CN108060132A

CN108060132A - 一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3d共培养模型

Info

Publication number: CN108060132A
Application number: CN201610985876.5A
Authority: CN
Inventors: 党永军; 杨宸; 李增霞; 倪晓凌; 崔照盟; 高强; 王嘉琦
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2016-11-09
Filing date: 2016-11-09
Publication date: 2018-05-22

Abstract

本发明属生物医学领域，涉及一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3D共培养模型。本发明将肿瘤细胞使用绿色荧光蛋白标记，肿瘤相关成纤维细胞使用红色荧光蛋白标记，将两种细胞通过使用制备的甲基纤维素凝胶培养基构建3D共培养模型。本发明制备的3D模型模拟了体内肿瘤的缺氧环境，并通过将肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞共培养构建了体内肿瘤微环境内两种细胞之间相互促进的效果本发明的肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞构成的3D共培养模型不仅模拟了体内肿瘤缺氧的环境，提供了与体内肿瘤微环境类似效果，具有基础研究以及临床药物应用前景。

Description

一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3D共培养模型

技术领域

本发明属生物医学领域，涉及一种新型3D共培养模型及其构建方法，具体涉及一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3D共培养模型，该3D共培养模型可用于基础研究以及建立体外药物筛选模型。

背景技术

据报道，逐步增加的癌症发病率和死亡率，已经成为了导致中国人死亡的主要原因，严重威胁中国人的健康。近年来，随着手术技术的逐步进步以及规范化标准化的放化疗的应用，癌症的临床治疗水平已经有了较大的进步，但是例如胰腺癌，非小细胞型肺癌等癌症的五年生存率并没有得到有效的提高。其原因主要是因为临床化疗药物的疗效非常有限。许多临床药物在基础研究阶段均显现出具有强大的体外抑制肿瘤细胞的效果，但是进入临床在作用于病人体内肿瘤时无法发挥出类似的疗效。例如临床治疗晚期胰腺癌的一线药物吉西他滨，在常规二维细胞培养时对胰腺癌细胞系Capan-1，BxPC-3，Panc-1等的IC50均在100nM以下，但是当应用于晚期胰腺癌病人显现出只能部分延缓肿瘤的进展，其中大部分患者只有6个月的中位生存期。类似的情况在肿瘤新药的研发中并不少见，增加了肿瘤患者的经济负担以及生存质量的降低。

研究实践显示，造成药物在基础研究和临床患者效果不一致的原因较多，其中最重要的一点就是现有的常规细胞培养，即2D细胞培养技术培养的细胞和体内肿瘤的微环境不一致。究其原因，体内肿瘤由于增殖迅速，新生血管供血供氧跟不上肿瘤的增殖从而会导致肿瘤部分区域缺氧，继而坏死；同时，体内肿瘤是一个立体的结构，肿瘤的氧气，营养物质离血管越近供应越充足，越远离血管的肿瘤组织则会出现相应的缺氧坏死，而药物在肿瘤组织内的分布梯度也与距离血管的距离有关。目前的研究中的药物筛选模型大部分使用常规细胞培养技术，这种方法使细胞贴壁于组织处理过的培养皿的表面，成为单层贴壁生长，但是由于其不存在体内肿瘤的氧气，营养的梯度从而难以模拟肿瘤的微环境。在2D细胞培养系统，药物直接作用于所有的贴壁细胞，不符合体内肿瘤作为一个立体结构的特点。

药物筛选获得的药物和临床肿瘤患者的疗效不一致还有一个重要原因，那就是以往的药物设计思路大部分均为抑制肿瘤细胞增殖，但是真实的肿瘤微环境内不只有肿瘤细胞。肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)是肿瘤微环境内最重要的非癌组分，近年其和肿瘤细胞的密切关系获得研究者们越来越多的关注。肿瘤细胞可以促进肿瘤相关成纤维细胞的活化，肿瘤相关成纤维细胞可以分泌TGF-β，IL-6，FGF-2等生长因子促进肿瘤细胞的生长，增殖，迁移，同时肿瘤相关成纤维细胞可以发挥屏障的作用使化疗药物的作用降低。两种细胞的这种相互促进作用使得肿瘤细胞难以被化疗药物清除。

3D细胞培养模型是一种体外培养肿瘤细胞使其成为类似于体内的立体结构的一种新型培养模型，逐步受到研究者的重视。3D培养常规2D培养的优势主要在于以下几点：首先，3D细胞培养模型可以形成立体的结构，模拟体内肿瘤的立体结构，同时模拟前文所述的肿瘤内氧气，营养物质的梯度以及缺氧环境；其次，3D细胞培养模型不会有常规2D细胞培养中存在的细胞接触抑制效应，从而更加符合体内肿瘤的生长模型；最后，3D细胞培养模型内的肿瘤细胞分泌的多种细胞因子在体外培养的肿瘤细胞团内可以自由交流，从而模拟体内肿瘤的微环境。由于3D细胞培养模型的种种优势，目前已经开发出了许多不同类型的3D细胞培养模型，如悬滴法(hanging drop)、琼脂-液体覆盖法(soft agar-liquid overlay)、3D多孔支架(porous 3-D scaffold)等。3D细胞培养模型也被越来越多地应用于基础研究，高通量药物筛选等。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种新型3D共培养模型及其构建方法，通过将肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞共同3D培养，可以更加模拟体内肿瘤的微环境。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞构成的3D共培养模型，从而达到克服常规2D细胞培养难以模拟体内肿瘤的立体结构以及缺氧和代谢梯度的特性，同时通过将肿瘤细胞(人胰腺癌细胞系Capan-1)和肿瘤相关成纤维细胞(人原代胰腺星状细胞)共培养更好地模拟肿瘤微环境。

本发明是按照以下技术方案实现的：

基于甲基纤维素的3D细胞共培养方法：

使用Heuchel，Stabenfeldt报道的基于甲基纤维素的3D细胞培养方法；其中，3D细胞培养基的成分为含有10％的胎牛血清，0.24％的甲基纤维素的DMEM/F12培养基，将细胞消化后，含有2500个细胞的100μL3D细胞培养基加入未经过组织处理的96孔圆底板，细胞即刻开始自发聚集，三天后形成致密的球状立体结构。

本发明中，将肿瘤细胞使用绿色荧光蛋白标记，肿瘤相关成纤维细胞使用红色荧光蛋白标记，将两种细胞通过使用制备的甲基纤维素凝胶培养基构建3D共培养模型。

本发明中，构建的3D模型能模拟体内肿瘤的缺氧环境，并通过将肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞共培养构建了体内肿瘤微环境内两种细胞之间相互促进的效果。

本发明中，通过药物筛选得到的对肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞均有增殖抑制效果的药物，选择性抑制肿瘤细胞的药物以及选择性抑制肿瘤相关成纤维细胞的药物，将其加入3D共培养体系内，可明确所构建的3D共培养模型能应用于药物研究。

本发明提供了一种肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞构成的3D共培养模型的构建方法，其包括：

将人胰腺癌细胞系Capan-1用含10％胎牛血清的DMEM培养基置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。人原代胰腺星状细胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；将Capan-1细胞系用绿色荧光蛋白GFP病毒侵染标记，将胰腺星状细胞用红色荧光蛋白RFP标记，分别检测两种细胞的侵染效率；取对数生长期的细胞，将含有1250个Capan-1细胞和1250个胰腺星状细胞的100μL3D细胞培养基加入未组织处理的96孔圆底板；后续进行缺氧微环境的检测，两种细胞共培养的荧光状态。结合前期筛选出的一种对肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞均有增殖抑制效果的药物、一种选择性抑制肿瘤细胞的药物以及一种选择性抑制肿瘤相关成纤维细胞的药物，将其加入3D共培养体系内，结果证实，本发明的3D共培养模型可应用于药物研究。本发明的肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞构成的3D共培养模型不仅模拟了体内肿瘤缺氧的环境，而且提供了与体内肿瘤微环境类似效果，具有基础研究以及临床药物应用前景；

尤其是，本发明的构建方法成本低廉，与常规二维细胞培养不同之处需使用甲基纤维素与未组织处理的96孔圆底板，成3D立体结构快速，稳定，结合对两种细胞的染色直观观测使本方法可应用于基础研究以及大规模药物筛选。

附图说明

图1为原代胰腺星状细胞呈现出梭形或星形形态(10×10)。

图2为胰腺星状细胞活化标志物α-SMA染色(10×40)。

图3为常规二维细胞培养条件下的胰腺癌细胞系Capan-1细胞(10×10)和3D细胞培养条件的胰腺癌细胞系Capan-1细胞低氧环境比较(10×4)。

图4为胰腺癌Capan-1细胞(10×40)和胰腺星状细胞的病毒侵染效率(10×10)。

图5为两种细胞共培养时的3D形态结构(10×10)。

图6为加入1μM对两种细胞均有抑制作用的抑制剂后对3D共培养结构的影响(10×10)。

图7为加入6μM对胰腺癌细胞Capan-1有选择性的抑制剂后对3D共培养结构的影响(10×10)。图8为加入1μM对胰腺星状细胞有选择性的抑制剂后对3D共培养结构的影响(10×10)。

具体实施方式

实施例1

1.材料

人胰腺癌细胞系Capan-1：

人原代胰腺星状细胞：源自复旦大学附属中山医院分离的胰腺癌标本。

DMEM培养基：购自美国Thermo公司，

DMEM/F12培养基：购自美国Hyclone公司，

10％胎牛血清：购自美国Gibco公司，

胰酶：

PBS：磷酸盐缓冲液(1×)，0.0067M(PO4)

甲基纤维素：购自美国Sigma公司，

未组织处理的96孔圆底板：购自美国Thermo公司，

GFP：

RFP：

链霉素-青霉素溶液：购自美国Thermo公司。

2.方法

(一)原代胰腺星状细胞的培养

快速将从医院获得的胰腺癌组织置于10厘米培养皿内，用高压蒸汽灭菌的手术器械切割成小块，加入含10％胎牛血清，100U的青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12培养基置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。三天后，胰腺星状细胞从组织块中长出。七天后，移去组织块。当胰腺星状细胞长满培养皿后，进行胰酶消化传代。胰腺星状细胞的鉴定是通过形态学以及胰腺星状细胞活化标志物α-SMA免疫荧光染色鉴定。

(二)胰腺癌细胞系Capan-1的培养

Capan-1细胞系用含10％胎牛血清的DMEM培养基置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

(三)3D细胞培养液的制备

3D细胞培养液储存液的制备：将6克的甲基纤维素粉末置于500毫升锥形瓶内，放入磁力搅拌子，进行高压蒸汽灭菌。灭菌完成后，加入500毫升含有10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基，60℃搅拌30分钟。将搅拌后的溶液在4℃下静置过夜，通过离心(5000g，2小时，室温)得到上层清液。上层清液即为3D细胞培养液储存液。

3D细胞培养液为制备3D细胞时配置，由20％的3D细胞培养液储存液和80％的含有10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基充分混匀得到。甲基纤维素最终的浓度为0.24％。

(四)制备表达荧光蛋白的胰腺癌细胞和胰腺星状细胞

表达GFP和RFP的质粒由姜立智老师提供。1×10⁷个293T细胞用含10％FBS的DMEM培养基种于10厘米培养皿。第二天，取1.5ml灭菌EP管，加入6μg表达GFP或者RFP的质粒，4μgPSPA质粒以及2μgPMD2G质粒，轻柔混匀，室温孵育5min。取1.5ml灭菌EP管，取36μLOPti-MEM。轻柔混匀，室温孵育5min。将上述两者轻柔混匀，室温孵育20min。将混合物加入293T细胞内。6小时后移去培养基，加入新培养液。转染后48-72h收获含病毒的上清。3000rpm离心20min，去除沉淀。病毒上清-80℃贮存。

慢病毒转染前18小时，将胰腺癌细胞或者胰腺星状细胞以1×10^5/孔铺到6孔板中，使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。第二天，加入2毫升适量病毒悬液和2毫升相应的培养基。继续培养24小时，换新鲜的培养基。转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。

(五)3D细胞培养模型的缺氧微环境检测

使用Qian发现的一种基于硝基还原酶的检测细胞内低氧状态的化合物探针NBP对3D细胞培养模型内的缺氧微环境进行检测。将常规2D培养的Capan-1细胞和3D细胞培养的Capan-1细胞加入1μMNBP，孵育2小时，随后使用绿色荧光激发观测。激发得到的红色荧光的强弱代表着细胞内缺氧程度的大小。

(六)一种肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞构成的3D共培养模型的构建

将对数生长期的转染GFP的胰腺癌细胞以及转染RFP的胰腺星状细胞吸去培养基，用PBS洗一遍，加入0.25％胰酶消化，室温2分钟后观察细胞形态变化，当观察到细胞间隙变大时，加入含有10％胎牛血清的培养基终止消化作用，离心(1000rpm，5分钟，室温)，吹打重悬细胞。将含有1250个Capan-1细胞和1250个胰腺星状细胞的100μL3D细胞培养基加入未组织处理的96孔圆底板。三天后形成致密的球状体之后进行荧光检测。

(七)不同选择性的药物对3D共培养模型的影响

通过常规二维细胞培养下的药物筛选得到的一种对肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞均有增殖抑制效果的药物、一种选择性抑制肿瘤细胞的药物以及一种选择性抑制肿瘤相关成纤维细胞的药物。

在两种细胞共培养的3D模型内，加入了选择性的药物。

由于被抑制的细胞的荧光会相应地减弱，所以通过观测绿色荧光和红色荧光的比例可以非常直观地检验药物的选择性。

3.结果

(一)原代胰腺星状细胞的分离

如图1所示，原代胰腺星状细胞呈现出梭形或星形形态，图2所示胰腺星状细胞活化标志物α-SMA染色。

(二)3D细胞培养下的低氧环境

如图3所示，常规二维细胞培养条件下的胰腺癌细胞系Capan-1细胞不存在低氧环境，而3D细胞培养条件的胰腺癌细胞系Capan-1细胞存在低氧环境。

(三)Capan-1细胞和胰腺星状细胞的病毒侵染效率

如图4所示，两种细胞均拥有较高的病毒侵染效率。

(四)肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞构成的3D共培养模型的形态学鉴定

如图5所示，明场下为两种细胞共培养时的3D形态结构，绿色荧光为Capan-1细胞，红色荧光为胰腺星状细胞。两种细胞紧密贴合，构成致密的微环境。

(五)选择性药物的3D共培养模型鉴定

如图6所示，为加入1μM对两种细胞均有抑制作用的抑制剂后对3D共培养结构的影响，绿色和红色的组分均有较大程度的降低，表明了胰腺癌细胞和胰腺星状系胞均对这种化合物敏感；

如图7所示，为加入6μM对胰腺癌细胞Capan-1有选择性的抑制剂后对3D共培养结构的影响；绿色的组分明显降低，而红色的组分受影响较小，表明了胰腺癌细胞对这种化合物敏感，而胰腺星状细胞对这种化合物不敏感；

如图8所示，为加入1μM对胰腺星状细胞有选择性的抑制剂后对3D共培养结构的影响。红色的组分明显降低，而绿色的组分受影响较小，表明了胰腺星状细胞对这种化合物敏感，而胰腺癌细胞对这种化合物不敏感。

Claims

1.一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3D共培养模型，其特征在于，基于甲基纤维素的3D细胞共培养方法，采用3D细胞培养基的成分为含有10％的胎牛血清，0.24％的甲基纤维素的DMEM/F12培养基，将细胞消化后，含有2500个细胞的100μL3D细胞培养基加入未经过组织处理的96孔圆底板，细胞即刻开始自发聚集，三天后形成致密的球状立体结构。

2.按权利要求1所述的基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3D共培养模型，其特征在于，所述的3D细胞培养基的成分为含有10％的胎牛血清，0.24％的甲基纤维素的DMEM/F12培养基。

3.按权利要求1所述的基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3D共培养模型，其特征在于，所述的将细胞消化后，含有2500个细胞的100μL3D细胞培养基加入未经过组织处理的96孔圆底板。

4.基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3D共培养模型的构建方法，其特征在于，其包括，将人胰腺癌细胞系Capan-1用含10％胎牛血清的DMEM培养基置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；人原代胰腺星状细胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；将Capan-1细胞系用绿色荧光蛋白GFP病毒侵染标记，将胰腺星状细胞用红色荧光蛋白RFP标记，分别检测两种细胞的侵染效率；取对数生长期的细胞，将含有1250个Capan-1细胞和1250个胰腺星状细胞的100μL3D细胞培养基加入未组织处理的96孔圆底板；后续进行缺氧微环境的检测，两种细胞共培养的荧光状态。

5.按权利要求4所述的的构建方法，其特征在于，将筛选的一种对肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞均有增殖抑制效果的药物，以及一种选择性抑制肿瘤细胞的药物以及一种选择性抑制肿瘤相关成纤维细胞的药物，将其加入3D共培养体系内，应用于药物研究。