CN101821383B - 一种用于人成体原始间充质干细胞体外规模化培养的培养基、方法及获得的原始间充质干细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种体外规模化生产制备人成体组织(骨髓)来源的原始间充质干细胞(pMSCs，细胞标记为Flk1、Nanog阳性)的方法及其制备产品，以及这种方法和制备产品在抑制肿瘤细胞增殖中的应用。通过简化磁珠分选工艺、将牛血清培养基改进为人血清培养基、采用低浓度氧(2％)培养条件等pMSCs制备过程中的关键工艺步骤和参数改良，从而达到了规模化制备pMSCs的目的。更进一步的方面，利用pMSCs表达Nanog基因的特性，发明了pMSCs用于抑制肿瘤细胞增殖的新用途。
Description
技术领域
本申请涉及体外规模化生产制备人成体组织(骨髓)来源的原始间充质干细胞(pMSCs，细胞标记为Flk1、Nanog阳性)的方法及其制备产品，本申请还涉及该细胞用于抑制肿瘤细胞增殖的应用。
背景技术
干细胞是生物体内存在的一种具有自我更新能力和多系分化潜能的原始细胞群体，人体所有的组织器官细胞均由干细胞分化而来。干细胞大致可分为两种，一种是胚胎干细胞，另一种是成体干细胞。胚胎干细胞是最原始的干细胞，可无限复制并分化为任意组织细胞，但由于目前科学技术水平和伦理道德的限制使其在短期内难以走向实际应用。近年来对成体干细胞的研究结果显示了其在未来生命科学中的良好应用前景。
目前培养和纯化成体干细胞(间充质干细胞)的通用方法主要都采用磁珠分选间充质干细胞，在常规氧含量(20％O2)条件下培养，在使用的培养基通常添加动物来源的血清，例如牛或马血清等。一方面，通过常规方法培养出的间充质干细胞在干细胞生物学特性、干细胞分化潜能等方面均难以达到符合实际应用的要求；另一方面，这些常规方法本身存在诸多缺点，例如，当采用常规使用的含量为100-200ml/L动物血清的培养基时，其通常存在以下缺点：首先培养的间充质干细胞的平均倍增时间较长，且生长速度不均一，无法在规定时间内制备出满足需求的细胞数量；其次，采用的动物血清不可避免地存在异种免疫排斥及动物病源传染等危险因素。另外，通常采用的磁珠分选工艺也具有许多缺点。首先，使用成本较高，目前用于细胞分离的磁珠价格较为昂贵，以每份骨髓样本(20-30m1)大约需分离108个细胞计算，单例人pMSCs制备成本将至少增加4000元人民币；其次，磁珠分选工艺体外操作时间较长，使细胞污染的机会大大增加，并对干细胞活性有很大影响；第三，磁珠分选时无论以阳性或阴性选择方式分离，都会损失不同数量细胞；结合在细胞上的磁珠在后续工艺操作中无法做到完全清除，最后可随干细胞移植进入人体内，这些磁珠对人体健康也存在负面影响的可能性。对于常规氧含量(20％O2)的培养条件，由于体内氧浓度显著低于此值，其中动脉血平均氧浓度约为12％，组织的平均氧浓度约为3％，pMSCs的主要积聚部位——骨髓的氧浓度为1％-7％，富集干细胞的胚体氧浓度更低。过高浓度的氧使细胞产生大量的自由基，具有损伤应激作用。
原始间充质干细胞(pMSCs)来源于人成体组织，并存在于人体各种组织中，具有胚胎干细胞相似的自我更新和多系分化潜能，在特定环境下可诱导分化为多种组织细胞，且细胞免疫原性低，移植后能在受体内形成稳定嵌合体，诱导机体产生特异性免疫耐受，具备了异体移植应用的特性。制备得到的pMSCs在体内外具有多种生物学功能，包括重建造血、再生血管、减轻纤维化损伤、抑制免疫排异等作用，可用于白血病、心肌梗塞、肝脏进行性损伤、糖尿病等多组织器官损伤性疾病的治疗应用。
发明内容
目前仍然存在克服现有的上述方法缺陷并且快速提供符合实际应用需要的成体干细胞的需要，申请人提供的本申请满足了上述需求。
本申请提供了一种用于培养来源于人成体组织的原始间充质干细胞pMSCs的培养基，包括细胞基础培养基和人血清，所述人血清的终浓度为10-100ml/L。
进一步，本申请提供的培养基优选的人血清的终浓度为10-30ml/L。更优选的人血清的终浓度为20ml/L。本申请所述的培养基优选的人血清为人外周或脐带血血清。
另一方面，本申请提供的培养基进一步包括人血白蛋白、表皮生长因子EGF和血小板衍生生长因子PDGF，其中所述人血白蛋白的终浓度为5-20mg/ml，所述表皮生长因子的终浓度为1-100ng/ml，所述血小板衍生生长因子的终浓度为1-100ng/ml。优选的人血白蛋白的终浓度为5-10mg/ml，优选的表皮生长因子的终浓度为10-30ng/ml，优选的血小板衍生生长因子的终浓度为10-30ng/ml。更优选的人血白蛋白的终浓度为10mg/ml，更优选的表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，更优选的血小板衍生生长因子的终浓度为10ng/ml。
进一步，本申请提供的培养基用于培养骨髓来源的原始间充质干细胞。
再一方面，本申请提供一种体外培养来源于人成体组织的原始间充质干细胞pMSCs的方法，该方法包括以下步骤：
1)分离人成体组织单个核细胞，并悬浮于所述的培养基中，为原代细胞悬浮液；
2)将该原代细胞悬浮液按1×106个细胞/ml的接种密度接种在含有述的培养基的塑料培养皿中；按体积比计算，在2％(1-5％，优选2％)的氧浓度，5％的CO2浓度和37℃下，在饱和湿度培养箱中培养；反复贴壁培养3-4次，获得人成体组织的原始间充质干细胞。
进一步，所述方法用于培养来源于骨髓的原始间充质干细胞。
另一方面，本申请提供了由上述方法获得的原始间充质干细胞。进一步，该原始间充质干细胞的免疫表型为Flk1阳性，且表达Nanog基因。
再一方面，本申请提供了所述的原始间充质干细胞在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的用途。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，该药物组合物包含所述的原始间充质干细胞。
再一方面，本申请提供一种成体原始间充质干细胞培养物PEPSC，其保藏号为CGMCC No.2152，于2007年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，包括原始间充质干细胞。
另一方面，本申请提供所述的成体原始间充质干细胞培养物PEPSC，其中所述的原始间充质干细胞的免疫表型为Flk1阳性，且表达Nanog基因。
再一方面，本申请提供所述的成体原始间充质干细胞培养物PEPSC在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的用途。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，该药物组合物包含所述的成体原始间充质干细胞培养物PEPSC。
附图说明：
图1：常规氧浓度和低氧浓度条件下培养的pMSCs细胞表型特征比较。A低氧浓度pMSCs，B常规氧浓度pMSCs。
图2：常规氧浓度和低氧浓度条件下培养的pMSCs细胞周期测定比较。A低氧浓度pMSCs，B常规氧浓度pMSCs。
图3-1：常规氧浓度和低氧浓度条件下培养的pMSCs分化能力研究I：向成骨细胞诱导2周后，Von Kossa染色检测钙质沉积。A低氧浓度pMSCs，B常规氧浓度pMSCs。
图3-2：常规氧浓度和低氧浓度条件下培养的pMSCs分化能力研究II：向脂肪细胞诱导2周后，油红O染色。A低氧浓度pMSC，B常规氧浓度pMSC。
图3-3：常规氧浓度和低氧浓度条件下培养的pMSCs分化能力研究III：Matrigel胶上诱导向内皮分化48小时后，形成网格状管样结构。A低氧浓度pMSCs，B常规氧浓度pMSCs。
图4：常规氧浓度和低氧浓度条件下培养的pMSCs增殖能力比较。
图5：pMSCs不同培养基中细胞的形态比较：
A：20ml/L胎牛血清培养基中的pMSCs形态；B：20ml/L外周血血清体系中的pMSCs的形态；C：20ml/L脐带血血清培养基中的pMSCs形态。
图6：pMSCs在不同的培养基中表型检测结果：
A.胎牛血清培养基中的pMSCs免疫表型测定结果；B.外周血血清培养基中的pMSCs免疫表型测定结果；C.脐带血清培养基中的pMSCs免疫表型测定结果。
图7：pMSCs在不同的培养基中细胞周期的比较。
图8-1：不同培养基的pMSCs多向分化能力的研究I，(成脂诱导体系诱导三周后油红“O”染色结果)：
A：胎牛血清培养基；B：外周血血清培养基；C：脐带血清培养基，
P3：第3代；P7：第7代。
图8-2：不同培养基的pMSCs多向分化能力的研究II，(成骨诱导体系诱导三周后Von Kossa染色结果：褐色显示钙基质沉积)：
A：胎牛血清培养基；B：外周血血清培养基；C：脐带血清培养基，
P3：第3代；P7：第7代。
图8-3：不同培养基下pMSCs多向分化能力的研究III，(成神经诱导三周后免疫荧光染色结果)：
A：胎牛血清培养基；B：外周血血清培养基；C：脐带血清培养基，
P3：第3代；P7：第7代。
图9：pMSCs在三种不同培养基中的生长曲线：
1：胎牛血清培养基；2：外周血血清培养基；3：脐带血清培养基，三组培养基数据差异相互比较无统计学意义。
图10：RT-PCR检测人pMSCs表达Nanog、Dkk-1结果。
图11-1：与pMSCs共培养后的肿瘤细胞增殖检测：
K562：单独培养的K562细胞；K562+pMSC：K562与pMSCs共培养；MCF7：单独培养的MCF7细胞；MCF7+pMSC：MCF7与pMSCs共培养；HL60：：单独培养的HL60细胞；HL60+pMSC：HL60与pMSCs共培养。
这些结果已经分析了经过6次相互独立的实验后计算得到的平均标准偏差(+S.D.)。
图11-2：K562与pMSCs共培养时加入中和抗体或transwell时检测K562的增殖：
组1：单独培养的K562细胞；组2：与pMSCs共培养的K562细胞；组3：与pMSCs共培养的K562细胞，培养基中加有anti-Dkk-1；组4：与pMSCs共培养的K562细胞，并使用transwell隔开两种细胞。
图11-3：RNA干扰载体转染pMSCs后，Dkk-1和Nanog的干扰效率：
A：定量PCR检测Nanog表达：SiM：转染干扰空载体对照的pMSCs中Nanog的表达量；SiN：转染SiNanog载体的pMSCs中Nanog的表达量；
B：定量PCR检测Dkk-1表达：SiM：转染干扰空载体对照的pMSCs中Dkk-1的表达量；SiD：转染SiDKK1载体的pMSCs中Dkk-1的表达量；SiN：转染SiNanog载体的pMSCs中Dkk-1的表达量；
C：western blot检测Nanog和Dkk-1的表达。
图11-4：Nanog和Dkk-1干扰后的pMSCs与K562共培养，检测K562细胞周期的变化：
组1：单独培养的K562细胞；组2：与转染干扰空载体对照的pMSCs共培养的K562细胞；组3：与转染SiDKK1载体的pMSCs共培养的K562细胞；组4：与转染SiNanog载体的pMSCs共培养的K562细胞。
图11-5：Nanog和Dkk-1干扰后的pMSCs与K562共培养，westernblot检测K562细胞中β-catenin的累积量。
图11-6：Nanog和Dkk-1干扰后的pMSCs与K562共培养，定量PCR检测K562中细胞周期相关蛋白的基因表达：
A：定量PCR检测P21表达；B：定量PCR检测P27表达；C：定量PCR检测c-myc表达；D：定量PCR检测cyclinD2表达。
K562：单独培养的K562细胞；K562+SiM：与转染干扰空载体对照的pMSCs共培养的K562细胞；K562+SiD：与转染SiDKK1载体的pMSCs共培养的K562细胞；K562+SiN：与转染SiNanog载体的pMSCs共培养的K562细胞。
以下将结合附图和实施例对本申请进行详细说明，其中本申请的说明书和实施例仅仅是说明而非限定本申请，本领域技术人员完全可以在本申请公开的具体内容的基础上结合现有技术对本申请做出多种改进，修饰。但所做的改进和修饰将不超出本申请的精神，并属于本申请的权利要求所要求保护的范围。
具体实施方式
本申请的目的是提供一种在体外规模化分离培养人成体组织(骨髓)来源pMSCs的改进方法。
本申请所提供的分离培养人pMSCs的方法，是获取一定量的骨髓组织，经过预处理工艺后，收集原代种子细胞，将所收集的细胞接种在塑料培养皿中，加入特定细胞培养基进行培养；通过贴壁培养方法纯化细胞，利用培养细胞独有的贴壁特征对细胞进行纯化，将细胞多次贴壁，去悬浮，达到纯化pMSCs并去除杂细胞的目的。该方法与传统干细胞分选方法相比的最大优点即是摈弃了磁珠分选纯化工艺。磁珠分选工艺使用成本较高，目前用于细胞分离的磁珠价格较为昂贵，以每份骨髓样本(20-30ml)大约需分离108个细胞计算，单例人pMSCs制备成本将至少增加4000元人民币；其次，磁珠分选工艺体外操作时间较长，使细胞污染的机会大大增加，并对干细胞活性有很大影响；第三，磁珠分选时无论以阳性或阴性选择方式分离，都会损失不同数量细胞；结合在细胞上的磁珠在后续工艺操作中无法做到完全清除，最后可随干细胞移植进入人体内，这些磁珠对人体健康也存在负面影响的可能性。采用本申请的新方法之后，能够利用较低的成本，在规定时间内扩增出足够数量和质量(规模化生产)的干细胞，并能够使细胞纯度达到85％以上，符合成品质量标准，从而满足治疗应用的需要。本申请提供的方法大幅简化了细胞纯化工艺步骤，提高了生产效率，降低了生产工艺成本，而通常的干细胞培养方法仅能少量制备，只适用于科学研究，其细胞本身的增殖能力与培养成本均难以满足规模化生产制备的要求。
本申请提供的pMSCs培养制备方法与常规干细胞培养不同的是，在pMSCs的制备培养全过程中，采用了一种低浓度O2的培养条件。体外细胞培养一般是在20％O2浓度下进行，而体内氧浓度显著低于此值，动脉血的平均氧浓度约为12％，组织的平均氧浓度约为3％，pMSCs的主要积聚部位——骨髓的氧浓度为1％-7％，富集干细胞的胚体氧浓度更低。通常所谓的低氧浓度才更符合生理状态，过高浓度的氧使细胞产生大量的自由基，反而具有损伤应激作用。本申请采用更接近生理环境的培养条件(2％体积浓度的O2)来培养pMSCs，较常规氧浓度条件(20％体积浓度的O2)更适于pMSCs生长、增殖及维持未分化状态。本申请采用的低氧浓度培养环境由恒温三气培养箱提供，操作简单，可重复性好，适于规模化培养。
此外，本申请提供了区别于常规的牛血清培养基的一种新的培养基，该培养基包含人血清。目前常规的成体干细胞培养(基)体系均采用胎牛血清培养基，体系中添加的胎牛血清系异种来源，与人体存在种属差异，并且存在污染外源性异种病原的潜在危险。类似血清一类的干细胞培养必须添加物向人源化转变将是今后干细胞生产工艺技术发展的主要改进方向。本申请率先发明了一种人源血清培养基替代胎牛血清培养基，并在该体系下成功制备出与原培养基质量相同的成体干细胞(表1)。
进一步，本申请提供的培养基还包括人血白蛋白产品。本申请优选的培养基中的血清来自人外周血血清/脐带血血清。人血清和人血白蛋白分别取代常规培养基配方中的胎牛血清、牛血白蛋白成分，实现了培养液中所有异种源添加成分的人源化。同时，另外一个显著的优点是：培养基中采用的人脐带血血清，来自于脐带血储存(库)机构，脐带血血清是脐带血储存之前采集脐血造血干细胞工艺处理后被舍弃的副产物，但脐带血血清中含有大量细胞因子和营养物质，可作为胎牛血清替代品，并且脐带血的来源及其采集处理工艺手段充分保证了血清本身的洁净无污染，加之其来源十分方便(脐带血加工废弃物再利用)，保证了成体干细胞规模化制备时的培养基添加物供应，此外还可大幅降低成体干细胞制备成本(血清产品价格昂贵，且多依赖进口)。
采用上述人血清培养基体外制备成体干细胞pMSCs，结果显示：按照本申请的方法培养制备出的pMSCs，其数量和质量均达到质量检定标准，完全符合临床治疗的使用要求(图5-图9)。并且采用这一培养基避免了动物血清可能带来的异种免疫排斥反应以及未知病毒感染的危险，临床应用更加安全可靠。
本申请中使用的外周血血清、脐带血血清均来自符合GMP要求的工艺过程产品，人血白蛋白是符合国家药品标准的上市产品，以上条件保证了采用此种人血清培养基的工艺技术在成体干细胞产业化过程中的顺利推进。
上述方法中，将原代细胞在专用培养基中反复贴壁培养3-4次，即可得到符合纯度要求的人原始间充质干细胞。
上述方法中，所收获的细胞按5×104个细胞/ml的接种密度接种在塑料培养皿中；
上述方法中，所述培养的环境条件为5％CO2、2％O2、37℃和饱和湿度培养箱。
本申请的分离培养方法，适合于从骨髓组织中分离pMSCs，细胞纯化方法适用于各种组织来源的pMSCs。该分离培养方法简单、效率高、成本低。培养得到的pMSCs具有CD31-、CD34-、CD45-和HLA-DR-(阴性)，且CD29+、CD44+、CD105+和Flk1+(阳性)的表型。
通过本申请方法规模化制备出的人pMSCs能够表达特异性细胞标志Flk1、Nanog。Flk1是控制规模化制备pMSCs细胞纯度和细胞质量的特异细胞表面标志；Nanog是一个转录因子，参与了DKK-1基因的转录调节，进而影响其蛋白质的表达，并通过Wnt信号通路调节β-catenin在细胞内聚积，影响β-catenin入核促进细胞，抑制肿瘤细胞从G1期进入S期增殖。通过这一原理，利用表达Nanog的pMSCs可发挥抑制肿瘤细胞增殖的应用，其抑制肿瘤的作用机制是通过分泌可溶性因子DKK-1分子发挥作用，抑制肿瘤细胞处于G0/G1静止期。
本申请得到的pMSCs可应用于抑制肿瘤细胞增殖。在体外将pMSCs与多种人体血液病肿瘤细胞共培养，通过pMSCs表达Nanog基因，调节Dkk蛋白表达，最终通过Wnt信号传导通路来发挥显著抑制肿瘤细胞增殖的作用(图11)。进一步研究其作用机制，首先利用中和抗体技术证明了pMSCs影响肿瘤细胞增殖主要是通过分泌Dkk蛋白发挥作用，在利用RNAi技术干扰了pMSCs的Nanog表达或Dkk分泌后，pMSCs对肿瘤细胞周期的影响明显减弱。pMSCs具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，但是成熟的基质细胞却不具有这种作用，本申请首次通过利用pMSCs表达Nanog蛋白(目前的研究认为Nanog蛋白除胚胎干细胞表达之外其它细胞均不表达)对Dkk蛋白的表达进行特异调节，从而进一步利用Dkk蛋白通过wnt信号通路影响肿瘤细胞的周期，最终抑制肿瘤细胞的生长增殖。
本申请得到的pMSCs及其抑制肿瘤细胞的方法可应用于红白血病、早幼粒细胞白血病等血液系统肿瘤，并为治疗其它系统组织肿瘤如乳腺癌等提供了基础理论和临床研究证据，为肿瘤治疗提供了新的方法途径。
为更清楚说明本申请的内容，申请人将结合下述实施例进行更详细的描述，本领域技术人员可以明白，下述实施例仅用于说明本申请的发明内容，并不对发明内容进行限制。如无特别说明，下述实施例中的实验方法，均为常规方法。
实施例1：人pMSCs的体外规模化制备培养方法
一、试剂及培养基
本申请所采用的人pMSCs规模化制备所用的特定细胞培养基，包括细胞基础培养基、人血清、人血白蛋白、表皮生长因子(EGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)；所述人血清的终浓度为10-100ml/L，所述人血白蛋白的终浓度为(5-20mg/ml)，所述表皮生长因子的终浓度为1-100ng/ml，所述血小板衍生生长因子的终浓度为1-100ng/ml。
其中，所述人血清的优选浓度为10-30ml/L，最优选为20ml/L；所述人血白蛋白的终浓度优选为5-10mg/ml，尤其优选为10mg/ml；所述表皮生长因子的终浓度优选为10-30ng/ml，尤其优选为10ng/ml；所述血小板衍生生长因子的终浓度优选为10-30ng/ml，尤其优选为10ng/ml。
所述细胞基础培养基可为DMEM/F12、MCDB-201、DMEM、MEM、RPMI1640、DMEM、M199、BME和IMEM等中的任意一种或其任意组合。
其中，I型胶原酶购自Sigma公司；胰蛋白酶购自Gibco公司；DMEM/F12(即DF12)、M199、MEM、RPMI1640、BME、IMEM和DMEM购自GIBCO公司；MCDB-201购自Sigma公司；EGF购自Gibco公司；PDGF、VEGF和bFGF购自Sigma公司；氢化可的松购自Sigma公司；FCS和马血清(HS)购自Hyclone公司；人血白蛋白购自哈尔滨世亨生物工程药业公司；人凝血酶原由上海莱士血制品有限公司惠赠；人脐带血血清由北京市脐带血库惠赠；人外周血血清自制(自然凝血得到，为经典教科书方法)。
二、人pMSCs的体外规模化制备培养方法
本申请提供的体外规模化培养人pMSCs细胞的方法，具体步骤如下：
1.获得人成体组织原代细胞悬浮液
1.1按照本领域现有技术公开的方法获得人成体组织单个核细胞，将人成体组织单个核细胞悬浮于含2％人血清的培养基中，获得人成体组织原代细胞悬浮液。
1.2用胎盘蓝染色方法计数活细胞，并将细胞浓度调整至约1×106个/ml。
2.人pMSCs的分离培养
2.1取15ml上述密度(1×106个/ml)的单个核细胞悬液接种于本申请细胞培养基的T75培养瓶中。预先将三气培养孵箱的条件设置为1-5％O2，优选2％O2、5％CO2、37℃，并预平衡3-5小时，然后再将细胞放入培养箱。
2.2培养24小时后，有少量细胞贴壁，原代pMSCs呈克隆样生长，细胞呈梭形。弃掉悬浮细胞，加入新鲜配制的本申请的细胞培养基，继续于1-5％O2，优选2％O2培养箱中培养，培养过程中每3天更换一次培养基。
2.3当细胞长至70％-80％融合时，吸去培养基，加入10ml生理盐水洗涤细胞一次，加入0.25％胰酶10ml消化2分钟，然后加入0.2ml人血清终止消化。1000rpm，室温离心5分钟，弃上清，加入培养液重新悬浮细胞，计数，以每瓶5×104/ml的细胞密度传代培养于1-5％O2，优选2％O2的低氧浓度的三气培养箱中。重复2.3步骤3-4次(反复传代贴壁培养)，获得所需要的pMSCs细胞。
3.人pMSCs的冻存
3.1将培养扩增好的pMSCs用0.25％胰酶10ml消化2分钟，然后加入0.2ml人血清终止消化，于1000rpm离心5分钟。
3.2弃去上清，将细胞悬浮于适量DF12培养液中，与等体积细胞冻存液混匀，使细胞浓度小于1×107个细胞/ml，置于冻存管中。
3.3将细胞经过程控降温后于液氮中冷冻保存。
将冻存的细胞培养物命名为成体原始间充质干细胞培养物PEPSC，于2007年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.2152。
4.人pMSCs的复苏
4.1从液氮中取出冻存细胞于37℃水浴中迅速融化。
4.2将细胞置于20ml含20ml/L人血清的DF12培养液中，1500rpm离心5分钟。
4.3弃上清，调整细胞浓度为以每瓶1×106个细胞传代培养于2％O2低氧浓度孵箱中。
实施例2：常规氧浓度和本申请的低氧浓度培养pMSCs的生物学特性比较
将本申请所述培养方法获得的pMSCs与常规氧浓度条件下培养得到的pMSCs(除氧浓度外其它培养条件与本申请相同)进行如下生物学特性的比较测定。
1.人pMSCs的免疫表型鉴定
用直接免疫荧光法检测培养后得到的梭形细胞表型，细胞用异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗人CD29、CD44、CD105、Flk-1、CD31、CD34、CD45和HLA-DR抗体(上述抗体均购自BD公司)标记后进行流式检测，流式细胞仪为BD FACScan(BectonDickinson)。
用流式细胞仪测定细胞周期。细胞用80％的冷乙醇4℃固定1h，PBS洗2遍，0.5ml PBS重悬细胞，加RnaseA(100μg/ml)，37℃温浴30分钟。测定前加碘化丙锭(Sigma，5μg/ml)染色。以ModiFit软件(BectonDickinson)分析细胞周期。
表型结果显示，常规氧浓度和低氧浓度培养的pMSCs没有明显区别，扩增培养液中得到的梭形细胞的CD29、CD44、CD105和Flk-1的阳性率在95％以上，CD31、CD34、CD45和MHC II类分子的阳性率在5％以下(图1)。细胞周期测定结果表明：扩增培养液中得到的梭形细胞大部分处在G0/G1期，而处在G2-M期和S期的细胞比例很低(图2)。
2.pMSCs多向分化能力研究
取第10代常规氧浓度和低氧浓度培养的pMSCs，体外按常规方法分别向成骨、脂肪、内皮方向诱导分化，发现两种pMSCs的分化能力没有明显差别(图3-1、3-2、3-3)。
3.pMSCs增殖能力研究
分别取第10代常规氧浓度和低氧浓度培养的pMSCs，将细胞按5×103个细胞/孔接种在24孔板内，然后每隔24h消化3个孔，收集细胞，并用0.4％的胎盼兰计数活细胞，然后绘制生长曲线。结果显示：低氧浓度培养的pMSCs增殖较快，倍增时间约为26小时；常规氧浓度pMSCs倍增时间约为30小时，差异有统计学意义(t检验，p＜0.05)(图4)。
实施例3：研究对比本申请提供的新的培养基与常规培养基对人pMSCs细胞培养的结果
本申请优选的人pMSCs规模化制备所用的特定细胞培养基，包括细胞基础培养基、人血清、人血白蛋白、表皮生长因子(EGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)。将分离的pMSCs细胞分别培养在含有不同人血清浓度的上述培养基中，其中人血清终浓度为10ml/L、20ml/L、50ml/L和100ml/L，同时以终浓度为20ml/L的胎牛血清的常规培养基作为对照，在常规培养条件下培养细胞10个代次，对各个实验组以及对照组培养的pMSCs细胞进行检测，结果发现实验组培养的细胞的分化能力、生长速度、表型等生物学特性与对照组培养的细胞相当，也与本领域相关文献报道的胎牛血清培养间充质类干细胞的效果相似。(结果未出示)。
另外，申请人对分别含有不同浓度的人外周血血清培养基、不同浓度的人脐带血清培养基培养和标准的常规胎牛血清培养基对分离的pMSCs进行培养，并对分别获得的细胞的生物学特性进行了比较研究。其中人外周血血清、人脐带血清的浓度通过在不同血清浓度下对人pMSCs分化能力、生长速度、表型等进行综合比较，结果表明采用20ml/L的血清浓度可以获得最佳效果(表1)。
| 人血清浓度 | 分化能力 | 增殖速度 | 表型(Flk1+)比例 |
| 10ml/L | +++ | + | ++ |
| 20ml/L | ++++ | ++++ | ++++ |
| 50ml/L | ++ | ++ | +++ |
| 100ml/L | + | + | + |
表1：不同血清浓度下人pMSCs的特性比较(+号越多表示指标越高)
对采用20ml/L人血清浓度培养的人pMSCs获得如下研究结果：
1.人pMSCs的形态、免疫表型鉴定和细胞周期测定
将人pMSCs按前述方法分离后，分别置于20ml/L胎牛血清培养基、20ml/L人外周血血清培养基、20ml/L人脐带血清培养基三种不同的细胞培养(基)体系中传代培养，细胞培养至第3代时置显微镜下观察，细胞呈梭形，鱼群状排列。三种体系培养的细胞形态镜下无差异。并且在传到第7代后形态仍保持原有形态不变。(图5)
直接免疫荧光法检测培养后得到的梭形细胞表型，细胞用异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗人CD29、CD44、CD105、Flk-1、CD31、CD34、CD45和HLA-DR抗体(上述抗体均购自BD公司)标记后进行流式检测，流式细胞仪为BD FACScan(Becton Dickinson)。表型检测结果显示，20ml/L胎牛血清培养基、20ml/L外周血血清培养基和20ml/L脐带血清培养基培养的pMSCs没有明显区别。取培养至第3代得到的梭形细胞的作表型鉴定，CD29、CD44、CD105、MHC-1和Flk-1的阳性率在95％以上，CD31、CD33、CD34、CD45、CD117和MHC II类分子的阳性率在5％以下。传代到第7代的梭形细胞的作表型鉴定，CD29、CD44、MHC-I、CD105和Flk-1的阳性率在95％以上，CD31、CD33、CD34、CD45、CD117和MHC II类分子的阳性率在5％以下。与前述结果一致。(图6)
流式细胞仪测定细胞周期。细胞用80％的冷乙醇4℃固定1h，PBS洗2遍，0.5ml PBS重悬细胞，加RnaseA(100μg/ml)，37℃温浴30分钟。测定前加碘化丙锭(Sigma，5μg/ml)染色。以ModiFit软件(BectonDickinson)分析细胞周期。分别在第3代和第7代时作细胞周期测定。结果表明，三种培养基中得到的梭形细胞大部分处在G0/G1期，约占到85％以上，而处在G2-M期和S期的细胞比例很低。传代培养周期保持稳定。此结果说明，外周血血清、脐带血血清培养基与胎牛血清体系相比较，在较长时间培养过程中没有改变pMSCs的形态、免疫表型和细胞周期等基础生物学指标。三种细胞培养基中的pMSCs的细胞周期差异不明显，无统计学意义。(图7)
2.pMSCs多向分化能力研究
分别取三种培养基中培养至第3代和第7代的pMSCs，体外按常规方法分别向成骨、脂肪、内皮方向诱导分化，发现外周血血清、脐带血血清培养基的pMSCs的分化能力与胎牛血清体系的pMSCs的分化能力没有明显差别。(图8-1、图8-2、图8-3)
3.pMSCs在三种培养基中的生长曲线比较
分别取三种培养基中培养到第3代和第7代的pMSCs，将细胞按5×103个细胞/孔接种在24孔板内，然后每隔24小时消化3个孔，收集细胞，并用0.4％的胎盼兰计数活细胞，然后绘制生长曲线。结果显示：外周血血清培养基培养的pMSCs增殖较快，倍增时间约为28.5个小时；胎牛血清培养基培养的pMSCs倍增时间约为29.4个小时，脐带血清培养基的pMSCs倍增时间约为30个小时，三者差异相互比较无统计学意义。(图9)
实施例4：人pMSCs抑制肿瘤细胞增殖的应用
1.人pMSCs表达Nanog基因检测
通过本申请所述方法规模化制备出的人pMSCs特异表达Nanog、Dkk-1基因，通过RT-PCR方法检测，结果显示Nanog、Dkk-1基因表达呈阳性(图10)。
2.pMSCs对3种肿瘤细胞系增殖的抑制作用检测
用3H胸腺嘧啶(3H-thymidine，3H-TDR)掺入法检测肿瘤细胞增殖。经过30Gy照射的pMSCs按照1∶10的比例分别与3种人体血液病肿瘤细胞系(K562，HL60，MCF7)的细胞共培养。结果显示：经过与pMSCs的共培养，3种肿瘤细胞的增殖能力均相对于单独培养时下降，其中K562的增殖减少了77％，HL60的增殖减少了80％，MCF7减少了56％，差异有统计学意义(t检验，p＜0.05)(图11-1)。
3.pMSCs对k562细胞周期的抑制作用检测
用流式细胞仪检测k562细胞周期。经过30Gy照射的pMSCs按照1∶10的比例与k562共培养。结果显示：经过共培养的K562(图11-2，组2)与单独培养时(图11-2，组1)相比，位于G0/G1期的细胞比例(62.07±5.8％对45.23±6.9％，p＜0.05)明显增多。
为研究pMSCs对肿瘤细胞系k562增殖抑制作用的机制，利用transwell实验检测可溶性因子作用，利用中和抗体实验确定可溶性因子类别。结果显示：使用transwell后，经过共培养的K562(图11-2，组4)与单独培养时(图11-2，组1)相比，位于G0/G1期的细胞比例(63.65±8.43％对45.23±6.9％，p＜0.05)明显增多；但共培养时使用transwell和未使用transwell之间，k562细胞周期没有统计学差异(t检验，p＞0.05)。结果证明，pMSCs对k562细胞的抑制作用是通过分泌可溶性因子发挥的。pMSCs和K562共培养时加入Dkk中和抗体，可以使K562被抑制的细胞周期恢复为49.22±1.21％(图11-2，组3)，证明Dkk作为可溶性分泌因子发挥了作用。
4.Nanog、DKK-1基因分别被干扰后的pMSCs对K562细胞周期的抑制作用检测
用siRNA-逆转录病毒载体转染的方法特异性针对pMSCs的Nanog、DKK-1基因分别进行RNA干扰。利用Real-time RT-PCR和westrn blot检测转染干扰载体后细胞内的目的基因表达情况。Nanog基因被干扰后的pMSCs(SiN组)和DKK-1基因被干扰后的pMSCs(SiD组)，经过30Gy照射，按照1∶10的比例分别与k562共培养；对照组是转染阴性对照的干扰空载体的pMSCs(SiM组)，经过30Gy照射，按照1∶10的比例与k562共培养。结果显示：在RNA水平上，SiN组的pMSCs中nanog mRNA的水平较正常pMSCs下降72％(图11-3A)，SiD组的pMSCs中DKK1mRNA的水平较正常pMSCs下降78％(图11-3B)，差异有统计学意义(t检验，p＜0.05)；在蛋白水平上，实验组中Nanog，DKK-1表达水平均较正常的pMSCs和SiM组中的pMSCs明显降低(图11-3C)。因而可以确定干扰载体发挥了明显且稳定的下调基因作用。其中，在对Nanog基因干扰的pMSCs中Nanog基因表达下调的同时，DKK-1基因的表达也下调(图11-3B，C)，结果表明pMSCs中表达的Nanog作为一个转录因子可能参与了DKK-1基因的转录调节，进而影响其蛋白质的表达。
用流式细胞仪检测k562细胞周期。结果显示：SiD组与SiM组相比，位于G0/G1期的k562细胞比例(52.09±3.36对62.02±4.36，p＜0.05)减少；SiN组与SiM组相比，位于G0/G1期的k562细胞比例(46.32±4.77对62.02±4.36，p＜0.05)明显减少(图11-4)。Nanog、DKK-1基因被干扰后，pMSCs对肿瘤细胞周期的影响明显减弱。
5.pMSCs对K562中Wnt信号通路上β-catenin累积量的影响检测
Wnt信号通路激活可以使β-catenin在细胞内聚积，累积的β-catenin入核促进细胞迅速从G1期进入S期，从而促进肿瘤细胞增殖。用westrnblot方法检测k562细胞中β-catenin蛋白的累积量。用Nanog基因被干扰后的pMSCs和DKK-1基因被干扰后的pMSCs，经过30Gy照射，按照1∶10的比例分别与k562共培养；对照组是转染阴性对照的干扰空载体的pMSCs，经过30Gy照射，按照1∶10的比例与k562共培养以及单独培养的正常k562。
结果显示：k562和pMSCs共培养后细胞内β-catenin的累积量减少，但k562和Nanog或Dkk基因表达被干扰的pMSCs共培养后，k562细胞内β-catenin的累积量再次增加(图11-5)，表明pMSCs通过表达Nanog，Dkk基因抑制k562细胞内wnt通路。
6.pMSCs对K562中的细胞周期相关蛋白表达的影响检测
细胞周期从G1期进入S期的关键点上有很多重要的调控蛋白。用real-time RT-PCR方法检测与pMSCs共培养的k562细胞中细胞周期调控基因c-myc，CyclinD2和细胞周期抑制基因P21，P27的表达。Nanog基因被干扰后的pMSCs(SiN组)和DKK-1基因被干扰后的pMSCs(SiD组)，经过30Gy照射，按照1∶10的比例分别与k562共培养；对照组是转染阴性对照的干扰空载体的pMSCs(SiM组)，经过30Gy照射，按照1∶10的比例与k562共培养以及单独培养的正常k562。结果显示：SiM组与正常k562组相比，抑制基因P21，P27表达增加，调控基因c-myc，CyclinD2表达减少；SiN组和SiD组分别与SiM组相比，抑制基因P21，p27的表达减少(图11-6A，B)，调控基因c-myc，CyclinD2的表达增加(图11-6C，D)，表明pMSCs通过表达Nanog，Dkk基因抑制k562细胞增殖。
Claims (15)
1.一种用于培养来源于人成体组织的原始间充质干细胞pMSCs的培养基，包括细胞基础培养基和人血清，所述人血清的终浓度为10-30ml/L，其中所述来源于人成体组织的原始间充质干细胞pMSCs表达特异性细胞标志Flk1、Nanog，其中所述的人成体组织是骨髓。
2.根据权利要求1所述的培养基，所述人血清的终浓度为20ml/L。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其中所述的人血清为人外周或脐带血血清。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的培养基，进一步包括人血白蛋白、表皮生长因子EGF和血小板衍生生长因子PDGF，其中所述人血白蛋白的终浓度为5-20mg/ml，所述表皮生长因子的终浓度为1-100ng/ml，所述血小板衍生生长因子的终浓度为1-100ng/ml。
5.根据权利要求4所述的培养基，其中所述人血白蛋白的终浓度为5-10mg/ml，所述的表皮生长因子的终浓度为10-30ng/ml，所述血小板衍生生长因子的终浓度为10-30ng/ml。
6.根据权利要求5所述的培养基，其中所述人血白蛋白的终浓度为10mg/ml，所述的表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，所述血小板衍生生长因子的终浓度为10ng/ml。
7.一种体外培养来源于人成体组织的原始间充质干细胞pMSCs的方法，该方法包括以下步骤：
1)将人成体组织单个核细胞悬浮于如权利要求1-2中任一项所述的培养基中，为原代细胞悬浮液；
2)将该原代细胞悬浮液按1×106个细胞/ml的接种密度接种在含有如权利要求1-2中任一项所述的培养基的塑料培养皿中；按体积比计算，在1-5％O2浓度，5％的CO2浓度和37℃下，在饱和湿度培养箱中培养；反复贴壁培养3-4次，获得人成体组织的原始间充质干细胞，其中所述的人成体组织是骨髓。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的O2浓度为2％。
9.由权利要求7所述的方法获得的原始间充质干细胞，其免疫表型为Flk1阳性，且表达Nanog基因。
10.如权利要求9所述的原始间充质干细胞在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的用途。
11.一种抑制肿瘤细胞增殖的药物组合物，该药物组合物包含如权利要求9所述的原始间充质干细胞。
12.一种成体原始间充质干细胞培养物PEPSC，其保藏号为CGMCC No.2152，于2007年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，包括原始间充质干细胞。
13.根据权利要求12所述的成体原始间充质干细胞培养物PEPSC，其中所述的原始间充质干细胞的免疫表型为Flk1阳性，且表达Nanog基因。
14.如权利要求12或13所述的成体原始间充质干细胞培养物PEPSC在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的用途。
15.一种抑制肿瘤细胞增殖的药物组合物，该药物组合物包含如权利要求12或13所述的成体原始间充质干细胞培养物PEPSC。
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| WO2009030092A1 (en) | 2009-03-12 |
| WO2009030092A9 (zh) | 2010-04-22 |
| CN101821383A (zh) | 2010-09-01 |
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Denomination of invention: A culture medium, method, and obtained primitive mesenchymal stem cells for in vitro large-scale cultivation of human adult primitive mesenchymal stem cells and their application Effective date of registration: 20230822 Granted publication date: 20131218 Pledgee: Qingdao rural commercial bank Limited by Share Ltd. North Branch Pledgor: Micro energy Life Technology Group Co.,Ltd. Registration number: Y2023370010089 |
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