RU2272839C2 - Бессывороточная среда для культуры клеток, используемых для реконструкции костных и хрящевых сегментов (варианты) - Google Patents

Бессывороточная среда для культуры клеток, используемых для реконструкции костных и хрящевых сегментов (варианты) Download PDF

Info

Publication number
RU2272839C2
RU2272839C2 RU2001116126/13A RU2001116126A RU2272839C2 RU 2272839 C2 RU2272839 C2 RU 2272839C2 RU 2001116126/13 A RU2001116126/13 A RU 2001116126/13A RU 2001116126 A RU2001116126 A RU 2001116126A RU 2272839 C2 RU2272839 C2 RU 2272839C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
medium
serum
reconstruction
cells
fgf
Prior art date
Application number
RU2001116126/13A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2001116126A (ru
Inventor
Раньери КАНЧЕДДА (IT)
Раньери КАНЧЕДДА
Беатриче ДОЦИН (IT)
Беатриче ДОЦИН
Original Assignee
Консорцио Пер Ла Джестионе Дель Чентро Ди Биотекнолоджие Аванцате
Иституто Нацьонале Пер Ла Ричерка Суль Канкро
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Консорцио Пер Ла Джестионе Дель Чентро Ди Биотекнолоджие Аванцате, Иституто Нацьонале Пер Ла Ричерка Суль Канкро filed Critical Консорцио Пер Ла Джестионе Дель Чентро Ди Биотекнолоджие Аванцате
Publication of RU2001116126A publication Critical patent/RU2001116126A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2272839C2 publication Critical patent/RU2272839C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена бессывороточная среда для роста и пролиферации культуры клеток, используемых для реконструкции костных и хрящевых сегментов определенного состава (варианты). Изобретение позволяет получать клетки и использовать их для трансплантации. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

Description

Предшествующий уровень техники
Трансплантация кости и хряща абсолютно необходима при реконструкции костных и хрящевых сегментов в пластической хирургии, травматологической хирургии или после удаления новообразований и т.д. Обычно для этой цели использовался материал человеческого (аутологичный от доноров или от трупов) или животного происхождения. В связи с возросшей потребностью клиницистов в тканях для трансплантации, расширяющейся областью в мире биомедицинских наук является возросшая потребность в микробиологической безопасности при трансплантации тканей, достижения в изучении клеточной биологии, клеточной дифференциации и тканевой инженерии, концепция реконструкции тканей из аутологичных или аллогенных клеток, выращенных in vitro. Клеточные источники для восстановления костей скелета включают хондроциты и клетки, относящиеся к линии дифференцировки хондроцитов, и мезенхимальные стволовые клетки, причем первые из них специфичны для хряща, а последние обладают многообразными свойствами и поэтому есть возможность их использования для замещения кости, хряща и других тканей.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) обнаруживаются в костном мозге, а также в крови, дерме и надкостнице. Хотя эти клетки обычно присутствуют в костном мозге с низкой частотой, эти клетки можно выделить, очистить и размножить в культуре, например, как описано в патенте США №5486359.
Обычно размножение хондроцитов и МСК in vitro происходит в культуральной среде с добавками бычьей сыворотки или оптимально аутологичной сыворотки от пациента. Однако присутствие в культурах хондроцитов и МСК сыворотки животных или аутологичной сыворотки имеет определенные недостатки и ограничения с точки зрения возможностей лечебного применения этих культур.
Например, сыворотка не является физиологической жидкостью, с которой большинство клеток тесно контактируют в ткани in vivo. Это особенно справедливо для хондроцитов, которые in vivo залиты в свою бессосудистую матрицу и в своем собственном росте и дифференциации зависят от различных факторов роста и цитокинов, действующих скорее аутокринным/панакринным образом, чем диффузией из отдаленного тока крови. Кроме того, часто существует высокая изменчивость между партиями сыворотки животных. Обширный скрининг сыворотки, требуемый для отбора партии, наиболее репрезентативной с точки зрения индуктивных воздействий in vivo, может потребовать больших затрат времени и средств. Получение аутологичной сыворотки от пациентов также связано с длительными затратами времени, и ее поставка ограничена. Сыворотка животного происхождения может, кроме того, содержать неизвестные патогены с последующим риском заражения пациента.
Таким образом, желательны замещающие сыворотку среды для культивирования клеток, которые можно применять in vivo в лечебных целях.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение предоставляет заместитель сыворотки для культивирования клеток in vitro с использованием хорошо определенных факторов, способных поддерживать жизнеспособность, пролиферацию и дифференциацию клеток также эффективно, как среда, содержащая сыворотку.
В предпочтительном варианте клетки представляют суставные хондроциты или мезенхимальные стволовые клетки.
В одном аспекте изобретение включает композицию для размножения хондроцитов, включающую минимально незаменимую среду, фактор роста, альбумин, стероид, антиоксидант, источник железа, жирную кислоту и/или источник липида и инсулин. В особенно предпочтительном варианте реализации бессывороточная ростовая среда для хондроцитов включает FGF-2 в качестве фактора роста, линолевую кислоту в качестве источника липида/жирной кислоты, аскорбиновую кислоту и β-меркаптоэтанол в качестве антиоксидантов, голо- и апотрансферрин в качестве источника железа и дексаметазон в качестве стероида. Необязательные ингредиенты могут включать холестерин, металлические микроэлементы, такие как селен, и витамины, такие как биотин и пантотенат натрия.
В другом аспекте изобретение включает композицию для поддержания мезенхимальных стволовых клеток, включающую фактор роста, альбумин, стероид, антиоксидант, источник железа, жирную кислоту и/или источник липида, один или несколько витаминов, один или несколько металлических микроэлементов, и фактор роста IGF-1 в комбинации с минимально незаменимой средой. В особенно предпочтительном варианте реализации бессывороточная ростовая среда для мезенхимальных стволовых клеток включает FGF-2, LIF и SCF в качестве факторов роста, пантотенат натрия и биотин в качестве витаминов и селен в качестве металлического микроэлемента.
Краткое описание чертежей
На чертеже показано сравнение кинетики роста суставных хондроцитов в среде, содержащей FCS и в бессывороточной среде настоящего изобретения.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение предоставляет бессывороточные композиции, подходящие для роста и пролиферации хондроцитов и мезенхимальных стволовых клеток. Композиция может включаться в основную минимально незаменимую среду, такую как модифицированная по Coon среда Ham F-12, следующие компоненты в качестве замещения сыворотки:
i) один или несколько факторов роста или белков, которые вызывают переход клеток, находящихся в состоянии покоя, в состояние деления и/или дифференцировки, такие как инсулин, FGF-2, PDGFbb, EGF, LIF и SCF и IGF-1;
ii) один или несколько стероидов, таких как дексаметазон;
iii) один или несколько источников липидов и жирных кислот, необходимых для биосинтеза клеточных мембран, таких как холестерин и линолевая кислота; и
iv) источник железа, такой как трансферрин.
FGF-2, PDGFbb и EGF являются мощными митогенами для клеток мезенхимального происхождения. Известно, что дексаметазон in vitro удерживает клетки в фазе циклического развития.
Бессывороточная среда настоящего изобретения может, кроме того, включать:
i) альбумин (предпочтительно видов млекопитающих), который функционирует в качестве неспецифического носителя;
ii) один или несколько антиоксидантов, таких как β-меркаптоэтанол;
iii) добавку для транспорта коферемента при реакциях переноса карбоксильной группы, такую как биотин;
iv) микроэлементы, такие как дополнительный источник металла, необходимого для переноса электронов, и множество металлоферментов и белков, таких как селен;
v) витамины, такие как биотин и пантотенат; и
vi) аскорбиновую кислоту для облегчения организации внеклеточной матрицы.
Инсулин и дексаметазон добавляются в средних концентрациях, обычно указанных в литературе.
IGF-I, LIF и SCF присутствуют в концентрациях в диапазоне от около 5 до около 10 нг/мл; предпочтительно в концентрации 5 нг/мл. Все другие компоненты включены в диапазоне концентрации, обычно используемой в исследованиях культуры клеток.
В предпочтительном варианте реализации композиции, подходящей для роста и пролиферации хондроцитов, определенные компоненты включают EGF, PDGFbb и FGF-2, аскорбиновую кислоту, линолевую кислоту, сывороточный альбумин человека (HSA), β-меркаптоэтанол, дексаметазон, инсулин, человеческий голо- и апотрансферрин. В этом варианте реализации FGF-2, PDGFbb и EGF присутствуют в концентрациях в диапазоне от около 1 до около 10 нг/мл. В предпочтительном варианте реализации FGF-2 PDGFbb и EGF присутствуют в концентрациях от 1 до 2 нг/мл.
В предпочтительном варианте реализации композиции, подходящей для роста и пролиферации мезенхимальных стволовых клеток, определенные компоненты включают: EGF, PDGFbb и FGF-2, LIF, SCF, IGF-I, аскорбиновую кислоту, холестерин, HSA, β-меркаптоэтанол, дексаметазон, человеческий голо- и апотрансферрин, селен, биотин, пантотенат натрия. FGF-2, PDGFbb и EGF присутствуют в концентрациях в диапазоне от около 5 нг/мл до около 10 нг/мл каждого фактора. Предпочтительными концентрациями FGF-2, PDGFbb и EGF являются 10 нг/мл. Было обнаружено, что один FGF-2 является самым активным фактором для поддержания остеохондрогенного потенциала у МСК.
ПРИМЕР 1
Суставной хрящ брали из коленного сустава молодых взрослых людей-доноров. Сначала образцы очищали от любых прикрепленных мышечных соединительных или подхрящевых костных тканей, измельчали на фрагменты размером 1-3 мм и полоскали в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS). Затем высвобождали одиночные хондроциты с помощью повторного ферментативного расщепления при 37°С с 0,25% трипсина, 400 ЕД/мл коллагеназы I, 1000 ЕД/мл коллагеназы II и 1 мг/мл гиалуронидазы. Затем трипсин блокировали и удаляли с помощью быстрых и обильных промываний в PBS, содержащем ингибитор трипсина соевых бобов. Клетки высевали на чашки в зависимых от якорной подложки условиях в модифицированную по Coon среду Ham F-12 или с 10% плодной телячьей сывороткой (FCS, контрольная культура), или со следующими определенными компонентами: EGF, PDGFbb и FGF-2, аскорбиновая кислота, линолевая кислота, сывороточный альбумин человека (HSA), β-меркаптоэтанол, дексаметазон, инсулин, человеческий голо- и апотрансферрин. Ниже в табл.1 показаны предпочтительные количества каждого компонента. Для способствования прилипанию клеток в бессывороточных условиях чашки предварительно покрывали 2% желатином.
Инсулин можно не замещать IGF-I в среде для хондроцитов. Инсулин был предпочтительно в концентрации 5 мкг/мл. Обычными способами, но необязательно, могут быть включены селен, биотин, пантотенат натрия и холестерин.
ТАБЛИЦА 1
Добавка в среду для бессывороточного размножения человеческих хондроцитов
ИНГРЕДИЕНТ КОНЦЕНТРАЦИЯ
(Основная среда: модифицированная по Coon Среда Ham F-12)
FGF-2 1-10 нг/мл
PDGFbb 1-10 нг/мл
EGF 1-10 нг/мл
Инсулин 5 мкг/мл
Дексаметазон 10-8 М
Аскорбиновая кислота 50 мкг/мл
Трансферрин 20-50 мкг/мл
HSA 1%
Линолевая кислота 6 мкМ
β-меркаптоэтанол 5×10-5 М
ПРИМЕР 2
Образец костного мозга, взятый из гребня подвздошной кости пациента, дважды промывали PBS. Клетки с ядрами подсчитывали с использованием красителя метил фиолетового и высевали на чашки в количестве 5×106 клеток в виде не фракционированного костного мозга на 10 см чашки для культуры ткани. Для отбора и размножения клетки сохраняли в модифицированной по Coon среде Ham F-12 (F-12) с добавлением или 10% FCS и 1 нг/мл FGF-2 (контрольная культура), или следующих определенных компонентов: EGF, PDGFbb, FGF-2, LIF, SCF, IGF-I, аскорбиновая кислота, холестерин, HSA, β-меркаптоэтанол, дексаметазон, инсулин, человеческий голо- и апотрансферрин, селен, биотин и пантотенат натрия. Ниже в табл.2 показаны предпочтительные количества каждого компонента. Для способствования прилипанию МСК клетки сначала высевали на чашки на 48 ч в среде F12 с добавлением 10% человеческой сыворотки и 1 нг/мл FGF-2. Затем среду удаляли и клетки обильно промывали PBS и оставляли еще на 24-48 ч в среде F12 без каких-либо добавок. Затем для способствования пролиферации клеток добавляли определенную смесь факторов.
Один FGF-2 был самым активным фактором для поддержания остеохондрогенного потенциала в мезенхимальных стволовых клетках. Для поддержания жизнеспособности клеток предпочтительно добавлялись селен, биотин и пантотенат натрия. Наблюдалось, что LIF и SCF улучшали степень клеточной пролиферации, особенно в комбинации с IGF-I.
ТАБЛИЦА 2
Добавка в среду для бессывороточного размножения МСК
ИНГРЕДИЕНТ КОНЦЕНТРАЦИЯ
(Основная среда: модифицированная по Coon Среда Ham F-12)
Сывороточный альбумин человека 1-2%
Трансферрин (апо/голо) 20-50 мкг/мл
Аскорбиновая кислота 50 мкг/мл
β-меркаптоэтанол 5×10-5 М
Холестерин 30 мкг/мл
Селен 30 нМ
Биотин 33 мкм
Пантотенат Na 17 мкМ
EGF/PDGF/FGF-2 1-10 нг/мл
Дексаметазон 10-8 М
IGF-I 5 нг/мл
LIF 5 нг/мл
SCF 5 нг/мл
Исследования показали, что PDGFbb сам по себе увеличивает остеогенный потенциал МСК при включении на фазе пролиферации. Было обнаружено, что этот эффект усиливался с помощью комбинирования PDGFbb с FGF-2.
ПРИМЕР 3
Кинетика роста хондроцитов
В 0-й д. 5×103 клеток первого пассажа высевали в каждую лунку 24-луночной планшеты в присутствии FCS. После прилипания FCS удаляли и клетки обильно промывали PBS и оставляли на 2-3 д. в F12 без добавок для истощения остаточных следов сыворотки. Затем повторно вызывали пролиферацию с помощью добавления или 10% FCS, или смеси определенных компонентов, установленных для хондроцитов. Количество клеток оценивали в различные дни посредством окрашивания красителем тиазолилом синим (МТТ). Вкратце, удаляли культуральную среду и замещали 0,5 мл среды без добавок; затем в каждую анализируемую культуру добавляли 25 мкл МТТ (Sigma, St. Louis, МО) маточного раствора (5 мг/мл). Через 3 ч инкубации среду удаляли и превращенный краситель солюбилизировали абсолютным этанолом. Поглощение превращенного красителя измеряли при длине волны 570 нм с вычитанием фона при 670 нм.
Полученные данные (см. чертеж) ясно показывают, что определенная среда вызывает пролиферацию хондроцитов со скоростью и степенью, сравнимыми с таковыми, полученными в присутствии FCS.
ПРИМЕР 4
Потенциал дифференциации хондроцитов, размножившихся в бессывороточных условиях, исследовали и in vitro, и in vivo. Для анализа in vitro размножившиеся клетки переносили в зависимые от якорной подложки условия и поддерживали в виде осадочной культуры в течение 2-4 нед. в бессывороточной среде, которая, как ранее было показано Johnstone et al. (Johnstone, В., Hering, T.M., Caplan, A.I., Goldberg, V.M. and Yoo, J.U. Exp. Cell. Res. 238, 265-272, 1998), вызывает хондрогенез размножившихся в сыворотке МСК.
Для анализа in vivo размножившиеся клетки имплантировали на 2-8 нед. бестимусным мышам или в виде плотной клеточной суспензии, или после заливки в фибриновый гель (Tissucol). Ко времени анализов образцы фиксировали в формалине, заливали в парафин и делали срезы. Серийные срезы обрабатывали для гистологического (толуидиновый синий и алциановый синий) анализа и иммуногистохимии со специфичными по отношению коллагена антителами.
Результаты показали, что в отличие от хондроцитов, размножившихся в присутствии FCS, хондроциты, размножившиеся в бессывороточных условиях, непосредственно реформировали хрящевую структуру и in vitro, и in vivo, которая метахроматически окрашивалась толуидином синим и давала положительную реакцию на алциановый синий и коллаген II типа и преимущественно отрицательную на коллаген I типа. Напротив, в случае размножения в FCS наблюдалось тотальное отсутствие полного хондрогенеза и in vitro, и in vivo; в некоторых осадочных культурах максимум наблюдалось незначительное метахроматическое окрашивание, но в них всегда отсутствовали хорошо очерченные лакуны и хорошо организованный внеклеточный матрикс.
Эти данные иллюстрируют большое преимущество бессывороточной системы, которая обеспечивает возможность хондрогенеза, не требуя дополнительного культивирования в присутствии опухолевого фактора роста бета (TGF-β) или других факторов (индуцирующие условия Johnstone). Это может быть вызвано тем обстоятельством, что хондроциты в природе не вступают в контакт с сывороткой, которая может содержать элементы, ингибирующие хондрогенез.
ПРИМЕР 5
Остеогенный потенциал МСК после размножения в определенных бессывороточных условиях исследовали in vivo с помощью имплантации размножившихся клеток бестимусным мышам после адсорбции на коллатрансплантат.
Исследовали несколько комбинаций условий для образования кости in vivo. Для всех комбинаций факторов среда содержала модифицированную по Coon среду Ham F-12, дексаметазон, FGF-2, PDGFbb, EGF, трансферрин, холестерин, сывороточный альбумин человека, биотин, селен, пантотенат Na и аскорбиновую кислоту (концентрации, как в табл.2). Исследовали следующие комбинации: 1) инсулин; 2) IGF-I; 3) инсулин и LIF; 4) инсулин и SCF; 5) инсулин, LIF и SCF; 6) IGF-I и LIF; 7) IGF-I и SCF; и 8) IGF-I, LIF и SCF.
После 8 нед. имплантации образцы декальцифицировали, заливали и обрабатывали для гистологического исследования, как описано выше. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Все условия размножения позволили МСК реформировать костную ткань in vivo; однако количество образованной кости изменялось в зависимости от условий. Среди испытанных комбинаций комбинация IGF-I, LIF и SCF обеспечила оптимальную среду для размножения.

Claims (6)

1. Бессывороточная среда для роста и пролиферации культуры клеток, используемых для реконструкции костных и хрящевых сегментов, отличающаяся тем, что для культуры хондроцитов среда включает FGF-2 в количестве 1-10 нг/мл, линолевую кислоту 6 мкМ, аскорбиновую кислоту 50 мкг/мл, β-меркаптоэтанол 5×10-5 М, трансферрин 20-50 мкг/мл, дексаметазон 10-8 М.
2. Среда по п.1, дополнительно включающая EGF в количестве 1-10 нг/мл, PDGFbb 1-10 нг/мл, инсулин 5 мкг/мл, сывороточный альбумин человека 1%.
3. Среда по п.1 или 2, дополнительно включающая минимально незаменимую среду, такую, как модифицированная по Coon среда Ham F-12.
4. Бессывороточная среда для роста и пролиферации культуры клеток, используемых для реконструкции костных и хрящевых сегментов, отличающаяся тем, что для культуры мезенхимальных стволовых клеток, среда включает FGF-2 в количестве 1-10 нг/мл, LIF и SCF по 5 нг/мл, пантотенат натрия 17 мкМ, биотин 33 мкм, селен 30 нМ.
5. Среда по п.4, дополнительно включающая EGF, PDGFbb по 1-10 нг/мл, IGF-I 5 нг/мл, аскорбиновую кислоту 50 мкг/мл, холестерин 30 мкг/мл, сывороточный альбумин человека 1-2%, β-меркаптоэтанол 5×10-5 М, дексаметазон 10-8 М, трансферрин 20-50 мкг/мл.
6. Среда по п.4 или 5, дополнительно включающая минимально незаменимую среду, такую, как модифицированная по Coon среда Ham F-12.
RU2001116126/13A 1998-11-09 1999-11-08 Бессывороточная среда для культуры клеток, используемых для реконструкции костных и хрящевых сегментов (варианты) RU2272839C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10764698P 1998-11-09 1998-11-09
US60/107,646 1998-11-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2001116126A RU2001116126A (ru) 2003-06-10
RU2272839C2 true RU2272839C2 (ru) 2006-03-27

Family

ID=22317692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2001116126/13A RU2272839C2 (ru) 1998-11-09 1999-11-08 Бессывороточная среда для культуры клеток, используемых для реконструкции костных и хрящевых сегментов (варианты)

Country Status (10)

Country Link
US (2) US6617159B1 (ru)
EP (1) EP1131407B1 (ru)
JP (1) JP2002529071A (ru)
AT (1) ATE342348T1 (ru)
AU (1) AU758073B2 (ru)
CA (1) CA2348687A1 (ru)
DE (1) DE69933579D1 (ru)
IL (2) IL142914A0 (ru)
RU (1) RU2272839C2 (ru)
WO (1) WO2000027996A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2461623C1 (ru) * 2011-06-20 2012-09-20 Борис Карпович Гаврилюк Способ выращивания культур хрящевых клеток
RU2533805C2 (ru) * 2008-06-30 2014-11-20 Сентокор Орто Байотек Инк. Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток, представляющих собой линию клеток человека

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1242578B1 (en) * 1999-12-28 2004-04-14 Iso Tis N.V. Cell culture medim containing growth factors and l-glutamine
ES2328460T3 (es) 2001-04-24 2009-11-13 Dolores Baksh Poblaciones de celulas progenitoras, expansion de las mismas y crecimiento de tipos de celulas no hematopoyeticas y tejidos provenientes de las mismas.
FR2828401B1 (fr) * 2001-08-10 2003-11-07 Oreal Composition cosmetique ou dermatologique comprenant une association entre l'igf1 et/ou un compose mimetique de l'igf1, et l'acide ascorbique et/ou au moins l'un de ses derives
JP2003052360A (ja) * 2001-08-20 2003-02-25 Japan Science & Technology Corp 基底膜細胞外基質を用いた間葉系幹細胞の培養方法
US20030109038A1 (en) 2001-12-07 2003-06-12 Thies R. Scott Chondrocyte precursors derived from human embryonic stem cells
US20070141036A1 (en) * 2002-01-09 2007-06-21 Alberto Gorrochategui Barrueta Composition and procedure for tissue creation, regeneration and repair by a cell-bearing biological implant enriched with platelet concentrate and supplements
BRPI0307074A2 (pt) 2002-01-25 2017-06-20 Genzyme Corp meios sem soro para condrócitos e métodos para seu uso
US7741116B2 (en) 2002-03-06 2010-06-22 University Of Cincinnati Surgical device for skin therapy or testing
JP4554940B2 (ja) * 2002-04-03 2010-09-29 直秀 山下 ヒト胎盤由来の間葉系細胞を含む医薬及び該細胞を用いたｖｅｇｆの製造方法
WO2003097820A1 (fr) * 2002-05-22 2003-11-27 Fushimi Pharmaceutical Co.,Ltd. Procede pour utiliser l'activite physiologique d'un saccharide rare et compositions contenant un saccharide rare
DE10311620A1 (de) * 2003-03-17 2004-10-07 Biotissue Technologies Gmbh Knorpelzell-Kulturmedium und Verwendung desselben
AU2003903896A0 (en) * 2003-07-28 2003-08-07 Queensland University Of Technology Skin regeneration system
US20050233446A1 (en) * 2003-12-31 2005-10-20 Parsons Xuejun H Defined media for stem cell culture
DK1725656T3 (da) * 2004-03-05 2014-01-13 John E Davies Serumfri suspensionskultursystem til mesenchymale progenitorceller
WO2005099758A2 (en) * 2004-04-17 2005-10-27 The Board Of Trustees The Leland Standford Junior University Injectable bioartificial tissue matrix
EP1745125A1 (en) * 2004-05-14 2007-01-24 Becton, Dickinson and Company Cell culture environments for the serum-free expansion of mesenchymal stem cells
WO2006004149A1 (ja) * 2004-07-06 2006-01-12 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 神経細胞の製造方法
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
JP4646600B2 (ja) * 2004-11-02 2011-03-09 オリンパス株式会社 間葉系幹細胞の培養方法
JP2006136281A (ja) * 2004-11-15 2006-06-01 Olympus Corp 培地および間葉系幹細胞の培養方法
CN101061218A (zh) 2004-11-19 2007-10-24 株式会社Jms 细胞培养用人血清
US7972767B2 (en) 2005-05-09 2011-07-05 Olympus Corporation Method for culturing mesenchymal stem cell and method for producing biological tissue prosthesis
US20090169523A1 (en) 2005-06-13 2009-07-02 Catherine Verfaillie Hsc self-renewal
WO2007023875A1 (ja) * 2005-08-23 2007-03-01 Oriental Yeast Co., Ltd. ラミニン５を利用した間葉系幹細胞の培養技術
JP4921083B2 (ja) * 2005-09-13 2012-04-18 タカラバイオ株式会社 レトロウィルス産生用無血清培地
US7989205B2 (en) * 2005-10-06 2011-08-02 American Cryostem Corporation Cell culture media, kits and methods of use
DE102005054577A1 (de) * 2005-11-16 2007-05-24 Cognis Ip Management Gmbh Verwendung von Estern ungesättigter, physiologisch aktiver Fettsäuren als Nährmedien für Zellkulturen
WO2007080919A1 (ja) 2006-01-13 2007-07-19 Japan Science And Technology Agency 動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤、キット及びこれらの利用
ITTO20060282A1 (it) * 2006-04-14 2007-10-15 Univ Degli Studi Torino Mezzo di coltura e composizione farmaceutica per la rigenerazione del tessuto cartilagineo relativo procedimento relativi usi e prodotti
US20070292949A1 (en) * 2006-06-20 2007-12-20 Genzyme Corporation Serum-free media and their uses for chondrocyte expansion
EP1900810A1 (fr) * 2006-09-15 2008-03-19 Celogos Methode d'extraction et de selection de cellules
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
US7951593B2 (en) * 2007-03-20 2011-05-31 Universite Rene Descartes-Paris V Culture medium for gingival fibroblasts
US8114668B2 (en) * 2007-05-14 2012-02-14 Cardiac Pacemakers, Inc. Composition for cold storage of stem cells
ITMI20071421A1 (it) * 2007-07-16 2009-01-17 Fond Irccs Istituto Di Ricove Coltura per espandere cellule staminali ex-vivo
CN101821383B (zh) * 2007-09-05 2013-12-18 中国医学科学院基础医学研究所 一种用于人成体原始间充质干细胞体外规模化培养的培养基、方法及获得的原始间充质干细胞及其应用
CN101978047A (zh) 2008-01-18 2011-02-16 明尼苏达大学董事会 干细胞聚集体及制备和使用方法
US20100015710A1 (en) * 2008-04-25 2010-01-21 Sunghoon Jung Methods and Compositions for Isolating, Maintaining and Serially Expanding Human Mesenchymal Stem Cells
WO2010055616A1 (ja) 2008-11-11 2010-05-20 独立行政法人科学技術振興機構 分化誘導培地用添加剤およびその利用
US20110020293A1 (en) 2009-07-21 2011-01-27 Abt Holding Company Use of Stem Cells to Reduce Leukocyte Extravasation
ES2690199T3 (es) 2009-07-21 2018-11-19 Abt Holding Company Uso de células madre para reducir la extravasación de leucocitos
SG177467A1 (en) * 2009-07-23 2012-02-28 Agency Science Tech & Res Pre-natal mesenchymal stem cells
ES2932664T3 (es) * 2009-11-12 2023-01-23 Technion Res & Dev Foundation Medios de cultivo, cultivos celulares y métodos de cultivo de células madre pluripotentes en estado no diferenciado
AU2011220721B2 (en) 2010-02-25 2015-02-05 Abt Holding Company Modulation of macrophage activation
EP2539439B1 (en) 2010-02-25 2018-10-17 ABT Holding Company Modulation of angiogenesis
DK2545928T3 (en) 2010-03-10 2016-10-03 Two Cells Co Ltd CELL PREPARATION CONTAINING MESENYKYMAL STEM CELLS AND METHOD OF PRODUCING THEREOF
SG184440A1 (en) 2010-04-08 2012-11-29 Univ Edinburgh Chondrogenic progenitor cells, protocol for derivation of cells and uses thereof
WO2011143415A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Abt Holding Company Modulation of splenocytes in cell therapy
WO2011158125A2 (en) 2010-06-17 2011-12-22 Katholieke Universiteit Leuven Methods for differentiating cells into hepatic stellate cells and hepatic sinusoidal endothelial cells, cells produced by the methods, and methods for using the cells
SG10201914007YA (en) 2010-08-24 2020-03-30 Univ Minnesota Non-static suspension culture of cell aggregates
EP2625577B1 (en) 2010-10-08 2019-06-26 Terumo BCT, Inc. Customizable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
US9388388B2 (en) 2011-01-31 2016-07-12 Katholieke Universiteit Leuven Methods for making cells with an extra-embryonic endodermal precursor phenotype
CA2837419C (en) 2011-06-06 2021-07-13 ReGenesys BVBA Expansion of stem cells in hollow fiber bioreactors
DK2737056T3 (en) * 2011-07-29 2018-05-22 Cellular Dynamics Int Inc Metabolic maturation in stem cell-derived tissue cells
JP2014526887A (ja) 2011-08-01 2014-10-09 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 造血幹細胞移植の成功率を改善する方法
GB201119335D0 (en) 2011-11-09 2011-12-21 Univ Leuven Kath Hepatitis virus infectable stem cells
US9321995B2 (en) * 2012-12-20 2016-04-26 Suzhou Biowisetech Co., Ltd. Stem cell culture medium and its applications as well as a stem cell culture method
WO2014146057A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Cmr Technologies, Llc Mesenchymal stem cells
SG10201710638UA (en) 2013-04-12 2018-01-30 Saverio Lafrancesca Improving organs for transplantation
WO2014184666A2 (en) 2013-04-30 2014-11-20 Katholieke Universiteit Leuven Cell therapy for myelodysplastic syndromes
JP6512759B2 (ja) * 2013-08-19 2019-05-15 国立研究開発法人国立循環器病研究センター 羊膜間葉系細胞組成物の製造方法及び凍結保存方法、並びに治療剤
CN105765059B (zh) 2013-11-04 2021-05-25 伊索波根控股公司 细胞培养方法
WO2015073913A1 (en) 2013-11-16 2015-05-21 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
CN103805562B (zh) * 2014-01-13 2015-08-05 章毅 培养胎盘间充质干细胞的无血清培养基
EP3122866B1 (en) 2014-03-25 2019-11-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
WO2015179729A1 (en) * 2014-05-23 2015-11-26 Paz Garcia Juan Formulation for regeneration of bone, cartilage, teeth, and periodontium and treatment of tumors and cysts
US9433629B2 (en) 2014-05-23 2016-09-06 Juan Paz Garcia Formulation for regeneration of bone, cartilage, teeth, and periodontium and treatment of tumors and cysts
US9669074B2 (en) * 2014-05-23 2017-06-06 Juan Paz Garcia Formulation for regeneration of bone, cartilage, teeth, and periodontium and treatment of tumors and cysts
US20160090569A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Terumo Bct, Inc. Scheduled Feed
WO2016076102A1 (ja) * 2014-11-14 2016-05-19 株式会社リジェネシスサイエンス 軟骨細胞の無血清培養方法，及び無血清培地
EP3265554B1 (en) * 2015-03-04 2021-11-17 Mesoblast International Sàrl Cell culture method for mesenchymal stem cells
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
CN108884437A (zh) 2016-01-21 2018-11-23 Abt控股公司 用于伤口愈合的干细胞
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
WO2018009147A1 (en) * 2016-07-04 2018-01-11 Agency For Science, Technology And Research Method of generating mesenchymal stem cells and uses thereof
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
JP7393945B2 (ja) 2017-03-31 2023-12-07 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド 細胞増殖
JP7117374B2 (ja) 2017-10-13 2022-08-12 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 灌流培地
JP7372518B2 (ja) 2019-06-27 2023-11-01 国立大学法人山口大学 骨髄由来間葉系幹細胞の培養方法
BR112022014600A2 (pt) * 2020-02-03 2022-09-27 Mosa Meat B V Meio livre de soro para cultura de uma célula progenitora bovina

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5405772A (en) * 1993-06-18 1995-04-11 Amgen Inc. Medium for long-term proliferation and development of cells

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5902741A (en) * 1986-04-18 1999-05-11 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional cartilage cultures
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
WO1996040866A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novartis Ag Serum-free media for primitive hematopoietic cells and methods of use thereof
WO1997033978A1 (en) * 1996-03-12 1997-09-18 Life Technologies, Inc. Hematopoietic cell culture nutrient supplement
EP0920490A2 (en) 1996-07-25 1999-06-09 Genzyme Corporation Chondrocyte media formulations and culture procedures
JP4531135B2 (ja) * 1996-12-06 2010-08-25 オシリス セラピューティクス，インコーポレイテッド ヒト間葉幹細胞の改良された軟骨形成分化

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5405772A (en) * 1993-06-18 1995-04-11 Amgen Inc. Medium for long-term proliferation and development of cells

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2533805C2 (ru) * 2008-06-30 2014-11-20 Сентокор Орто Байотек Инк. Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток, представляющих собой линию клеток человека
RU2461623C1 (ru) * 2011-06-20 2012-09-20 Борис Карпович Гаврилюк Способ выращивания культур хрящевых клеток

Also Published As

Publication number Publication date
AU758073B2 (en) 2003-03-13
ATE342348T1 (de) 2006-11-15
DE69933579D1 (de) 2006-11-23
IL142914A (en) 2006-07-05
AU1380400A (en) 2000-05-29
EP1131407A1 (en) 2001-09-12
JP2002529071A (ja) 2002-09-10
US7109032B2 (en) 2006-09-19
CA2348687A1 (en) 2000-05-18
IL142914A0 (en) 2002-04-21
US6617159B1 (en) 2003-09-09
EP1131407B1 (en) 2006-10-11
US20050090002A1 (en) 2005-04-28
WO2000027996A1 (en) 2000-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2272839C2 (ru) Бессывороточная среда для культуры клеток, используемых для реконструкции костных и хрящевых сегментов (варианты)
US6730314B2 (en) Culturing encapsulated chondrocytes under reduced oxygen partial pressure to produce cartilage implants
US6709864B1 (en) Adipogenic differentiation of human mesenchymal stem cells
EP1018987B1 (en) Neocartilage and methods of use
US20070178074A1 (en) Chondrocyte Culture Formulations
JP2001524307A (ja) ヒト椎間円板細胞の調製方法
JP2010012331A (ja) ヒト間葉幹細胞分化の系列指向誘導
US20080187518A1 (en) Production of Osteoclasts from Adipose Tissues
EP0948255A1 (en) Improved chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells
WO2021254296A1 (zh) 一种生物活性物质组合物、包含所述组合物的无血清培养基及其用途
JPH09509827A (ja) 機能性ヒト組織の再生と利用
US20230117670A1 (en) Bioactive substance composition, serum-free medium comprising the composition, and uses thereof
US11840706B2 (en) Composition and method for generating a desired cell type and/or tissue type from hair follicular stem cells
Hendriks et al. Effect of stratified culture compared to confluent culture in monolayer on proliferation and differentiation of human articular chondrocytes
KR100394430B1 (ko) 인간 혈청을 포함하는 인간 세포 배양용 배지 및 이를이용한 인간 세포의 배양 방법
SHIMOMURA et al. Cultured growth cartilage cells.
US20030026786A1 (en) Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells
US20070004037A1 (en) Methods and compositions for culturing keratinocytes
CN112899223A (zh) 宫血干细胞制备方法
Zamani et al. Comparison of cartilage specific markers in articular and differentiated chondrocytes in pellet system.
RU2242980C1 (ru) Культура генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека и способ их получения
MXPA97005612A (en) Induction directed by lineage of the differentiation of human mesenquimatosas cells of ori

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20071109