CN102188446A - 人成体干细胞在治疗恶性实体瘤中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人成体干细胞在治疗恶性实体瘤中的用途。具体而言，本发明涉及人成体干细胞在制备治疗恶性实体瘤的细胞制剂中的用途。发明人以人间充质干细胞和人造血干细胞分别与人食管癌细胞融合，并将融合细胞注入SCID/小鼠和裸鼠，融合细胞成瘤数明显减少，其体积也缩小。本发明提供的干细胞制剂可以显著抑制恶性实体瘤的生长。

Description

人成体干细胞在治疗恶性实体瘤中的用途

技术领域

本发明涉及干细胞治疗领域。具体而言，本发明涉及人成体干细胞在治疗恶性实体瘤中的用途。更具体而言，本发明涉及人成体干细胞，特别是人间充质干细胞和人造血干细胞在制备治疗恶性实体瘤的细胞制剂中的用途。

背景技术

21世纪社会在进步与发展，但人类仍受众多疾病折磨。因重大疾病，如心脑血管病、恶性肿瘤、创伤、衰老和遗传缺陷等所导致的组织器官缺损与功能障碍是人类难以攻克的医学难题。干细胞再生医学和干细胞治疗医学是新型的医学手段，为重大疾病的治疗、寿命的延长、生活质量的提高提供了一个新途径(Nichols et al.，1998；Pan et al.，2002；Pesce and Scholer，2000；Thomson et al.，1998)。干细胞及其治疗性克隆的迅速发展，将是人类历史上的第三次医学革命，即再生医学治疗途径。干细胞再生医学与治疗的发展不仅会带来医学史上的革命，也将与我国构建和谐社会的长远目标相符合，具有深远的科学意义与社会效益。

干细胞是一类具有自我更新能力、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。它们可以通过对称性分裂维持自身细胞群的数量，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而构成机体各种复杂的组织和器官。干细胞分为胚胎干细胞(ES细胞)与成体干细胞。ES细胞是人体各种组织细胞的起源。成体干细胞存在于成体的各种组织中，它们具有多向分化潜能，可以分化为某一组织的多种细胞。

干细胞的研究与应用几乎涉及了所有的生命科学和生物医药学领域，并将在细胞治疗、组织器官移植、基因治疗、新基因发掘与基因功能分析、发育生物学模型、新药开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响，因此，干细胞与再生医学研究成果将成为21世纪具有巨大潜力的新兴高科技产业之一，其研究水平正逐步成为衡量一个国家或地区科技发展水平与健康水平的重要标志之一。

肿瘤干细胞理论提出后，肿瘤治疗理念受到重要的影响，恶性肿瘤的治疗不仅仅以化疗，放疗和手术为主，也要探索以干细胞治疗恶性肿瘤。骨髓来源的细胞(Bone Marrow-Derived Cells，BMDCs)尤其是人造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell，HSCs)用于临床治疗重症再生障碍性贫血及重症放射病、急性白血病、慢性髓性白血病等血液病方面已取得了巨大成就。

二十世纪70年代，E.D.Thomas开创了异基因造血干细胞移植治疗白血病，并获得1990年诺贝尔奖，开创了干细胞治疗肿瘤的先河。

美国于2005年10月报道明尼苏达大学首次成功地应用人类胚胎干细胞杀死癌细胞。这项新的研究揭示出人类胚胎干细胞能够更好地靶向癌细胞。

人成体干细胞治疗恶性实体瘤尚未见报道。

因此，本领域需要可用于恶性实体瘤治疗的干细胞。

发明内容

根据上述需要，本发明人以人间充质干细胞和人造血干细胞分别与人食管癌细胞EC9706或KYSE150融合；并将融合细胞注入SCID/小鼠和裸鼠以观察成瘤情况。融合细胞成瘤数明显减少，其体积也缩小。结果表明：人间充质干细胞和人造血干细胞对人食管癌细胞EC9706或KYSE150有抑制作用，为恶性实体瘤的干细胞治疗提供了理论基础，并开创了恶性肿瘤治疗的新途径。

因此，本发明的一个方面涉及人成体干细胞在制备治疗恶性实体瘤的细胞制剂中的用途。本发明的人成体干细胞可通过作为药物组合物的细胞制剂的形式提供给患有恶性实体瘤的患者。

优选地，本发明所述的人成体干细胞为人间充质干细胞或人造血干细胞。

优选地，本发明提供的含有人成体干细胞的细胞制剂用于治疗的恶性实体瘤为人食管癌。

优选地，本发明提供含有人间充质干细胞或人造血干细胞的细胞制剂用于治疗人食管癌。

本发明提供的细胞制剂可通过移植给予受治疗者。为通过移植给予受治疗者，细胞制剂中需要加入适合于移植的本领域技术人员已知的其他成分，例如植入后可降解的的生物材料。

本发明提供的细胞制剂可通过静脉输注给予受治疗者。为通过静脉输注给予受治疗者，细胞制剂中需要加入适合于静脉输注的本领域技术人员已知的其他成分。

本发明的细胞制剂还可以包括本领域公知的其他成分，如适合患者接纳的材料或基质，该基质可作为细胞移植用的三维模板，具有特定的孔径，例如申请日为2004年6月7日的中国发明专利号为200480019202.5，授权公告号为CN100447186C的发明专利中所描述的基质。还可以包括生物可降解聚合物如白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白、明胶等，并制作成治疗用途的试剂盒的形式。

本发明所述的细胞制剂可以是非冻存的细胞制剂或冻存的细胞制剂。如本领域技术人员所知，干细胞移植必须保存足够量的干细胞，保存在一定条件下，等移植需要时，再将保存的干细胞回输到体内，达到治疗的目的。根据保存的方法不同，可分为非冻存保存或冻存保存。非冻存保存为零上温度保存如4℃保存，优点是不需要冷冻设备，不需要在细胞悬液中添加冷冻防护剂，也不需要输用前解冻。缺点是保存时间受限。冻存保存为零下温度保存如-79℃的冷冻保存(-80℃保存)或深低温保存(-196℃)。零下温度时细胞代谢和各种酶的活性几乎停止，细胞保存的时间可以延长，细胞保存温度越低，细胞活性保存越好。细胞若深低温保存之前，必须先控速降温。制备非冻存的细胞制剂或冻存的细胞制剂的方法和设备都是本领域已知的。

在进行冷冻保存时，需要添加冷冻保存剂，以保护细胞免受冷冻损伤。如本领域技术人员所知，可以使用的冷冻保存剂包括能渗透到细胞内部的甘油、二甲基亚砜、丙二醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、乙醇等，也可以使用非渗透性保存剂如白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、右旋糖酐、乳糖蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖。本领域技术人员可以根据现有技术知识同时选用渗透性保存剂和非渗透性保存剂中的一种或几种组合使用。

本发明的细胞制剂满足本领域技术标准，例如符合国家食品药品监督管理局《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》等相关标准。

附图说明

图1：CD90和CD106在各细胞的表达。

其中FC1两者阳性率为28.8％，FC2两者阳性率为74.9％，FC3两者阳性率为44.4％。

图2：显示CK18在各细胞的表达。

CK18在hMSCs为阴性表达外，其余均为阳性表达。

图3：DNA含量分析。

hMSC以鸡血为内参进行DNA含量检测，EC9706、FC1、FC2和FC3以正常人淋巴细胞为内参进行检测，MSC为2n，其余均为6n。

图4：软琼脂克隆形成。

A所示软琼脂试验克隆形成试验所成克隆，发明人每孔做两个副孔，图中只取一个。

B中的EC9706为食管癌细胞克隆形成多，FC1、FC2、FC3为融会细胞，肿瘤克隆形成少。对形成的克隆计数后进行统计分析的结果，差异具有显著性(P＜0.01)。

图5：免疫缺陷鼠皮下成瘤。

A显示各组细胞成瘤大体情况，各组成瘤外观一致，未见红色肉瘤样外观；FC组成瘤体积明显小于EC0706组，FC1组有2只成瘤，FC2组有4只成瘤。

B所示为成瘤病理切片分析结果，各组成瘤性质一致，均为鳞状上皮癌，实质与间质分界清楚，肿瘤细胞成巢状分布。

C中显示了EC9706和FC3组成瘤重量的差异性，统计学分析具有显著性(P＜0.01)，由于FC1组与FC2组瘤重量较小，所以发明人只对EC9706和FC3组进行了对比。

图6：hMSCs与KYSE150融合后，裸鼠成瘤的时间。

KYSE150为食管癌细胞，肿瘤成长早；hMSCs为间充质干细胞未发现肿瘤生长；FC为融合细胞的不同组，肿瘤生长晚。

图7：hMSCs与KYSE150融合后，各组肿瘤生长情况。

图8：hMSCs与KYSE150融合后肿瘤重量的变化。

KYSE150为食管癌细胞，肿瘤重量最重；hMSCs为间充质干细胞未发现肿瘤生长；FC为融合细胞的不同组，肿瘤生长小，重量轻。

图9：造血干细胞与EC9706细胞融合后，各组肿瘤生长情况。

图10显示融合细胞与非融合细胞成瘤比较。

图11显示肿瘤重量，细胞融合方法详见方法描述。

图12：全基因组cDNA微阵列(microarray)聚类分析。

红色表示该基因表达上调，绿色表示该基因表达下调，颜色深浅表示基因表达强度。

图13：总RNA电泳检测。

图中显示了消化纯化后的电泳结果，可以看出用于逆转录反应的总RNA质量还可以，可以进行后续试验。

图14：总RNA消化基因组DNA效果验证。

图中1～5分别以9706、MSC、FC1、FC2和FC3样品的消化后总RNA为模板普通PCR扩增GAPDH基因；+为阳性对照，NC为阴性对照。标记(Marker，M)：TaKaRa DL2000 plus，条带大小(从下往上100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，3000bp，5000bp)。从图中可以看出用于逆转录的RNA已经把基因组DNA消化完全。

实时(RealTime)PCR反应特异性检测：

图15：实时(RealTime)RT-PCR产物电泳检测。

图中1～5分别以9706、MSC、FC1、FC2和FC3样品的1st-cDNA为模板，实时PCR扩增GAPDH基因；6～10分别以9706、MSC、FC1、FC2和FC3样品的1st-cDNA为模板，实时PCR扩增NM_001946基因。标记(Marker，M)：TaKaRa DL2000plus，条带大小(从下往上100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，3000bp，5000bp)。从电泳图结果可以看出实时PCR反应特异性都很好。

图16：实时(realtime)-PCR检测DUSP6/MKP3变化。

A所示为GAPDH和DUSP6的溶解曲线和扩增曲线。

B为DUSP6相对于内参的表达丰度。

从图中可以看出，DUSP6在FC中较EC9706和MSC明显高表达，统计学分析表明差异具有显著性(P＜0.01)。附注：9706为食管癌细胞。MSC为间充质干细胞。FC1，FC2，FC3分别为克隆1，2，3。

图17：细胞周期变化。

图中可见FCG0/G1期细胞明显增加，统计学分析差异具有显著性(P＜0.01)。

图18：增殖指数变化。

图中表明FC细胞的增殖指数较EC9706明显降低，统计学分析差异具有显著性(P＜0.01)。

图19：裸鼠尾静脉注射hMSCs细胞能趋向肿瘤细胞。

图20：hMSCs与EC9706和Kyse150融合的结果与机理。

图21：hMSCs进入人机体的途径和作用机理图。

具体实施方式

(一)人成体干细胞与肿瘤细胞融合技术：

1)细胞融合技术(Robinson，1979)。

A.0.125％胰酶消化细胞EC9706细胞和hMSCs细胞，制备成单个细胞悬液，

B.计数，hMSCs∶EC9706＝1∶10混合于锥形离心管中，PBS洗，1000rpm，10分钟，三次；

C.弃上清，用H-DMEM重悬细胞，1000rpm，10分钟；

D.小心吸取上清后，轻弹、旋转并摇动，使细胞充分分散成糊状，置于37℃水浴锅内；

E.边摇边加入37℃预温的50％无菌PEG1500 1ml，在1分钟内滴完

a)37℃水浴90秒，期间轻轻摇动离心管；

b)轻轻滴加10ml 37℃预温的H-DMEM 10ml以终止PEG的作用，并在3分钟内滴完，滴加时尽可能不搅散细胞；

c)1000rp，10分钟，吸弃上清；将细胞接种在3个10cm一次性平皿内，37℃恒温、恒湿培养。

2)融合细胞克隆的挑选与鉴定技术。

3)流式细胞仪检测活细胞表面标记。

4)软琼脂集落形成技术。

5)免疫缺陷鼠移植瘤技术。

2.人成体干细胞趋向肿瘤细胞技术：

人成体干细胞治疗恶性实体瘤需要解决给药途径问题。人成体干细胞静脉移植后，人成体干细胞是否趋向肿瘤组织(靶向性)是人成体干细胞治疗恶性实体瘤的关键。

1)荧光标记人成体干细胞的技术。

2)小动物活体成像技术。

(二)研究结果：

1.融合细胞的筛选鉴定：

1)流式细胞仪分选：hMSCs是一种间质来源的干细胞，通常它需要通过多种标记来鉴定，而且不同的研究人员可能采取的标记也不尽相同，通常使用的标记有如下几种：

阳性标记：CD13，CD29，CD44，CD54，CD73，CD90，CD105，CD106

阴性标记：CD14，CD31，CD33，CD34，CD36，CD45，CD133

发明人在对人脐带源hMSCs进行各标记检测后，选择了表达强度较高的CD90和CD106作为实验用检测标记。经过PEG1500诱导hMSCs和EC9706融合后，将得到的含有hMSCs、EC9706和融合细胞的混合细胞在hMSCs培养基中培养，以确保hMSCs标记的不丢失。培养3天后，0.125％胰酶消化，PBS清洗，CD90染色后上流式细胞仪分选。得到的CD90⁺细胞继续在hMSCs培养基中培养。

2)融合细胞克隆的挑选：发明人对培养的CD90⁺细胞并以10³/皿的密度均匀分散后接种在d＝10cm的一次性培养皿中，10天后在显微镜下根据形态挑选克隆。发明人挑选了90个克隆，分别培养在12孔板中，当细胞数量达到实验所需数量时开始对各克隆进行验证。

3)hMSCs表面标记检测：来源于hMSCs和EC9706的融合细胞，在早期理论上应该同时含有hMSCs和EC9706的特征分子。因此，发明人在得到克隆后选取了CD90和CD106两个标记作为鉴定hMSCs特征的指标，对挑选的每一个克隆进行了上述两个标记的检测(图1)。

4)上皮特征的检测：由于EC9706为上皮源性肿瘤细胞，因此，它应该表达一定的细胞角蛋白(CK)分子。发明人对EC9706进行了一系列CK分子的免疫荧光的检测，最终选择了表达强度较高的CK18作为鉴定EC9706特征的标记。CK18阳性染色为绿色荧光(图2)。

5)细胞DNA含量分析：为了进一步确定发明人得到的克隆，发明人对所挑选的克隆进行了DNA含量的检测，正常hMSCsDNA含量为2n，而EC9706的DNA含量为4n，得到的融合细胞DNA含量应该在6n、小于6n或大于6n(如图3)。

在经过以上五步的筛选，发明人最终挑选出3个CD90⁺、CD106⁺、CK18⁺且染色体为6n的克隆，并用这三个克隆进行后续试验。

2.hMSC与HSC对EC9706和KYSE150细胞成瘤的抑制作用：

1)hMSC对EC9706细胞成瘤的抑制作用：发明人从hMSCs对实体瘤治疗这一目的出发，进行了细胞融合实验。而评价治疗肿瘤疗效在细胞水平的重要实验通常是对肿瘤细胞成瘤能力的检测。如果hMSCs对食管癌具有治疗作用，则融合细胞的成瘤能力必然发生变化。因此发明人首先从增殖能力的检测进行了一系列实验。通常检测肿瘤细胞增殖的实验有软琼脂集落形成和裸鼠成瘤实验。a.软琼脂集落形成：软琼脂集落形成实验是反映非锚着依赖性生长的细胞的单个细胞增殖能力的有效方法之一，由于它与体内成瘤实验具有很好的一致性，因此在肿瘤学的实验中被广泛采用。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆细胞形成率差别也很大，一般原代培养细胞克隆形成率弱，稳定传代的细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，到基本形成克隆时终止培养。发明人用软琼脂集落形成实验在体外检测融合细胞的克隆形成能力，3周后，用染料染色观察，EC9706和融合细胞均形成了克隆。融合细胞形成的克隆与EC9706相比，形成的克隆数量少，而且体积也小，克隆形成率明显小于EC9706组，差异具有统计学意义(P＜0.01)(图4)。差异有显著性，表明细胞融合对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。

2)hMSCs与EC9706融合在免疫缺陷鼠皮下成瘤：在软琼脂集落形成试验的基础上，发明人又进行了hMSCs与EC9706融合后对免疫缺陷鼠移植瘤生长的影响。在4周龄雌性SCID鼠左腋窝皮下以5×10⁵/只的数量级接种细胞，每组6只SCID鼠。EC9706在第8天就可在皮下触及粟粒大小肿块，而融合细胞只有FC3在15天时才可触及粟粒大小的肿块，FC1、FC2组在27天时才可触及肿块。接种后5周，引颈处死SCID小鼠。取出成瘤，称重，EC9706组肿瘤重量明显比融合细胞组大，且6只全部成瘤，而融合细胞中FC1只有2只成瘤，FC2组只有4只成瘤，FC3有6只成瘤(表1)。由于FC1和FC2所成肿瘤较小，肉眼就有极显著的差异，因此发明人只对FC3与EC9706组进行了统计学分析。EC9706与FC3相比差异具有显著性(P＜0.01)。瘤组织经10％甲醛固定后，石蜡包埋，HE染色病理分析表明，瘤组织为鳞状上皮癌，癌细胞呈巢状分布，实质与间质分界清楚。

表1：EC9706和FC细胞接种裸鼠后的成瘤重量

细胞	小鼠数量	肿瘤数量	肿瘤重量(M±SD，g)
				EC9706	6	6	1.29±0.35
FC1	6	2	0.03±0.01
				FC2	6	4	0.03±0.01
FC3	6	6	0.31±0.12

3)hMSCs与KYSE150融合在裸鼠皮下成瘤：在hMSCs与EC9706融合后对免疫缺陷鼠移植瘤生长受到抑制的基础上。发明人又进行了hMSCs与KYSE150融合，并在4周龄雌性裸鼠左腋窝皮下以5×10⁵/只的数量级接种细胞，每组6只裸鼠。KYSE150细胞在数天后就可在皮下触及粟粒大小肿块，后来逐渐长大(图6)。hMSCs细胞接种直到实验也未长肿瘤。融合细胞FC1、FC2，FC3接种裸鼠后，有些裸鼠不长肿瘤(图7，表2)。

表2hMSCs与KYSE150融合后肿瘤的重量与体积

组别	小鼠数量	肿瘤数量	重量	体积	P
						KYSE150	6	6	175.65±88.37	329.51±160.03
hMSC	7	0	0	0	＜0.01
						FC1.21	6	2	37.85±31.32	58.53±43.47	＜0.01
FC1.25	6	5	21.42±4.37	26.60±4.09	＜0.01
						FC1.32	6	6	58.4±32.19	68.17±48.52	＜0.01

2)人造血干细胞(hHSC)对EC9706细胞成瘤的抑制作用：

造血干细胞治疗白血病已有报道，但造血干细胞治疗实体肿瘤尚未见报道。发明人以hHSC与EC9706细胞融合，通过基因重编程，达到抑制肿瘤生长，二次实验结果表明：hHSC与EC9706细胞融合，hHSC能抑制EC9706细胞在裸鼠体内生长(图9，10，11，表3)。

表3裸鼠体内成瘤的肿瘤重量

3.hMSCs对EC9706成瘤抑制作用机理：

经过软琼脂集落形成和免疫缺陷鼠皮下成瘤实验，发明人初步确定hMSCs与EC9706融合后对EC9706的成瘤能力产生了显著的抑制作用，这些结果提示：hMSCs可以作为一种治疗性细胞应用于食管癌的治疗中。但这种作用的机理究竟是什么发明人还不清楚，因此，发明人继续探索研究hMSCs对EC9706成瘤抑制作用机理。

1)实时(realtime)-PCR对DUSP6/MKP3变化的验证：

前期的实验结果表明hMSCs对EC9706成瘤具有了明显的抑制作用。因此，发明人将目光放在了对细胞增殖起抑制作用的分子上。MAPK(Mitogen-activated protein kinase)途径对细胞的增殖和分化具有重要的作用，而ERK(extracellular signal-regulated kinases)这个分子又在MAPK途径中具有重要的地位，其上游分子为ras。因此，如果ERK受到抑制，则可影响MAPK途径，进而影响细胞的增殖和分化。

发明人对全基因组cDNA微阵列结果进行了分析，从差异基因中发明人发现DUSP6/MKP3(dual specificity phosphatase 6 orMitogen-activated protein kinase phosphatase 3)这个在MAPK途径中起抑制作用的分子明显较两亲本细胞增加，DUSP6/MKP3在MAPK途径中主要作用于ERK而发挥作用，因此DUSP6/MKP3可能在融合细胞中发挥重要的作用，DUSP6/MKP3的表达变化可能在融合细胞增殖能力变化中具有重要的作用。结合体内外细胞增殖相关实验，DUSP6/MKP3可能对融合细胞增殖能力的下降具有重要作用。而cDNA微阵列有一个重要的缺陷是存在一定的假阳性率。因此，发明人对DUSP6/MKP3进行了实时PCR验证。结果(如图18)与芯片结果一致，DUSP6/MKP3在三个融合克隆中特异性表达增强，而在EC9706和hMSCs中则表达较低。

通过下面的公式计算出表达差异情况，

$\mathrm{ratio}=\frac{{\left(E_{t\arg \mathrm{et}}\right)}^{{\mathrm{\ΔCP}}_{t\arg \mathrm{et}}(\mathrm{control}-\mathrm{sample})}}{{\left(E_{\mathrm{ref}}\right)}^{{\mathrm{\ΔCP}}_{\mathrm{ref}}(\mathrm{control}-\mathrm{sample})}}$

E为实时RT-PCR反应的扩增效率；“ref”是校准基因，一般用表达丰度在不同样品中都相对稳定的看家基因；“target”是靶基因；ΔCP(control-sample)是对照样品的CP值减去检测样品的CP值得到的差值。与GAPDH相比得出目的基因相对表达丰度。

A对总RNA质量的检测：

在进行实时PCR前，要首先对所提RNA质量进行检测，只有RNA质量较高时才可进行后续试验。

2)细胞周期分析：

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，指从细胞分裂结束开始，到下一次细胞分裂结束为止的过程。DNA合成和细胞分裂是细胞周期的两个主要事件。在进化过程中，细胞发展并建立了一系列的调控机制，以确保细胞周期严格有序地交替和各时相依次有序变更。

发明人用流式细胞仪检测了EC9706和融合细胞的细胞周期(图6)。结果融合细胞与EC9706相比，G0/G1期细胞数量增加，S期和G2/M期细胞数量减少，差异具有统计学意义。说明细胞融合后，发生了G1/S期阻滞，抑制细胞周期运行，细胞增殖指数降低(图11)，使EC9706细胞增殖缓慢，促使细胞成瘤能力降低。

细胞增殖指数是指处于S期(DNA合成期)和G2/M期(RNA合成期)细胞之和占总细胞数的比例，它反映该群细胞的增殖速度。发明人在流式细胞计数仪测量细胞周期的基础上，分析后获得了细胞增殖指数(图18)。

4.人成体干细胞趋向肿瘤细胞的实验：

发明人将食管癌细胞(Kyse细胞系)接种到裸鼠腋下，待肿瘤长到直径约1厘米，从尾静脉注入蛋白荧光标记的人间充质干细胞(hMSCs)，分别在30、40、与50分钟，观察hMSCs趋向肿瘤细胞的情况。结果表明：在尾静脉注入蛋白荧光标记的人间充质干细胞30分钟后，就观察到蛋白荧光标记的人间充质干细胞达到Kyse细胞接种到裸鼠腋下而生长的肿瘤处(图19)，证明hMSCs能趋向肿瘤细胞，为hMSCs移植治疗肿瘤提供理论与实验依据。

(三)成体干细胞治疗恶性肿瘤的可行性分析：

1.成体干细胞治疗人食管癌的可能性：

hMSCs分别与食管癌细胞EC9706和Kyse150融合，hMSCs与食管癌细胞EC9706的融合比例为1比10，hMSCs与食管癌细胞Kyse150的融合比例为1比5。结果表明：hMSCs分别与食管癌细胞EC9706和Kyse150融合的细胞，分别在免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)与裸鼠体内成瘤明显降低。此外，人造血干细胞与食管癌细胞EC9706融合，融合的细胞在免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)体内成瘤也受到明显的抑制，提示hMSCs与人造血干细胞将能应用于临床治疗肿瘤的可能性。

发明人用hMSCs与人造血干细胞治疗肿瘤的方法与理论见图20。

2.hMSCs趋向肿瘤组织：

人体内存在细胞与细胞融合，发明人的实验证明：hMSCs与人造血干细胞与食管癌细胞融合，肿瘤生长受到明显抑制，这从理论上阐述了hMSCs与人造血干细胞能抑制肿瘤生长。进一步解决治疗途径问题，干细胞治疗人类疾病往往采用局部移植与血液输入。动物活体成像研究，发现血液输入hMSCs，hMSCs即趋向肿瘤(图19)。发明人探索血液输入hMSCs，1x10⁷hMSCs/5ul加入invitrogen公司细胞膜荧光染料DID，37℃培养箱中孵育30min，每隔5分钟充分振摇，加入10ml培养基1000rpm离心5mim，计数即可。小动物活体成象方法，每只裸鼠尾静脉注射1x10⁶hMSCs.裸鼠麻醉后，以IVIS Caliper活体成像仪观察与照相(见图19)。实验证明：hMSCs能趋向肿瘤细胞，为hMSCs移植治疗肿瘤方法提供实验依据与理论。

3.干细胞已用于临床疾病治疗：

干细胞用于再生医学和临床疾病治疗已有很多文献报道。最近，美国迈阿密大学研究人员在《美国心脏病学会杂志》上发表研究成果，他们的临床研究以随机，双盲和安慰剂对照的方法，对53例急性心肌梗塞病人用成人骨髓中提取的间质干细胞注射进发生心肌梗塞不到10天的患者体内。给发生心肌梗塞患者注射的间质干细胞液含有2.5X10⁶hMSCs/ml，1.9％人血清白蛋白和3.8％二甲基亚砜。安慰剂对照的人注射1.9％人血清白蛋白和3.8％二甲基亚砜。hMSCs必需检查细胞表面标志物，如CD105和CD166，无CD45。对hMSCs的无菌性，均一性，稳定性，毒性，免疫性进行检测，并排除染色体的异常。70％hMSCs必需存活。这些间质干细胞随着静脉血流进入心脏，并最终到达受损部位，会清除受损区域的受伤组织，从而提高心肌的搏动能力。间质干细胞还能在一定程度上促进新的心肌组织生长。hMSCs进入人机体的途径和作用机理见图19、图20。

4.hMSCs的产品：

2009年1月，美国最大的干细胞公司Osiris宣布，骨髓间充质干细胞(Prochymal)成为世界上第一个获准的干细胞治疗产品，

发明人实验研究中所用的hMSCs是中国医学科学院干细胞研究中心供给的，hMSCs是从人脐带血中分离的，他们已向我国有关部门申报干细胞治疗产品。今后，发明人合作将hMSCs用于临床。

(四)小结：

干细胞的研究与应用几乎涉及了所有的生命科学和生物医药学领域，并将在细胞治疗、组织器官移植、基因治疗、新药开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响，因此，干细胞再生医学和干细胞治疗医学是新型的医学手段。二十世纪70年代，E.D.Thomas开创了异基因造血干细胞移植治疗白血病，这是开创了干细胞治疗肿瘤的先河。美国于2005年10月报道明尼苏达大学首次成功地应用人类胚胎干细胞杀死癌细胞。这项新的研究揭示出人类胚胎干细胞能够更好地靶向癌细胞。

人成体干细胞治疗恶性实体瘤尚未见报道。通过基因重编程机制，发明人以人间充质干细胞和人造血干细胞分别与人食管癌细胞EC9706或KYSE150融合；并将融合细胞注入SCID/小鼠(免疫缺陷鼠)和裸鼠以观察成瘤情况。融合细胞成瘤数明显减少，其体积也缩小。芯片分析发现抑癌基因Dusp6基因表达上调，抑制SCID/小鼠(免疫缺陷鼠)和裸鼠成瘤。小鼠活体成像证明人间充质干细胞有趋向肿瘤组织的特性。结果表明：人间充质干细胞和人造血干细胞对人食管癌细胞EC9706或KYSE150有抑制作用，为恶性实体瘤的干细胞治疗提供了理论基础，并开创了恶性肿瘤治疗的新途径。

Claims (9)

1.人成体干细胞在制备治疗恶性实体瘤的细胞制剂中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的人成体干细胞为人间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述的人成体干细胞为人造血干细胞。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述的恶性实体瘤为人食管癌。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的用途，其中所述的细胞制剂通过移植给予受治疗者。

6.根据权利要求1-4中任意一项所述的用途，其中所述的细胞制剂通过静脉输注给予受治疗者。

7.根据权利要求1-4中任意一项所述的用途，其中所述的细胞制剂包括非冻存的细胞制剂和冻存的细胞制剂。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述的冻存的细胞制剂包含冷冻保存剂。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述的冷冻保存剂包括甘油、二甲基亚砜、丙二醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、乙醇、白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、右旋糖酐、乳糖蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖。

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