KR100394430B1 - 인간 혈청을 포함하는 인간 세포 배양용 배지 및 이를이용한 인간 세포의 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 세포의 증식 속도가 우수하고 세포의 표현형이 안정적으로 발현되는 인간 세포 배양용 배지 및 이를 사용한 인간 세포의 배양 방법에 관한 것으로, 인간 세포의 배양에 사용되는 배지에 있어서 인간 혈청을 포함하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 인간 혈청을 포함하는 인간 세포 배양용 배지 및 이를 이용한 인간 세포 배양 방법에 관한 것이다.
연골은 재생이 어려워, 관절염과 같이 연골에 일어나는 질병은 그 치료가 매우 어렵다.
이러한 질병을 치료하기 위해, 최근에는 환자 자신의 연골 세포를 시험관 내에서 배양하여 증식시킨 후 이를 환부에 이식하는 방법이 개발되었다. 이러한 자가 이식법이 성공하기 위하여는, 가능한 한 많은 연골 세포가 필요할 뿐만 아니라 제2형 콜라겐, 프로테오글리칸 등 연골 세포 고유의 표현형을 유지하고 있어야 한다.
현재 세포 이식을 위해 주로 사용되고 있는 연골 세포의 실험실적 배양 방법은, 먼저 연골 세포를 적절한 배지 중에서 단층 배양하여 세포를 증식시킨 후 이를 알지네이트 비드내에서 3 차원 배양하여 연골 세포 고유의 표현형을 복원하는 것이다.
그러나, 연골 세포는 증식 속도가 매우 느려 단층 배양하더라도 적당한 수의 세포수를 얻기 위해 오랜 시간이 필요하며 이 과정중에 세포가 탈분화되고, 연골 세포의 표현형을 복원하기 위해 3 차원 배양하고 있으나 이 과정에서는 세포수가 증가하지 않는다는 문제점이 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 증식 속도의 지연 및 표현형의 상실 등의 종래의 문제점이 없이 연골 세포를 포함한 인간 세포의 배양에 사용될 수 있는 배지를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 배지를 사용한 인간 세포의 배양 방법을제공하는 데 있다.
도 1은 배양 20 시간 동안의 연골 세포의 증식을 보여주는 그래프이다.
도 2는 배양 80 시간 동안의 연골 세포의 증식율을 보여주는 그래프이다.
도 3a 및 3b는 각각 실시예 1 및 우태아혈청 대조군의 배양 단계에서 콜라겐의 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이고, 도 3c 및 3d는 각각 실시예 2 및 우태아혈청/TGF-β 대조군의 배양 단계에서 콜라겐의 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 인간 세포의 배양에 사용되는 배지에 있어서, 인간 혈청을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 세포 배양용 배지를 제공한다.
다른 목적에 따라, 본 발명에서는 인간 세포를 상기 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 세포의 배양 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 특징적으로 사용되는 인간 혈청으로는, 배양하고자 하는 세포의 기원이 되는 환자에서 채취한 혈액으로부터 유래한 것이 바람직하나, 혈액원 등에서 입수할 수도 있다. 인간 혈청으로는 O형, A형, B형, AB형의 혈액으로부터 유래된 것을 모두 사용할 수 있으며, 이 중 특히 AB 형의 혈액으로부터 유래된 것이 바람직하다. 인간 혈청은 인간 세포의 증식 속도를 증가시키고 그 표현형도 안정적으로 발현하게 한다. 인간 혈청은 인간 세포의 배양을 위한 배지 중에서 1 내지 50 %(v/v), 바람직하게는 5 내지 20 %(v/v)의 양이 되도록 첨가하여 사용할 수 있다.
인간 혈청이 첨가될 수 있는, 인간 세포의 배양을 위한 배지로는, 인간 세포의 배양에 통상적으로 사용되는 배지이면 모두 사용할 수 있으며, 대표적인 예를 들면 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Gibco BRL사), 한스(Han's) F-12 배지(Gibco BRL사) 등이 있다.
또한, 본 발명의 배지에는 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 소디움셀레나이트, T3 호르몬 (3,3,5-triiodo-L-thyronine) 또는 이의 혼합물을 추가로 포함할 수 있으며, 인간 인슐린과 트랜스페린은 각각 1 ㎎/ℓ 내지 15 ㎎/ℓ의 양으로, 소디움 셀레나이트와 T 3 호르몬은 각각 1 ㎍/ℓ 내지 15 ㎍/ℓ의 양으로 사용할 수 있다. 또한 상기 배지에는 전환 성장 인자(transforming growth factor-β, TGF-β), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 각질 세포 성장 인자(keratinocyte grwoth factor, KGF), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF) 또는 이의 혼합물을 추가로 포함할 수 있으며, 1 ㎍/ℓ 내지 10 ㎍/ℓ의 양으로 사용할 수 있다.
상기 배지에서 배양될 수 있는 인간 세포로는, 연골 세포, 간 세포, 뼈 세포, 신경 세포, 근육 세포 등을 들 수 있으며, 이 중 연골 세포가 바람직하다. 인간 세포는 적출된 인간 조직을 적절한 효소로 처리하여 유리된 세포로 얻을 수 있는데, 예를 들어 연골 세포는 뼈의 양 끝에 존재하는 연골 조직을 하이알루로니데이즈, 트립신, 콜라게네이즈 등의 효소로 처리하여 유리된 세포로 얻을 수 있다. 특히 인간 세포는 이 세포의 이식을 필요로 하는 환자 자신의 세포인 것이 바람직하다.
인간 세포의 배양은 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있는데, 대표적인 예로는 상기 배지 중에서 5 내지 15 %의 이산화탄소의 통기량에서 35 내지 39 ℃에서 5 일 내지 28 일 동안 1차 배양하고, 이 과정 중에 탈분화된 연골 세포를 알지네이트비드내에 삽입시켜 5 내지 15 %의 이산화탄소하에서 35 내지 39 ℃에서 3 일 내지 14 일 동안 3 차원 배양하는 것이다.
본 발명의 방법은 배양 기간이 짧으며 배양된 세포의 표현형도 안정적으로 발현시키는 장점을 가지며, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 인간 세포는 세포 또는 조직 이식에 유용하게 사용될 수 있고 이식에 따른 부작용의 우려도 없다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 %는 별도의 언급이 없는 경우 고체/고체는 중량/중량 %, 고체/액체는 중량/부피 %, 그리고 액체/액체는 부피/부피 %를 각각 나타낸다.
실시예 1
골관절염 환자의 인공관절 전치환술시 제거되는 연골 조직을 0.1 % 하이알루로니데이즈 용액 중에서 1 시간, 0.2 % 트립신 용액 중에서 1 시간, 이어서 0.2 % 콜라게네이즈 용액 중에서 3 내지 4 시간 동안 차례로 처리하여 유리된 연골 세포를 얻었다.
이 연골 세포를 10 % 인간 혈청(혈액원에서 입수)이 포함된 DMEM 배지(Gibco BRL사에서 입수) 중에서 95 % 공기와 5 % 이산화탄소의 통기량에서 37 ℃에서 약 4주 동안 1차 배양하였다. 1차 배양으로 얻은 탈분화된 연골 세포를 2.0 % 알지네이트 비드(Sigma사)가 포함된 DMEM 배지 중에서 95 % 공기와 5 % 이산화탄소의 통기량에서 37 ℃로 1주 동안 3 차원 배양하였다.
실시예 2
10 % 인간 혈청 및 5 ng/㎖의 TGF-β가 포함된 DMEM 배지를 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 연골 세포를 배양하였다.
시험예 1: 인간 혈청 농도에 따른 연골 세포의 증식율
실시예 1 및 2의 연골 세포 배양액을 역광 현미경하에서 관찰하여 연골 세포의 형태를 조사하였으며, 세포 배양액을 문헌(Acta Orthop. Scand.,70(1), 55-61, (1999))에 기재된 방법에 따라 트립판 블루 시약으로 염색한 후 광학 현미경 하에서 세포수를 측정하거나, 문헌(J. of Ortopadic Res.,15, 483-490(1997);Biochimica et Biophysica Acta,1425, 505-515(1998))에 따라 [3H]-티미딘이 포함된 배지 중에서 배양한 후 세포내 방사능의 양을 측정하여 증식율을 조사하였다.
이때, 대조군으로는 10 % 우태아혈청이 포함된 배지(우태아혈청 대조군)와 10 % 우태아혈청 및 5 ng/㎖ TGF-β가 포함된 배지(우태아혈청/TGF-β 대조군)를 사용하고 공시험군으로는 혈청이 포함되지 않은 배지를 사용하여, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 연골 세포를 배양한 후, 연골 세포의 형태와 증식율을 조사하였다.
그 결과, 실시예 1과 2에서 배양된 연골 세포는 대조군의 경우보다 서로 모여 뭉치는 경향이 크게 나타났으며, 이러한 경향은 계대배양시 더욱 심화되었다.
도 1은 배양 20 일 동안 연골 세포의 증식을 보여주는 그래프이고, 도 2는 배양 80 시간 동안의 연골 세포의 증식율을 보여주는 그래프이다. 도 1과 2에서 보듯이, 연골 세포의 증식율은 실시예 2에서 배양된 배양액에서 가장 높다. 특히 실시예 2의 배양액에서는 초기 증식 속도가 매우 빠르게 나타나는데, 이는 연골 세포가 인간 혈청이 포함된 배지에 쉽게 적응한 데 기인하는 것으로 보인다. 또한 이 경우에는 연골 세포의 증식 기간도 연장되었다.
한편, 실시예 1과 2, 대조군 및 공시험군에서 배양된 연골 세포의 수는 모두 배양 개시 후 3 주가 되었을 때 가장 많았으며, 4 주에 감소하기 시작하는 경향을 보였고 이때 실시예 1 및 2에서 배양된 세포의 감소율이 대조군 및 공시험군의 경우보다 미미하였다.
따라서, 본 발명에서는 인간 혈청을 사용함으로써 우태아혈청을 사용한 경우보다 세포 증식 속도가 향상된 효과를 보이며, TGF-β를 추가로 사용함으로써 세포 증식이 더욱 촉진된다.
시험예 2: 인간 혈청에 의한 제2형 콜라겐의 발현율
연골 세포의 재분화에 의한 표현형의 변화를 조사하기 위해, 실시예 1 및 2에서 배양된 연골 세포에 대해 제2형 콜라겐에 대한 항체(Chemicon International Inc)를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하여 제2형 콜라겐의 발현량을 조사하였다.
이때, 대조군으로는 10 %의 우태아 혈청이 포함된 배지(우태아혈청 대조군)와 10 % 우태아혈청 및 5 ng/㎖ TGF-β이 포함된 배지(우태아혈청/TGF-β 대조군)를 사용하여 제2형 콜라겐의 발현량을 조사하였다.
도 3a 및 3b는 각각 실시예 1 및 우태아혈청 대조군에서 1 차 배양 개시 후 1주, 2주, 3주, 4주 및 5주가 된 때와 3 차원 배양한 때의 제2형 콜라겐의 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이고, 도 3c 및 3d는 각각 실시예 2 및 우태아혈청/TGF-β 대조군에서 1 차 배양 개시 후 1주, 2주, 3주 및 4주가 된 때와 3 차원 배양한 때의 제2형 콜라겐의 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다. 도 3a 내지 3d에서 보듯이, 제2형 콜라겐의 발현은 실시예 1 및 2와 대조군에서 1차 배양 단계 중 5 주째에 멈춘 후, 3 차원 배양 단계에서 재개되었다. 특히, 실시예 2의 배양액에서는 1차 배양 단계에서도 제2형 콜라겐의 발현이 더 오래 지속되었으며 그 발현량도 실시예 1 및 대조군에서보다 현저하게 많았다.
따라서, 본 발명에서는 인간 혈청을 사용함으로써 우태아혈청을 사용한 경우보다 세포의 표현형을 안정적으로 유지하고 효과적으로 재분화시키며, TGF-β를 추가로 사용함으로써 이러한 효과가 더욱 증가된다.
본 발명의 배지 및 방법에 따르면 인간 혈청을 사용함으로써 인간 세포 증식 속도가 증가되어 배양 기간이 단축될 뿐 아니라 원하는 표현형이 안정적으로 발현된다. 또한 본 발명의 배지 및 방법에서는 TGF-β를 추가로 사용함으로써 이러한효과가 더욱 상승된다. 따라서 본 발명의 방법으로 얻어진 인간 세포는 세포 또는 조직 이식에 유용할 뿐 아니라, 이식에 따른 부작용의 우려도 없다.
Claims (9)
- 인간 세포의 3차원 배양에 사용되는 배지에 있어서, 인간 혈청을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 세포의 3차원 배양용 배지.
- 제 1 항에 있어서,상기 인간 혈청을 1 내지 50 %(v/v)의 양으로 포함하는 배지.
- 제 1 항에 있어서,상기 인간 혈청이 AB 형의 혈액으로부터 유래된 것인 배지.
- 제 1 항에 있어서,상기 인간 세포가 연골 세포인 배지.
- 제 1 항에 있어서,인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, T3 호르몬 또는 이의 혼합물을 추가로 포함하는 배지.
- 제 1 항에 있어서,세포증식억제 인자(TGF-β), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 상피세포 성장 인자(KGF), 표피 성장 인자(EGF) 또는 이의 혼합물을 추가로 포함하는 배지.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 따른 배지 중에서 인간 세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는 인간 세포의 3차원 배양 방법.
- 제 7 항의 배양 방법에 의해 3차원 배양된 인간 세포.
- 제 8 항에 있어서,연골 세포인 인간 세포.
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