP2009540826A - 軟骨細胞増幅のための無血清培地およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
この発明は化学的に定義された培養培地(DM)、該培地を作製する方法、および該培地の使用方法、たとえば細胞を培養すること、とりわけ、軟骨欠損の修復のためにヒト関節軟骨細胞を培養することを提供する。本発明のDMの特徴の一つは、1つまたは複数のIL−6ファミリーのうちの実質的に純粋なサイトカイン、たとえばオンコスタチンM(OSM)、インターロイキン6(IL−6)、および白血病抑制因子(LIF)などの存在である。
(a)実質的に純粋なPDGFおよびCDLMのうちの1つまたは両方;および
(b)実質的に純粋なOSM、実質的に純粋なIL−6、および実質的に純粋なL IF;
が補足された基礎培地(たとえば、cDRFまたはcDRFm)を含んでいてもよい。
たとえば、好ましい実施態様において、本発明のDMは含んでいてもよい:(a)基礎培地;(b)0.1−100ng/ml PDGF;(c)0.05−5% CDLM; (d)0.01−10ng/ml OSM;および/または(e)0.01−10ng/ml IL−6。
この発明は化学的に定義された培養培地(DM)、該培地を作製する方法、および該培地の使用方法、たとえば細胞を培養すること、とりわけ、軟骨欠損の修復のためにヒト関節軟骨細胞を培養することを提供する。本発明はPDGFおよびCDLMならびにIL−6ファミリーの1つまたは複数のサイトカインが補足されたcDRFmと言われる基礎培地が、培養中で再分化可能な軟骨細胞の接着、増殖および維持に十分であり、細胞培養のすべての段階において、血清含有培地と置き換えることができるという発見に少なくとも部分的に基づく。IL−6ファミリーのサイトカインは、たとえばOSM、IL−6、およびLIFを含む。
本発明の定義された無血清培地(DM)の作製の第一段階は基礎培地を得ることである。基礎培地はいかなる適当な培地であってもよい。実施態様において、基礎培地は表3に明示されたcDRFである。cDRFは以下に記載の市販の出発成分から作製され得る。cDRFは、Adolpheら、(Exp.Cell Res.155:527-536(1984))およびMcPhersonら(米国特許第6,150,163号)によって開発されたDMの改変である。
A.血小板−由来成長因子(PDGF)
一実施態様において、基礎培地は実質的に純粋なPDGFが補足される。
一実施態様において、基礎培地はCDLM(表5)または、別の方法として、CDLMから選択される1つまたは複数の脂質が補足される。
サイトカインの各IL−6は、広範囲の細胞型で見出される、共有シグナル伝達受容体サブユニットを利用することができる。たとえば、Hiranoら、(2001)IL−6リガンドおよび受容体ファミリー:サイトカイン関連、Academic Press,サンディエゴ、523−535。IL−6−ファミリーサイトカインの例は、これに限定されないが、オンコスタチンM(OSM)、インターロイキン6(IL−6)、白血病抑制因子(LIF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、インターロイキン−11(IL−11)、カルジオトロフィン1(CT−1)、およびニューロトロフィン1/B細胞刺激因子3(NNT−1/BSF−3)を含む。IL−6ファミリーのサイトカインは造血発生、神経発生、および骨形成を含むさまざまな生体系における細胞増殖および分化を抑制することがわかっている。Bruceら、Prog.Growth Factor Res.4:157−170(1992)。
ヒトのOSMは、分泌過程で取り除かれるN末端の25残基疎水性シグナル配列を伴った252アミノ酸ポリペプチドとして最初に翻訳される分泌性糖タンパク質である。さらに翻訳後の分裂により31個のC末端残基が取り除かれ、192アミノ酸のジスルフィド結合された成熟タンパク質が残る。Roseら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88:8641 8645(1991);Robinsonら、Cell 77:1101−1116(1994)。ヒトにおいて、OSMは2つの異なる受容体複合体−LIF受容体(LIFR)/gp130二量体およびOSM受容体(OSMR)/gp130二量体を介して結合し、情報を伝える。各受容体複合体に結合することにより、ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達物質および転写活性化因子(JAK/STAT)およびマイトジェン−活性化プロテインキナーゼ(MAPK)情報伝達系の活性を導く。Heinrichら、Biochem.J.374:1−20(2003).
IL−6は多くの別の名称:インターフェロンベータ2;B細胞分化因子;B細胞刺激因子2;肝細胞刺激因子;ハイブリドーマ増殖因子;およびCTL分化因子を含む:を有する。ヒトIL−6は、186個のアミノ酸の分泌糖タンパク質であり、212−アミノ酸前駆タンパク質として合成される。Matsudaら、(2001)IL−6:サイトカイン関連,Academic Press,サンディエゴ,538−563。ヒトにおいて、IL−6は、IL−6受容体(IL−6R)およびgp130ホモ二量体のフック剛体を介して結合し、情報を伝える。IL−6がIL−6R受容体に結合することによって、ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達物質および転写活性化因子(JAK/STAT)およびマイトジェン−活性化プロテインキナーゼ(MAPK)情報伝達系の活性を導く。Heinrichら、Biochem.J.374:1−20(2003)。
LIFはいくつかの別の名称:コリン作動性分化因子;DA細胞におけるヒトインターロイキン;分化刺激因子;MLPLI;およびエンフィラミン(Emfilermin)を有する。ヒトLIFは、糖タンパク質を分泌する180個のアミノ酸である。Kondera−Anaszら、Am.J.Reprod.Immunol.52:97−105(2004)。ヒトにおいて、LIFはLIF受容体(LIFR)/gp130二量体を介して結合し、信号を送る。LIFがLIF受容体に結合することにより、ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達物質および転写活性化因子(JAK/STAT)およびマイトジェン−活性化プロテインキナーゼ(MAPK)情報伝達系の活性を引き起こす。Heinrichら、Biochem.J.374:1−20(2003)。
本発明のDMは培地中における細胞の増殖を促進するのに必要な付加的な補足物のいずれかが補足されてもよい。そのような補足物は、以下に限定されないが、BMPファミリーのもの、TGF−ベータファミリーのもの、IGF、およびインスリンを含む。
本発明の方法はいずれの適当な細胞に使用され得る。この方法は軟骨性組織を産生することができる細胞のex vivoでの増殖に特に適している。
細胞は特定の細胞型および施用に適したあらゆる細胞培養法を用いて培養することができる。細胞培養法は当該分野において公知であり、たとえばJ.M.Davis,Basic Cell Culture,第2版.Oxford U.Press,2002に記載されている。
ある実施態様において、本発明の培地は、細胞を寛容な環境に置いた際に、分化−受容状態における細胞を維持する能力について、特に、軟骨細胞に分化する/再分化するかについて試験することができる。プロテオグリカン、アグリカンおよびコラーゲンIIは、インビボにおいて軟骨細胞によって通常分泌される細胞外マトリックスの成分の例であり、軟骨細胞の機能のマーカーとして扱ってもよい。軟骨細胞の分化能力を維持する培地の能力はアガロースおよび/またはアルギン酸アッセイによって決定されてもよい。アガロースアッセイは3Dアガロースマトリックスで増殖する細胞で、プロテオグリカンの形成を確認し、たとえばBenyaら、Cell30:215−224(1982)に記載されている。アルギン酸アッセイはアルギン酸懸濁液中で培養された細胞のアグリカンおよびコラーゲンII遺伝子の発現を測定するもので、たとえばYaegerら、Exp.Cell.Res.237(2):318−25(1997);およびGagneら、J.Orthop Res.18(6):882−890(2000)に記載されている。
本発明は、さらに本発明の方法および、たとえば治療において、たとえば対象にそのような細胞を投与することによって対象を治療するためのそのような細胞の使用方法を用いて培養された細胞を提供する。たとえば、軟骨欠損(たとえば外傷または変形性関節症による)の、本発明の方法にしたがって培養された軟骨細胞(たとえば、自己軟骨細胞)を投与することによって修復することを含む。
本発明の各種態様は以下に提示された実施例においてさらに詳しく表現され、説明される。
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、0.25% XIV型プロテアーゼ(ストレプトマイセス・グリセウス)を用いて1時間酵素的消化を行い、その後0.1%コラゲナーゼで、37℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を5分間、1,000×gで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。DMEM+10%FBSで増殖した細胞を3,000細胞/cm2の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を5,000細胞/cm2の密度で播種した。すべての実験にT75フラスコを使用した。以下の培地を試験した:
1)DMEM+10%FBS
2)表8に示すcDRF/P/L
3)0.2ng/ml IL−6で補足された、表8に示すcDRF/P/L
4)1.0ng/ml IL−6で補足された、表8に示すcDRF/P/L。
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、0.25% XIV型プロテアーゼ(ストレプトマイセス・グリセウス)を用いて1時間酵素的消化を行い、その後0.1%コラゲナーゼで、37℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を5分間、1,000×gで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。DMEM+10%FBSで増殖した細胞を3,000細胞/cm2の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を5,000細胞/cm2の密度で播種した。すべての実験にT75フラスコを使用した。以下の培地を試験した:
1)DMEM+10%FBS
2)表8に示すcDRF/P/L8
3)0.1ng/ml OSMを補足した、表8に示すcDRF/P/L
4)0.5ng/ml OSMを補足した、表8に示すcDRF/P/L
5)1.0ng/ml OSMを補足した、表8に示すcDRF/P/L。
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、0.25% XIV型プロテアーゼ(ストレプトマイセス・グリセウス)を用いて1時間酵素的消化を行い、その後0.1%コラゲナーゼで、37℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を5分間、1,000×gで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。DMEM+10%FBSで増殖した細胞を3,000細胞/cm2の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を5,000細胞/cm2の密度で播種した。すべての実験にT75フラスコを使用した。以下の培地を試験した:
1)DMEM+10%FBS
2)表8に示すcDRF/P/L
3)0.1ng/ml LIFを補足した、表8に示すcDRF/P/L
4)0.5ng/ml LIFを補足した、表8に示すcDRF/P/L
5)2.0ng/ml LIFを補足した、表8に示すcDRF/P/L。
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、0.25% XIV型プロテアーゼ(ストレプトマイセス・グリセウス)を用いて1時間酵素的消化を行い、その後0.1%コラゲナーゼで、37℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を5分間、1,000×gで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。DMEM+10%FBSで増殖した細胞を3,000細胞/cm2の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を5,000細胞/cm2の密度で播種した。すべての実験にT75フラスコを使用した。以下の培地を試験した:
1)DMEM+10%FBS
2)表8に示すcDRF/P/L
3)1.0ng/ml IL−6を補足した、表8に示すcDRF/P/L
4)0.5ng/ml OSMを補足した、表8に示すcDRF/P/L
5)1.0ng/ml IL−6+0.5ng/ml OSMを補足した、表8に示すcDRF/P/L。
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、0.25% XIV型プロテアーゼ(ストレプトマイセス・グリセウス)を用いて1時間酵素的消化を行い、その後0.1%コラゲナーゼで、37℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を5分間、1,000×gで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。DMEM+10%FBSで増殖した細胞を3,000細胞/cm2の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を5,000細胞/cm2の密度で播種した。すべての実験にT75フラスコを使用した。以下の培地を試験した:
1)DMEM+10%FBS
2)表8に示すcDRF/P/L
3)2.0μg/ml JAG−1を補足した、表8に示すcDRF/P/L。
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、0.25% XIV型プロテアーゼ(ストレプトマイセス・グリセウス)を用いて1時間酵素的消化を行い、その後0.1%コラゲナーゼで、37℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を5分間、1,000×gで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。DMEM+10%FBSで増殖した細胞を3,000細胞/cm2の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を5,000細胞/cm2の密度で播種した。すべての実験にT75フラスコを使用した。以下の培地を試験した:
1)DMEM+10%FBS
2)表8に示すcDRF/P/L
3)3.0ng/ml IL−13を補足した、表8に示すcDRF/P/L
4)10.0ng/ml IL−13を補足した、表8に示すcDRF/P/L。
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、0.25% XIV型プロテアーゼ(ストレプトマイセス・グリセウス)を用いて1時間酵素的消化を行い、その後0.1%コラゲナーゼで、37℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を5分間、1,000×gで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。DMEM+10%FBSで増殖した細胞を3,000細胞/cm2の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を5,000細胞/cm2の密度で播種した。すべての実験にT75フラスコを使用した。以下の培地を試験した:
1)DMEM+10%FBS
2)表5に示される5μl/ml CDLM、10ng/ml PDGF、1ng/ml IL−6および0.5ng/ml OSMを補足した、表4に示すcDRFm(本明細書中、E93として示される)
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、0.25% XIV型プロテアーゼ(ストレプトマイセス・グリセウス)を用いて1時間酵素的消化を行い、その後0.1%コラゲナーゼで、37℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を5分間、1,000×gで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。DMEM+10%FBSで増殖した細胞を3,000細胞/cm2の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を5,000細胞/cm2の密度で播種した。すべての実験にT75フラスコを使用した。以下の培地を試験した:
1)DMEM+10%FBS
2)実施例7に記載の無血清E93培地。
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、0.25% XIV型プロテアーゼ(ストレプトマイセス・グリセウス)を用いて1時間酵素的消化を行い、その後0.1%コラゲナーゼで、37℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を5分間、1,000×gで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。DMEM+10%FBSで増殖した細胞を3,000細胞/cm2の密度で播種した。無血清培地で増殖した細胞を5,000細胞/cm2(E93高)または3,000細胞/cm2(E93低)の密度でそれぞれ播種した。すべての実験にT75フラスコを使用した。以下の培地を試験した:
1)DMEM+10%FBS;
2)実施例7に示すE93培地。
]初代ヒト軟骨細胞を実施例9に記載のごとく準備した。DMEM+10%FBSまたはE93で増殖した細胞をアルギン酸培養のために第3代の継代で採取した。アルギン酸培養は細胞1×106個を1.2%アルギン酸溶液に播種することによって行なった。アルギン酸培養は、3−5日ごとに、EGHIC(DMEM、20ng/mL rhIGF−1、25μg/mLアスコルビン酸、および1mMピルビン酸ナトリウム)が供給された。培養21日後、軟骨細胞をアルギン酸ビーズから抽出し、I型コラーゲン、II型コラーゲンおよびアグリカンのmRNAをリボヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイ(RPA)を用いて検出した。このアッセイにおいて、II型コラーゲンはゲル上310塩基対(bp)バンドとして検出され、I型コラーゲンは260bpバンド、およびアグリカンは210bpバンドであった。図3はE93(2、3および4レーン)またはII型コラーゲンおよびアグリカンのmRNAを含む10%血清を補足したDMEM(5、6および7レーン)で増殖した細胞由来の細胞溶解物の量の増加を示す。これは、E93培地で増殖したヒト軟骨細胞がこれらの重要な軟骨マーカーを再発現させる能力があることを示す。
たとえば、細胞がヒトの治療に用いられる場合、細胞が通常の核型を維持し、培養中老化に入ることは重要であるかもしれない。E93で増殖した軟骨細胞は少なくとも第10代継代を通して通常の核型を示し、およそ30集団倍加の後老化した。
初代ヒト軟骨細胞は関節軟骨の生検から単離され、その試料を細分し、0.25% XIV型プロテアーゼ(ストレプトマイセス・グリセウス)を用いて1時間酵素的消化を行い、その後0.1%コラゲナーゼで、37℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を5分間、1,000×gで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。DMEM+10%FBSで増殖した細胞を3,000細胞/cm2の密度で播種した。無血清培地で増殖した細胞を5,000細胞/cm2の密度で播種した。すべての実験でT75フラスコを使用した。以下の培地を試験した:
1)DMEM+10%FBS
2)実施例7に記載のE93培地
3)0.5ng/ml IL−6および0.25ng/ml OSMを補足したE93培地
4)0.1ng/nl IL6および0.05ng/ml OSMを補足したE93培地。
Claims (61)
- 実質的に純粋なオンコスタチンM(OSM)が補足された基礎培地を含む培養培地。
- 基礎培地に実質的に純粋なインターロイキン6(IL−6)が追加的に補足された、請求項1に記載の培養培地。
- 基礎培地に実質的に純粋な白血病抑制因子(LIF)が追加的に補足された、請求項1に記載の培養培地。
- 基礎培地に実質的に純粋なIL−6および実質的に純粋なLIFが追加的に補足された、請求項1に記載の培養培地。
- 基礎培地がcDRFである、請求項1に記載の培養培地。
- 基礎培地に実質的に純粋な血小板−由来成長因子(PDGF)が追加的に補足された、請求項1に記載の培養培地。
- 培養培地にステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ−トコフェロール酢酸からなる群より選択される1つまたは複数の脂質が追加的に補足された、請求項1に記載の培養培地。
- 基礎培地がcDRFであり、PDGFおよび化学的に定義された脂質混合物(CDLM)が追加的に補足された、請求項1に記載の培養培地。
- 基礎培地がcDRFmであり、PDGFおよびCDLMが追加的に補足された、請求項1に記載の培養培地。
- 基礎培地がcDRFmであり、PDGFおよびCDLMが追加的に補足された、請求項2に記載の培養培地。
- 基礎培地に実質的に純粋なjagged1(JAG1)および/または実質的に純粋なインターロイキン−13(IL−13)が補足されていない、請求項1に記載の培養培地。
- 培養培地中、OSMが0.01ng/mlから10ng/mlまでの濃度で存在する、請求項1に記載の培養培地。
- 培養培地中、OSMおよびIL−6のそれぞれが、0.01ng/mlから10ng/mlまでの濃度で存在する、請求項2に記載の培養培地。
- 培養培地中、OSMおよびLIFのそれぞれが、0.01ng/mlから10ng/mlまでの濃度で存在する、請求項3に記載の培養培地。
- 培養培地中、OSM、IL−6、およびLIFが、0.01ng/mlから10ng/mlまでの濃度で存在する、請求項4に記載の培養培地。
- 培養培地が無血清である、請求項1に記載の培養培地。
- 培養培地が血清をさらに含む、請求項1に記載の培養培地。
- (a)cDRFm;
(b)0.1−100ng/ml PDGF;
(c)0.05−5% CDLM;
(d)0.01−10ng/ml OSM;および
(e)0.01−10ng/ml IL−6
を含む培養培地。 - 実質的に純粋なOSMが補足された基礎培地を含む培養培地とともに細胞をインキュベートする工程を含む、細胞培養の方法。
- 基礎培地に実質的に純粋なIL−6が追加的に補足されている、請求項19に記載の方法。
- 基礎培地に実質的に純粋なLIFが追加的に補足されている、請求項19に記載の方法。
- 基礎培地に実質的に純粋なIL−6および実質的に純粋なLIFが追加的に補足されている、請求項19に記載の方法。
- 基礎培地がcDRFである請求項19に記載の方法。
- 基礎培地に実質的に純粋なPDGFが追加的に補足されている、請求項19に記載の方法。
- 基礎培地にステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ−トコフェロール酢酸からなる群より選択される1つまたは複数の脂質が追加的に補足されている、請求項19に記載の方法。
- 基礎培地がcDRFであり、PDGFおよびCDLMが追加的に補足されている、請求項19に記載の方法。
- 基礎培地がcDRFmであり、PDGFおよびCDLMが追加的に補足されている、請求項19に記載の方法。
- 基礎培地がcDRFmであり、PDGFおよびCDLMが追加的に補足されている、請求項20に記載の方法。
- 培養培地が実質的に純粋なJAG1および/または実質的に純粋なIL−13で補足されていない、請求項19に記載の方法。
- OSMが培養培地中0.01ng/mlから10ng/mlまでの濃度で存在する、請求項19に記載の方法。
- 培養培地中、OSMおよびIL−6がそれぞれ0.01ng/mlから10ng/mlまでの濃度で存在する、請求項20に記載の方法。
- 培養培地中、OSMおよびLIFがそれぞれ0.01ng/mlから10ng/mlまでの濃度で存在する、請求項21に記載の方法。
- 培養培地中、OSM、IL−6、およびLIFがそれぞれ0.01ng/mlから10ng/mlまでの濃度で存在する、請求項22に記載の方法。
- 培養培地が無血清である、請求項19に記載の方法。
- 培養培地が血清をさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 細胞が軟骨細胞である、請求項19に記載の方法。
- 軟骨細胞が脱分化される、請求項36に記載の方法。
- 軟骨細胞が間葉系肝細胞に由来する、請求項36に記載の方法。
- 軟骨細胞がヒト軟骨細胞である、請求項36に記載の方法。
- 軟骨細胞がヒト関節軟骨細胞である、請求項36に記載の方法。
- 軟骨細胞が初代である、請求項36に記載の方法。
- 細胞を継代する工程をさらに含む、請求項19に記載の方法。
- キレート剤を含む溶液で細胞をインキュベートすることによって細胞が継代される、請求項42に記載の方法。
- キレート剤がEDTAである、請求項43に記載の方法。
- EDTAが0.1mMから1mMまでの濃度で溶液中に存在する、請求項44に記載の方法。
- 325ユニット/ml以下のトリプシンを含む溶液で細胞をインキュベートすることによって細胞が継代される、請求項42に記載の方法。
- 溶液が0.1mMから1mMまでのEDTAを含む、請求項46に記載の方法。
- 細胞が20,000個/cm2以下の密度で播種される、請求項19に記載の方法。
- 軟骨細胞を培養する方法であって、該軟骨細胞を培養培地でインキュベートする工程を含み、該培養培地が、
(a)cDRFm;
(b)0.1−100ng/ml PDGF;
(c)0.05−5%CDLM;
(d)0.01−10ng/ml OSM;および
(e)0.01−10ng/ml IL−6:
を含む、培養方法。 - 請求項1に記載の培養培地を用いて培養される軟骨細胞。
- 請求項19に記載の方法を用いて培養される軟骨細胞。
- 請求項49に記載の方法を用いて培養される軟骨細胞。
- 対象における軟骨欠損を治療する方法であって、その方法が、
(a)請求項1に記載の方法を用いて軟骨細胞を培養すること;および
(b)対象に軟骨細胞を投与すること:
を含む治療方法。 - 対象における軟骨欠損を治療する方法であって、その方法が、
(a)請求項19に記載の方法を用いて軟骨細胞を培養すること;および
(b)対象に軟骨細胞を投与すること:
を含む治療方法。 - 対象における軟骨欠損を治療する方法であって、その方法が、
(a)請求項49に記載の方法を用いて軟骨細胞を培養すること;および
(b)対象に軟骨細胞を投与すること:
を含む治療方法。 - 軟骨細胞および請求項1に記載の培養培地を含む組成物。
- 軟骨細胞および
(a)cDRFm;
(b)0.1−100ng/ml PDGF;
(c)0.05−5%CDLM;
(d)0.01−10ng/ml OSM;および
(e)0.01−10ng/ml IL−6
を含む培養培地を含む組成物。 - 培養培地であって、
(a)実質的に純粋なPDGFおよびCDLMのいずれか一方または両方;および
(b)実質的に純粋なOSM、実質的に純粋なIL−6、および実質的に純粋なLIFのいずれか一つまたは複数:
が補足された基礎培地を含む、培養培地。 - 基礎培地がcDRFである、請求項58に記載の培養培地。
- 基礎培地がcDRFmである、請求項58に記載の培養培地。
- 基礎培地が実質的に純粋なPDGFおよびCDLMで補足された、請求項58に記載の培養培地。
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